Dosage de l'activité des protéines kinase avec ATP radiomarqué

L’objectif global de ce test est de mesurer l’activité enzymatique des protéines kinases. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation des kinases, telles que l’activité d’une kinase ou d’un mutant de kinase, sa spécificité et si son activité est sensible à différents traitements cellulaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est à la fois polyvalente et quantitative.

Steve Stippec, chercheur au laboratoire Cobb qui a une grande expérience de ce test, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, ajoutez deux microlitres d’anticorps d’un milligramme par millilitre à 200 microlitres de lysats cellulaires et incubez à quatre degrés Celsius pendant une heure en vous balançant. Lavez les billes de protéine A-Sepharose deux à trois fois en ajoutant un tampon de lyse, puis touchez-les en essorant à quatre degrés Celsius pendant 30 secondes à une minute à 5000 fois g, puis retirez le surnageant avec une pipette et remettez les billes en suspension dans le tampon.

Ensuite, ajoutez 30 microlitres de 50 % de boue de protéines A-Sepharose et un tampon de lyse aux lysats. Incuber les lysats à quatre degrés Celsius pendant une heure pendant le balancement. Appuyez sur la rotation à quatre degrés Celsius pour granuler les perles et retirer le surnageant.

Lavez les perles trois fois avec un millilitre de tampon de lavage des billes, suivi d’un essorage tactile, puis lavez les perles une fois avec un tampon de réaction de kinase X. Après l’essorage tactile, retirez autant de tampon que possible sans retirer les billes. Pour initialiser le test, ajoutez l’intégralité du mélange réactionnel à l’échantillon de kinase.

Incuber la réaction à 30 degrés Celsius pendant cinq minutes à une heure selon l’activité de la kinase dosée. Arrêtez la réaction en le plaçant sur de la glace et en ajoutant 7,5 microlitres de cinq tampons d’échantillon X Laemmli, puis chauffez la réaction à 100 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes dans le bloc chauffant. Après avoir fait tourner l’échantillon par effleurement, chargez 20 microlitres par puits sur un gel SDS-PAGE de 10 à 15 %.

Assurez-vous de garder l’appareil de gel blindé pour limiter l’exposition au phosphore 32, car il s’agit d’un émetteur bêta à haute énergie. Faites couler le gel suffisamment longtemps pour séparer la kinase et le substrat. Après l’écoulage, retirez le gel des plaques de verre et d’aluminium, puis placez le gel dans 50 millilitres de colorant Coomassie pendant une heure sur un agitateur orbital réglé à 50 tr/min.

Pour cette étape, utilisez un récipient légèrement plus grand que le gel lui-même. Pour décolorer le gel, déplacez-le de la tache à la solution de fixation. Placez des morceaux de mousse ou des lingettes de laboratoire nouées dans le récipient avec le gel pour absorber le colorant Coomassie.

Versez le gel dans 600 à 700 millilitres de solution de fixation pendant la nuit sur un agitateur orbital à 50 tr/min. Le lendemain, retirez le gel de la solution de fixation et faites-le tremper dans 200 millilitres de méthanol pendant une à deux minutes en l’agitant doucement jusqu’à ce que le gel devienne blanc laiteux. Cela aidera à prévenir les fissures pendant l’étape de séchage.

Ensuite, mouillez un morceau de papier filtre qualitatif d’environ 14 centimètres sur 14 centimètres avec du méthanol et placez-le sur un séchoir sous vide à gel en dalle. Posez le gel sur le papier filtre, face avant vers le haut. Couvrez soigneusement le gel d’une pellicule plastique, puis allumez et faites fonctionner le sèche-linge et appliquez l’aspirateur.

Une fois que le vide a été atteint après seulement quelques secondes, déroulez les bulles d’air avec un brasier en caoutchouc souple. Continuez la course pendant 90 minutes. Retirez le gel séché et fixez un marqueur autorad, tel qu’une règle ou un point phosphorescent, sur le papier filtre sur le côté du gel et placez-le dans une cassette contenant un tamis intensifiant.

Utilisez un compteur Geiger pour vérifier l’intensité du signal. Pour les signaux plus faibles, une exposition à moins 70 degrés Celsius à moins 80 degrés Celsius avec un écran intensifiant augmentera la densité de la bande de film. Dans une chambre noire, placez un morceau de film sur le gel séché à l’intérieur de la cassette de film contenant un écran intensifiant.

Si le nombre de CPM est de 100 ou moins, essayez une exposition de nuit à moins 70 à 80 degrés Celsius. Sinon, si le compte est plus proche de 10 000, commencez par une exposition d’une heure et optimisez à partir de là. À la fin de l’exposition, retirez le film avant de le développer dans un processeur de film médical ou à rayons X.

Marquez les bandes correspondant aux étalons protéiques sur le film. De plus, étiquetez les étalons de protéines et les voies de réaction pour référence future. Excisez les bandes du gel qui correspondent aux bandes d’intérêt sur le film.

Placez les bandes dans des flacons à scintillation de sept millilitres et ajoutez quatre millilitres de liquide à scintillation. Comptez les bandes à l’aide d’un compteur à scintillation liquide. Vérifiez que le compteur est réglé pour surveiller la fenêtre de spectre d’énergie correcte pour le phosphore 32.

Procédez à l’analyse des résultats comme décrit dans le protocole texte. Des fractions purifiées d’ERK2 ont été utilisées dans un test de kinase avec MBP en présence ou en absence de MEK1R4F, un stimulateur constitutivement actif de l’activité de la kinase ERK2. Dans une expérience similaire, un test de kinase MBP a été utilisé pour mesurer l’activité des mutants recombinants ERK2 purifiés à partir de cultures bactériennes par rapport à des protéines de type sauvage.

Bien que ERK2 ait été capable de phosphoryler MBP lorsqu’il est stimulé par MEK1R4F, l’activité de la kinase ERK2 est considérablement abrogée par la mutation de la lysine catalytique ou d’une thréonine à proximité des sites canoniques de double phosphorylation. ERK2 T188D et ERK2 T188E présentent une activité kinase marginale envers un petit peptide flexible. Cependant, ils sont incapables de phosphoryler de manière robuste les substrats connus d’ERK2, Nup153 et PDX1, comme on l’a vu avec ERK2 de type sauvage.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en un à deux jours si elle est bien exécutée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser l’ATP radiomarqué pour doser l’activité des protéines kinases afin de mieux comprendre les réseaux de signalisation dans lesquels elles résident. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’optimiser le protocole de précipitation des acides aminés pour extraire les kinases d’intérêt afin de tenir compte de quantités égales de protéines et de mesurer les concentrations de protéines recombinantes pour assurer des comparaisons précises de l’activité des kinases.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la signalisation cellulaire pour explorer des voies de transduction spécifiques et leurs rôles dans la régulation homéostatique ainsi que leurs contributions à la progression de la maladie. N’oubliez pas que travailler avec des matières radioactives peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port d’un équipement de protection individuelle, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.