Name: poisson zèbre In Situ Préparation à la moelle épinière électrophysiologiques Les enregistrements de la colonne vertébrale et sensorielle motoneurones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Apprenez l'enregistrement électrophysiologique des neurones spinaux in situ chez les embryons et larves de poisson zèbre. Cette méthode permet d'étudier l'excitabilité électrique des neurones pendant le développement.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (F32 NS059120 à RLM et R01NS25217 et P30NS048154 à ABR).

Les auteurs déclarent une absence d&#39;intérêts financiers en compétition.

Les méthodes décrites ici permettent la caractérisation électrique et morphologique des neurones sensoriels et moteurs d&#39;embryons de poisson zèbre après dissection minimale de la moelle épinière. Neurones restent en bonne santé pendant au moins 1 h, la limite de temps imposée à ces enregistrements. Neurones ont été enregistrées en utilisant la configuration standard de cellules entières, ainsi que des patches nucléées; ce dernier procédé minimise les problèmes d&#39;espace-clamp qui peut empêcher une étude biophysiq...

<html> George Streisinger pionnier dans l&#39;utilisation de Danio rerio, communément appelé poisson zèbre, en tant que système modèle pour l&#39;analyse génétique du développement des vertébrés 10. Le modèle offre plusieurs avantages, notamment: (1) l&#39;élevage relativement simple et peu coûteux; (2) la fertilisation externe, ce qui permet un accès facile aux embryons dès les premiers stades de développement; et (3) un embryon transparent, ce qui permet des observations directes et répétées de cellules, de tissus et d&#39;organes tels qu&#39;ils forment. Au cours des décennies qui ont suivi, plusieurs avancées ont augmenté encore la puissance du modèle de poisson zèbre. En particulier, les écrans génétiques avant et les efforts de séquençage du génome entier ont joué un rôle clé dans l&#39;identification des mutations et des gènes essentiels à de nombreux processus de développement 11, 12, 13, 14,« &gt; 15, 16. Les méthodes de clonage de passerelle ont permis à l&#39;application routine de transgénique approches 17, 18. Les progrès récents dans la modification du génome, illustré par activateur de transcription (TALENs) et en grappes courtes répétitions palindromiques régulièrement espacées (CRISPR) -Cas9 des nucleases, permettre l&#39;introduction ciblée de mutations, ainsi que knock-out et knock-in approche 19, 20, 21, 22. Ensemble, ces méthodes font zebrafish un modèle puissant pour l&#39;étude des mécanismes génétiques sous - jacents des comportements spécifiques et plusieurs maladies humaines 23, 24, 25, 26, 27. Ce travail se concentre sur développerla réglementation mentale et le rôle de l&#39;activité électrique dans le développement des neurones. L&#39;accent est mis sur la moelle épinière, pour laquelle le modèle de poisson zèbre offre plusieurs avantages. Tout d&#39;abord, il est relativement facile d&#39;accès à des stades zebrafish embryonnaire et larvaire; Par conséquent, on peut étudier la fonction de la moelle épinière au cours des stades de développement qui ont moins de neurones et les circuits plus simples 28, 29. En outre, la moelle épinière poisson - zèbre comporte un ensemble diversifié de neurones, similaire à d&#39; autres vertébrés, comme démontré par des motifs caractéristiques et distinctifs de facteurs de transcription 30, 31, 32, 33, 34, 35. La majorité des études chez le poisson zèbre qui visent à découvrir les mécanismes qui sous-tendent la fonction des circuits de la moelle épinière, en particulierceux qui prennent en charge la locomotion, sont naturellement porté sur les stades larvaires 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Cependant, la plupart des neurones qui forment les réseaux de locomotive de la colonne vertébrale à leur différenciation initier les premiers stades embryonnaires, ~ 9-10 h après la fécondation (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. Compte tenu de cela, la compréhension de la façon dont les propriétés morphologiques et électriques des neurones de la colonne vertébrale se posent et le changement entre les stades embryonnaire et larvaire est important pour un Overacompréhension ll de la formation du circuit locomoteur et la fonction. Les méthodes de dissection décrites ici permettent des enregistrements de patch-clamp de neurones de la colonne vertébrale et ont été appliquées avec succès à des stades embryonnaires (~ 17-48 HPF) et stades larvaires (~ 3-7 jours après fécondation [dpf]). Cette approche limite la quantité de dissection nécessaire pour permettre l&#39;accès aux neurones d&#39;intérêt. Le protocole diffère de la plupart des autres procédés publiés pour l&#39;enregistrement à partir de neurones spinaux zebrafish en ce que la colle de suture vétérinaire est utilisé, au lieu d&#39;une amende broche de tungstène, pour fixer l&#39;embryon ou une larve de la chambre d&#39;enregistrement. La disponibilité de deux approches différentes ( par exemple, la colle de suture par rapport à la broche de tungstène) pour le montage des embryons de poisson zèbre ou larves pour l&#39; analyse électrophysiologique offre aux chercheurs des options alternatives pour atteindre leurs objectifs expérimentaux spécifiques. Tout d&#39;abord, les procédures d&#39;accès et l&#39;enregistrement à partir d&#39;un pop<html> ulation des neurones sensoriels primaires, des cellules Rohon-Barbe, sont décrits. Les corps cellulaires de ces neurones se situent dans la moelle épinière dorsale. Cellules Rohon-Barbe existent dans de nombreuses espèces de vertébrés, se différencient au début du développement, et sous - tendent la réponse tactile embryonnaire 6, 44, 47, 48. En second lieu, les procédures d&#39;accès et d&#39;enregistrement des neurones moteurs spinaux sont détaillés. motoneurones spinaux Zebrafish surviennent pendant deux vagues de la neurogenèse. Les neurones moteurs primaires plus tôt nés surviennent à la fin de la gastrulation (~ 9-16 HPF), avec seulement 3-4 neurones moteurs primaire présents par hemisegment 45, 46, 49. En revanche, la population née plus tard des neurones moteurs secondaires sont plus nombreux et se pose au cours d&#39;une période prolongée, à partir de ~ 14 HPFef &quot;&gt; 45, 50. genèse du neurone moteur secondaire dans des segments à mi-tronc est en grande partie rempli par 51 HPF 50. neurones moteurs secondaires sont considérés comme étant l&#39;équivalent des neurones moteurs dans amniotes 46. Il est intéressant de neurones supraspinales, via la dopamine, régulent la locomotion dans la larve et la genèse du neurone moteur secondaire dans l&#39;embryon et le jeune larve 50, 51. moteur primaire et secondaire neurones comprennent chacun plusieurs sous - types différents. chaque projets de sous - types de neurones moteurs primaires un axone périphérique qui innerve un groupe musculaire caractéristique, résultant en un stéréotype, l&#39;identification trajectoire axonale. en général, les neurones moteurs secondaires suivent les voies axonales précédemment établies par les neurones moteurs primaires. Ainsi, en ce qui concerne les trajectoires des axones, les neurones moteurs primaires et secondaires sont similaires, à l&#39;exception que l&#39;épaisseur et la taille des axones somata unre plus grande pour les neurones moteurs primaires 45. En troisième lieu, les méthodes pour l&#39;enregistrement de quelques types d&#39;interneurones sont discutés. Cependant, dans ces cas, une quantité limitée d&#39;élimination des autres cellules de la moelle épinière est nécessaire, et donc de la moelle épinière est moins intact que pour des enregistrements à partir de cellules Rohon-Barbe ou neurones moteurs.

<table><tbody><tr><td>Filtre à vide/Bouteille de stockage, pores de 0,22 mm, Corning</td><td></td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue, 0,2 mm</td><td>, Whatman</td><td>6780-2502</td><td></td></tr>, <tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td>, <td>Ethyl 3-aminobenzoate, méthanesulfonate, sel&nbsp ;</td></tr><tr><td>&alpha ;-bugarotoxine</td><td>Tocris</td><td>11032-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Tétrodotoxine</td><td>Tocris</td><td>4368-28-9</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-549 sel d’hydrazine</td><td>Sondes moléculaires</td><td>A-10438</td><td>colorant fluorescent</td></tr><tr><td>Spin-X filtre à tube</td> centrifuge <td>Corning</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>Lame de microscope en verre</td><td>Fisher</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard silicone kit élastomère</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>élastomère de silicone</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0038</td><td>diamètres intérieur et extérieur de 0,78 et 1,0 mm (capillaires en verre à paroi mince)</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000-100</td><td>diamètres intérieur et extérieur de 1,13 et 1,55 mm (capillaires en verre à paroi épaisse)</td></tr><tr><td>Raccord miniature en polypropylène barbelé&nbsp ;</td><td>Cole-Palmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif tissulaire Vetbond&nbsp ;</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur</td> de microélectrodes Sutter Instruments Collagenase XI <td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> Modèle P-97&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur</td><td>Dispositifs Moléculaires</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr>Étage<td>de tête</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur motorisé&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Tube Tygon</td><td>Fisher</td><td>14-169-1B</td><td>ID 1/16 PO, OD 1/8 IN et PAROI 1/32 IN (tube de laboratoire flexible)</td></tr><tr><td>Porte-électrode</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>1-HC-U</td><td></td></tr><tr><td>Pharmaseal Robinets d’arrêt à trois voies&nbsp ;</td><td>Baxter</td><td>K75</td><td></td></tr><tr><td>Numériseur</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé&nbsp ;</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 FS plus</td><td></td></tr><tr><td>40X/0.80W Achroplan objectif</td><td>Logiciel d’acquisition et d’analyse de</td><td></td><td></td>données Zeiss</tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>PClamp 10 - Clampex et Clampfit&nbsp ;</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>Sutter Instruments</td><td>Modèle P-97</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td colspan="4">Solutions de dissection et d’enregistrement (en mM)</td></tr><tr><td>Toutes les solutions, à l’exception de l’intracellulaire, sont stables pendant ~2-3 mois lorsqu’elles sont filtrées (coupelles filtrantes de 0,22 mm) et stockées à température ambiante (RT).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>La solution intracellulaire est filtrée (filtres à seringue de 0,2 mm) et stockée congelée (-20 &deg ; C) en petites aliquotes qui sont décongelées individuellement le jour de l’utilisation.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection/Sonnerie' s solution</td><td></td><td></td><td>145 NaCl, 3 KCl, 1,8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES ; pH 7,4 (avec NaOH)</td></tr><tr>Solution <td></td><td></td><td>d’enregistrement par pipette (intracellulaire)</td><td>135 KCl, 10 EGTA-acide, 10 HEPES ; pH 7,4 (avec KOH).</td></tr><tr><td>Bain (extracellulaire) solution d’enregistrement/tension et ampère-clamp</td><td></td><td></td><td>125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES ; pH 7,4 (avec NaOH).</td></tr><tr><td>Alexa-594 solution mère de sel d’hydrazine.&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Préparer un stock de 13,2 mM en ddH2O, aliquote (~100 &micro ; l) et se conserve à -20 °C. Pour l’utilisation, diluer la matière dissoute 132 fois avec une solution à la pipette jusqu’à une concentration finale de 100 mM. Après dilution, filtrez la solution de pipette contenant l’Alexa-594. avec un filtre à tube de centrifugation.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Agents immobilisants</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td><td></td><td></td><td>Préparer une solution mère à 0,4 % dans 0,2 M Tris, pH 9 (0,4 g de Tricaïne/100 mL 0,2 M Tris</td></tr><tr><td colspan="4">Ajustez le pH à 7 avec du NaOH et stockez-le à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Pour utilisation, diluer la solution mère ~25 fois dans un milieu embryonnaire</td></tr><tr><td>250 mM &alpha ;-bungarotoxine</td><td></td><td></td><td>Préparer un stock de 250 mM dans ddH2O (1 mg/500 mL), préparer 100 & micro ; L aliquotes, et sotre à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Pour utilisation, diluer 2 500 fois avec une solution extracellulaire jusqu’à une concentration finale de 100 nM.</td></tr><tr><td>1 mM de tétrodotoxine</td><td></td><td></td><td>Préparez un stock de 1 mM dans ddH2O (1 mg/3 mL), préparez 100 & micro ; L aliquotes, et sotre à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Pour utilisation, diluer 2 000 fois avec une solution extracellulaire jusqu’à une concentration finale de 500 nM.</td></tr></tbody></table>

poisson zèbre<em&gt; in situ</em&gt; préparation à la moelle épinière électrophysiologiques les enregistrements de la colonne vertébrale et sensorielle motoneurones

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Le poisson zèbre, d&#39;abord présenté comme un modèle de développement, ont gagné en popularité dans de nombreux autres domaines. La facilité d&#39;élevage un grand nombre d&#39;organismes en développement rapide, combinée à la clarté optique embryonnaire, a servi de premiers attributs convaincants de ce modèle. Au cours des deux dernières décennies, le succès de ce modèle a été propulsé par son plus amenability aux écrans de mutagenèse à grande échelle et par la facilité de transgénèse. Plus récemment, les approches d&#39;édition génétique ont étendu la puissance du modèle. Pour les études neurodéveloppementaux, l&#39;embryon de poisson zèbre et larve fournissent un modèle auquel plusieurs méthodes peuvent être appliquées. Ici, nous nous concentrons sur les méthodes qui permettent l&#39;étude d&#39;une propriété essentielle des neurones, excitabilité électrique. Notre préparation pour l&#39;étude électrophysiologique des neurones spinaux de poisson zèbre implique l&#39;utilisation de colle de suture vétérinaire pour garantir la préparation à une chambre d&#39;enregistrement. Des méthodes alternatives pour l&#39;enregistrementà partir d&#39; embryons de poisson zèbre et les larves impliquent la fixation de la préparation à la chambre à l&#39; aide d&#39; une amende broche de tungstène 1, 2, 3, 4, 5. Une broche de tungstène est le plus souvent utilisé pour monter la préparation dans une orientation latérale, même si elle a été utilisée pour monter des larves face dorsale jusqu&#39;à 4. La colle de suture a été utilisé pour monter des embryons et des larves dans les deux orientations. Utilisation de la colle, une dissection minimale peut être effectuée, ce qui permet l&#39;accès aux neurones spinaux sans l&#39;utilisation d&#39;un traitement enzymatique, ce qui évite tout dommage résultant. Cependant, pour les larves, il est nécessaire d&#39;appliquer un bref traitement enzymatique pour enlever le tissu musculaire entourant la moelle épinière. Les méthodes décrites ici ont été utilisées pour étudier les propriétés électriques intrinsèques des neurones moteurs, interneurones et les neurones sensoriels à plusieurs developmentÃl étapes 6, 7, 8, 9.

Nous avons réussi à enregistrer des neurones Rohon-Barbe dans 17 HPF embryons à 7 dpf larves (figure 5A et 5B). Lorsque les cellules Rohon-Barbe ont été enregistrées, la préparation a été monté en place du côté dorsal. Un tel montage permet d&#39;identifier sans ambiguïté des cellules Rohon-Barbe en fonction de leurs positions dorsales superficielles et grandes tailles soma. L&#39;identification est en outre confirmé par le potentiel membranaire de repos...

Ce manuscrit décrit les méthodes pour les enregistrements électrophysiologiques de neurones spinaux des embryons de poisson zèbre et les larves. La préparation maintient les neurones in situ et implique souvent la dissection minimum. Ces méthodes permettent l&#39;étude électrophysiologique d&#39;une variété de neurones de la colonne vertébrale, de l&#39;acquisition de l&#39;excitabilité électrique initiale dans les premiers stades larvaires.

poisson zèbre<em&gt; In Situ</em&gt; Préparation à la moelle épinière électrophysiologiques Les enregistrements de la colonne vertébrale et sensorielle motoneurones

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

L'objectif général de cette préparation est de permettre l'étude électrophysiologique des neurones de la moelle épinière du poisson zèbre in situ aux stades embryonnaire et larvaire. Les analyses électrophysiologiques complètent les approches génétiques et d'imagerie puissantes qui sont également possibles avec le modèle du poisson zèbre. Bien que la méthode ait été initialement développée pour étudier les neurones de Rohon-Beard, nous avons facilement adapté cette approche au fil du temps et nous pouvons désormais étudier divers types de neurones médullaires.Le Dr. Rosa Moreno, chercheuse associée, avec qui j'ai eu le plaisir de collaborer pendant de nombreuses années, démontrera la procédure. Pour commencer cette procédure, retirez l'ampoule noire d'un embout en verre et remplacez-la par un embout en caoutchouc blanc provenant d'un autre embout en verre. Ensuite, coupez un morceau de tube souple à une longueur d'environ 38 centimètres.Ensuite, fixez le tube souple à l’aide d’un petit raccord droit en polypropylène. Pour préparer l’élastomère de silicone, ajoutez la base et l’agent de réticulation dans un tube conique en plastique selon un rapport de quatre à un. Mélangez ensuite

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