Name: In Vitro et In Vivo l’évaluation d’activité Suppressive T, B et les cellules myéloïdes et des réponses humorales de receveurs de transplantation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: Découvrez un protocole d'évaluation in vitro et in vivo de la capacité suppressive des cellules régulatrices T, B et myéloïdes dans un modèle de transplantation cardiaque chez le rat.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été réalisé dans le cadre du projet Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) qui fait partie du programme « Investissements d’avenir » Gouvernement Français géré par l’ANR (ANR-11-LABX-0016-01) et le projet IHU-Cesti, financé également par la » Investissements d’avenir » programme de gouvernement Français, géré par l’Agence Français de la recherche nationale (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Le projet IHU-Cesti est également pris en charge par Nantes Métropole et la Région Pays de la Loire.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Transfert adoptif de splénocytes totales dans un receveur nouvellement greffé est un moyen efficace pour détecter la présence de cellules régulatrices induites ou potentialisée par un traitement. Hôte induite par l’irradiation transitoire lymphopénie favorise la survie des cellules après le transfert et la mise en place de la tolérance. En outre, irradiation sublétale laisse de temps pour les cellules avec propriétés tolérogène pour convertir les nouvelles cellules réglementaires au cours de la reconstitution immunitaire...

Allogreffe cardiaque chez le rat est un modèle de greffe organe fiable pour évaluer les traitements d’induction de la tolérance, pour décrypter les mécanismes d’induction de la tolérance et de la maintenance et est susceptible d’induire des cellules régulatrices fonctionnellement compétents et dominantes. Les protocoles ci-dessous décrivent une entièrement incompatibilité transplantation cardiaque greffe d’un rat de donneur de 1W de Lewis (LEW.1W, RT1u) en rat destinataire 1 a Lewis (LEW.1A, RT1un). Dans cette combinaison de greffe, le rejet aigu se produit rapidement (dans environ 7 jours) et peut être facilement évaluée par greffon battant mesure par palpation de l’abdomen. Ici, nous vous proposons trois protocoles pour induire une tolérance à l’allogreffe cardiaque chez le rat. Dans ces modèles, tolérance est induite et/ou maintenue par types de différentes cellules réglementaires. Tout d’abord, le blocage des interactions CD40-CD40L avec un adénovirus encodage CD40Ig (AdCD40Ig) induit par la génération de CD8+ Tregs capables d’induire la tolérance lorsque Moutschen transféré à destinataires greffées1. En outre, l’appauvrissement des CD8+ cellules (avec des anticorps anti-CD8α) destinataires traités AdCD40Ig générés Bregs et RegMCs2. Une analyse approfondie des CD8+ Tregs propriétés a mis en évidence le rôle essentiel de plusieurs molécules immunorégulatrices défini comme interleukin-34 (IL-34) et Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Tandis que la surexpression de IL-34 (avec un vecteur d’AAV) induite Tregs grâce à la génération de RegMCs, la surexpression de la FGL-2 induit Bregs, qui sous-tend le réseau complexe de cellules régulatrices.
Parce que le rejet chronique se développe lentement et est à long terme, une analyse approfondie est nécessaire pour distinguer la tolérance par rapport à un rejet chronique. Greffon est habituellement évaluée pour l’infiltration cellulaire, fibrose, épaississement des dépôts C4d vasculaire à mur et complément par immunohistologie7. Alors que l’histologie méthodes exigent des sacrifices d’animaux ou de greffe biopsie, nous décrivons ici une méthode simple pour évaluer les différentes caractéristiques des greffes allogéniques tolérés : l’émergence et la fonction des cellules régulatrices et les réponses d’anticorps spécifiques anti-donneur de sang échantillon par cytométrie en flux (ici, nous avons utilisé cellule activée par fluorescence (FACS) de tri).
Maintien de la tolérance à l’allogreffe après arrêt du traitement est généralement associée à l’induction de cellules régulatrices8. Au cours des dernières décennies, les études concentrent CD4+Tregs caractérisée à l’unanimité eux par les marqueurs clés Foxp3+, CD25hauteet CD127–9,10,11. De même, plusieurs marqueurs ont été attribuées aux CD8+ Tregs, comme CD122+et CD28-, CD45RCfaible, PD1+et Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. pendant les années, l’expression de GITR CTLA4 et cytokines (IL-10, TGFβ, IL-34, IL-35, GFL-2) ont été en outre associée à un Treg profil3,4,6,13, 18,19,20,21. Cependant, les populations de lymphocytes régulateurs émergents, tels que Bregs, RegMCs ou NKTregs, n’ont pas des marqueurs spécifiques pertinentes. En effet, les Bregs sont surtout signalés comme immatures CD24+ cellules, avec expression CD27 ambiguë et, parfois, la production d’IL-10, TGFβ ou granzyme B22,23,24. La complexité de la lignée cellulaire myéloïde exige une combinaison de plusieurs marqueurs de définir leur profil réglementaire ou proinflammatoires comme CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a ou CD16325,26. Enfin, certains marqueurs ont été signalés à identifier NKTregs comme CD11b+, CD27+, TGFβ+, mais autres études sont nécessaires pour plus loin phénotypiquement Décrivez-les27,28,29 ,30,31,32. Ainsi, les preuves d’activité suppressive sont tenus de légitimer davantage description phénotypique pour l’identification de nouveaux biomarqueurs, nouveau immunorégulatrices médiateurs et d’étendre la portée aux nouvelles thérapies cellulaires.
Nous vous proposons deux méthodes complémentaires afin d’évaluer l’activité suppressive des cellules. Tout d’abord, la méthode in vitro consistant en cultivant des cellules suppressives avec des cellules effectrices marqués T stimulés par les donneurs allogéniques cellules présentatrices (TTB) à différentes proportions pendant 6 jours, et analyser l’effecteur T la prolifération de cellules qui reflète l’immunodépression axée sur les donateurs. Cellules provenant de rats traités peuvent être comparés directement aux cellules de rats naïfs et non greffées chez les rats traités pour activité suppressive (ou à toute autre population de lymphocytes régulateurs), dans une gamme de rapports de suppresseur : effecteur. En outre, cette méthode ne requiert pas une transplantation, et on obtient des résultats dans les 6 jours. Deuxièmement, la méthode in vivo consiste à transférer les cellules réglementaires prévues d’un rat traité à un destinataire greffé récemment irradié. Bien que les cellules B des cellules, cellules myéloïdes ou T de rats naïfs non traités sont généralement incapables d’inhiber le rejet aigu et pour prolonger la survie du greffon à transfert adoptif, cellules avec activité suppressive potentialisée des traités-bénéficiaires ont ces attributs 1,2,3,4,33. Lymphopénie induite par l’irradiation du destinataire est recommandée de laisser des cellules Moutschen transférés sont pas affectés par l’homéostasie du sang et de maîtriser plus facilement la réponse immunitaire anti-donateur. Pour les deux méthodes, l’utilisation in vitro d’allogéniques tiers TTB ou en vivo transfert adoptif de suppressive cellules destinataires greffés avec un coeur de tiers permettent l’analyse de la spécificité anti-donateur. Considérant que la méthode en vivo nécessite un nombre important de cellules, mal représenté sous-populations de cellules peuvent être évaluées plus facilement pour l’activité suppressive en vitro33.
Humorale peut également être mesurée afin d’évaluer l’état de la tolérance et le contrôle de la production d’anticorps dirigés aux antigènes du donneur. En effet, la tolérance peut être caractérisée par l’absence de réponse humorale envers le donateur mais la conservation de la capacité pour les destinataires à développer une réponse humorale aux antigènes nouveaux et la préservation des réponses de la mémoire. Tout d’abord, le principe de la détection des alloanticorps repose sur la reconnaissance des cellules donneur par destinataires anticorps après incubation du type de cellules du donneur avec le sérum d’un bénéficiaire greffé. Deuxièmement, humorales réponses adressées à des antigènes exogènes peuvent être mises en recouvrement après la stimulation des receveurs tolérants à long terme avec Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) émulsionné avec adjuvant complet de Freund. La présence d’anticorps IgM et IgG spécifiques contre les antigènes peut être détectée 4 à 13 jours, respectivement, après vaccination, par l’Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)34. En troisième lieu, la préservation des réponses de la mémoire immunitaire peut être évaluée par l’injection de xénogéniques des globules rouges (hématies) -7 et + 3 jours de transplantation et de globules rouges de coloration avec le destinataire sérum prélevé à jours + 8 et + 17 suite à une transplantation. Toutes ces méthodes permettent l’identification des sous-types de l’immunoglobuline en utilisant des anticorps secondaires spécifiques et l’acquisition rapide des résultats en moins de 1,5 h par coloration de FACS ou quelques heures par ELISA.
Enfin, ces protocoles sont conçues pour la caractérisation des modèles de transplantation et peuvent être, dans une certaine mesure, appliquée aux modèles de maladie auto-immune. Les principes de la méthode est transposable à toutes les espèces.

<table><tbody><tr><td><Animaux forts></forts></td><td></td><td></td><td></td>rats</tr> <tr><td>LEW.1W et LEW.1A</td><td>Janvier Labs, France</td><td></td><td>8 semaines,&nbsp ;</td></tr><tr><td>BN rats donneurs tiers Janvier</td><td>Labs, France</td><td></td><td>8 semaines,&nbsp ;</td></tr><tr><td>name</td><td>company</td><td>numéro de catalogue</td><td>comments</td></tr><tr><td>reagentsAdCD40Ig</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France</td><td></td><td>plasmides maison</td></tr><tr><td>IL34-AAV</td><td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France</td><td></td><td>plasmides faits maison</td></tr><tr><td>FGL2-AAV</td><td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France</td><td></td><td>Plasmides faits maison</td></tr><tr><td>anti-TCRab</td><td>Hybridome de la Collection Européenne de Culture Cellulaire, Salisbury, Royaume-Uni</td><td>Clone R7/3</td> Culture <td>maison, purification et couplage fluororophore</td></tr><tr>Hybridome<td>anti-CD25</td><td>de la Collection Européenne de Culture Cellulaire, Salisbury, Royaume-Uni</td><td>Clone</td> <td>OX39Culture maison, purification et couplage fluororophore</td></tr><tr><td>Hybridome anti-CD8</td><td>de la Collection Européenne de Culture Cellulaire, Salisbury, Royaume-Uni</td><td>Clone OX8</td><td>Cultivation maison, purification et couplage fluororophore</td></tr><tr><td>anti-CD45RA</td><td>Hybridome de la Collection Européenne de Culture Cellulaire, Salisbury, Royaume-Uni</td><td>Clone OX33</td><td>Culture maison, purification et couplage fluororophore</td></tr><tr><td>anti-CD161</td><td>Hybridome de la Collection Européenne de Culture Cellulaire, Salisbury, Royaume-Uni</td><td>Clone 3.2.3</td><td>Hybridome de la Collection</td></tr><tr><td></td><td>Européenne de Culture Cellulaire, Salisbury,</td> Royaume-Uni Clone <td>OX42</td> de <td>la Culture Cellulaire Maison, purification et couplage fluororophore</td></tr><tr><td>Anti-TCRgd</td><td>Hybridome de la Collection Européenne de Culture Cellulaire, Salisbury, Royaume-Uni</td><td>Clone</td> <td>V65Culture maison, purification et couplage fluororophore</td></tr><tr><td>Hybridome anti-CD45RC</td><td>de la Collection Européenne de Culture Cellulaire, Salisbury, Royaume-Uni</td><td>Clone OX22</td> Culture <td>maison, purification et couplage fluororophore</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>Hybridome de la Collection Européenne de Culture Cellulaire, Salisbury, Royaume-Uni</td><td>Clone OX35</td><td>Culture maison, purification et couplage fluororophore</td></tr><tr><td>anti-CD45R</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#554881, His24 clone</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat IgG-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA</td><td>#112-096-071</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat IgG1</td><td>Serotec</td><td>#MCA 194</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat IgG2a</td><td>Serotec</td><td>#MCA 278</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat IgG2b</td><td>Serotec</td><td>#MCA 195</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat IgM-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, États-Unis#</td><td>115-095-164</td><td></td></tr><tr><td>streptavidine HRP</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#554066</td><td></td></tr><tr><td>KLH</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, États-Unis</td><td>#9013-72-3</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo Fisher&nbsp ; Scientific Inc, États-Unis</td><td></td><td>Solution tampon de phosphate sans calcium ni magnésium,</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, Saint-Louis, USA</td><td>#9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit de réactifs de substrat TMB</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#555214</td><td></td></tr><tr><td>CellTraceTM Kit de prolifération cellulaire CFSE</td><td>Thermo Fisher&nbsp ; Scientific Inc, États-Unis</td><td></td><td></td></tr>#C34554 <tr><td>RPMI 1640 moyen 1X</td><td>Thermo Fisher&nbsp ; Scientific Inc, USA</td><td>#31870-025</td><td></td></tr><tr><td>pénicilline streptomycine</td><td>Thermo Fisher&nbsp ; Scientific Inc, USA</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Buffer</td><td>Thermo Fisher&nbsp ; Scientific Inc, États-Unis</td><td>#15630-056</td><td></td></tr><tr><td>acides aminés non essentiels</td><td>Thermo Fisher&nbsp ; Scientific Inc, États-Unis#</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Thermo Fisher&nbsp ; Scientific Inc, États-Unis#</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>2 bêta-mercaptoéthanol</td><td>Sigma, Saint-Louis, États-Unis</td><td></td><td></td></tr>#M3148 <tr><td>Colorant de prolifération cellulaire eFluor&reg ; 450 cellules</td><td>Thermo Fisher&nbsp ; Scientific Inc, États-Unis#</td><td>65-0842-85</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma, Saint-Louis, États-Unis</td><td></td><td></td></tr>#G3126 <tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher&nbsp ; Scientific Inc, États-Unis</td><td></td><td></td></tr>#D1306 <tr><td>Collagenase D</td><td>Roche Diagnostics, Allemagne</td><td>#11088882001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma, Saint-Louis, États-Unis</td><td></td><td></td></tr>#E5134 <tr><td>NaCl 0.9 %</td><td>Fresenius Kabi</td><td>#B230561</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic dynabeads Dynal</td><td>, Invitrogen</td><td>#11033</td><td>Goat anti-souris IgG</td></tr><tr><td>One Comp eBeads</td><td>Ebiosciences, San Diego, États-Unis</td><td>#01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>Bétadine</td><td>Se référer aux directives</td><td></td><td></td>institutionnelles</tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Se référer aux directives</td><td></td><td></td>institutionnelles</tr><tr><td>Naplbuphine</td><td>Se référer aux directives</td><td></td><td></td>institutionnelles</tr><tr><td>Terramycine</td><td>Se référer aux directives institutionnelles</td> Buprénorphine Se référer aux directives <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>institutionnelles lignes directrices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Méloxicam</td><td>Se référer aux lignes directrices</td><td></td><td></td>de l’établissement</tr><tr><td>Compléter l’adjuvant</td><td></td><td></td><td></td>de Freund</tr><tr><td>Rompun Se</td><td>référer aux lignes directrices</td><td></td><td></td>de l’établissement</tr><tr><td>Ringer lactate</td><td>Se référer aux lignes directrices</td><td></td><td></td>de l’établissement</tr><tr><td>Kétamine</td><td>Se référer aux lignes directrices</td><td></td> <td>de l’établissement</td></tr><tr>Solution <td></td><td></td> de <td>lyse des globules rouges</td><td>Diluer 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) et 37,2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) dans 800ml H2O. Ajustez le pH à 7,2-7,4 et complétez à 1L avec H2O.</td></tr><tr><td>Collagénase D</td><td></td><td></td><td>Diluer 1g de collagénase dans 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2 % FCS</td></tr><tr><td>PBS-FCS (2 %)-EDTA (0,5 %)</td><td></td><td></td><td>Ajouter 5 mL d’EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) et 20ml FCS à 1ml PBS 1X</td></tr><tr><td>CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)</td><td></td><td></td><td>Diluer 50&micro ; g (=1 flacon) de CFDA SE (composant A) dans 90&mu ; l Solution DMSO (composant B) pour obtenir une solution mère de 10 mM. Ensuite, diluer la solution mère à 1/20 000 dans du PBS 1X pour obtenir une valeur de 0,5&mu ; </td></tr><tr><td>Milieu complet pour la coculture</td><td></td><td></td><td>500 ml milieu complet RPMI-1640 avec 5 ml de pénicilline (80 unité/ml)-steptomycine (80 mg/ml), 5 ml de L-glutamine, 5 ml d’acides aminés non essentiels (100X), 5 ml de pyruvate sodique (100 mM), 5 ml de tampon HEPES (1M), 2,5 ml de mercaptométhanol (7 ml de stock de 2-bmercaptoéthanol dilué dans 10 ml de RPMI), 10 % FCS</td></tr><<tr><td>strong>name</td><td>company</td><td>numéro de catalogue</strong</td><td>>comments</strong</td></tr><tr><td>>equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>falcon 50ml</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#227261</td><td></td></tr><tr><td>falcon 15ml</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#188271</td><td></td></tr><tr><td>tamis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning</td><td>VWR, Pessac#</td><td>391-0439</td><td></td></tr><tr><td>100&micro ; m et 60&micro ; Filtres à tissus m</td><td>Sefar NITEX, Heiden, Suisse</td><td>#03-100/44 et #03-60/35</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de fond en U à 96 puits pour la coculture</td><td>&nbsp ; Falcon U-bottom Plaque de culture tissulaire, stérile, Corning</td><td>#353077</td><td></td></tr><tr><td>96 puits Plaques en V pour coloration FACS</td><td>ThermoScientifique, Danemark</td><td>#249570</td><td></td></tr><tr><td>96 puits à fond plat Plaques ELISA</td><td>Nunc Maxisorb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>seringue pour écrasement de la rate</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#309649</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur ELISA</td><td>SPARK 10M, Tecan, Suisse</td><td>SPARK 10M, Tecan, Suisse</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bain marie&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Irradiateur à rayons X</td><td>Lincolshire, Angleterre</td><td>Faxitron CP160</td><td></td></tr><tr><td>agitateur</td><td></td><td></td><td></td>solaire</tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria II</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aimant</td><td>Thermo Fisher&nbsp ; Scientific Inc, États-Unis</td><td>12302D</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro et in vivo l’évaluation d’activité suppressive t, b et les cellules myéloïdes et des réponses humorales de receveurs de transplantation

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

La principale préoccupation dans la transplantation consiste à atteindre une tolérance spécifique par induction des cellules régulatrices. La compréhension des mécanismes de tolérance nécessite des modèles fiables. Nous décrivons ici des modèles de tolérance à l’allogreffe cardiaque chez le rat, induite par le blocage des signaux de costimulation ou par stimulation de l’expression des molécules immunorégulatrices par transfert de gène. Chacun de ces modèles a permis d’en vivo génération de cellules régulatrices telles que les lymphocytes T régulateurs (Tregs), cellules régulatrices de B (Bregs) ou des cellules myéloïdes réglementaires (RegMCs). Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent deux protocoles complémentaires qui ont été utilisés pour identifier et définir l’activité de régulation cellulaire in vitro et in vivo pour déterminer leur responsabilité dans l’induction de la tolérance et le maintien. Tout d’abord, un essai in vitro suppressive avec ont permis l’identification rapide des cellules avec capacité suppressive de réponses immunes effectrices dans une façon dose-dépendante et peut être utilisé pour une analyse ultérieure comme mesure de cytokine ou la cytotoxicité. En second lieu, le transfert adoptif de cellules d’un bénéficiaire traité tolérant à un destinataire greffé récemment irradié, a mis en évidence les propriétés tolérogène de ces cellules dans le contrôle des réponses immunitaires greffon réalisé et/ou conversion de (nouveaux) cellules régulatrices qualifié de tolérance infectieuse). Ces méthodes ne se limitent pas aux cellules avec des marqueurs phénotypiques connus et peuvent être étendues à toute la population cellulaire. De plus, donateur a ordonné allospecificity des cellules régulatrices (un objectif important dans le domaine) peut être évaluée à l’aide de cellules du donneur tiers ou greffer soit in vitro ou in vivo. Enfin, pour déterminer la capacité tolérogène spécifique de ces cellules régulatrices, nous fournissons des protocoles visant à évaluer les réponses humorales anticorps anti-donateurs et la capacité du bénéficiaire à élaborer des réponses humorales contre des antigènes connus neufs ou anciens. Les modèles de tolérance décrite peuvent être utilisés pour caractériser les cellules régulatrices, afin d’identifier de nouveaux biomarqueurs et immunorégulatrices molécules et peuvent être adaptés à d’autres modèles de transplantation ou de maladies auto-immunes chez rongeur ou humaine.

L’évaluation de l’activité suppressive après tri des APC (Figure 1), les cellules de répondeur et Tregs simultanément (Figure 2), ou individuellement (Figure 4), et tout autres cellules régulatrices putatifs (Figure 3), peut être Done in vivo par injection directe des cellules régulatrices et in vitro par la mesure de luminosité CFSE (<strong class="xfi...

Nous présentons ici un protocole visant à induire une tolérance à la transplantation et évaluer in vitro et in vivo la capacité suppressive des sous-ensembles distincts de cellules par le bénéficiaire et l’état immunitaire du receveur envers le donneur ou d’antigènes exogènes.

In Vitro et In Vivo l’évaluation d’activité Suppressive T, B et les cellules myéloïdes et des réponses humorales de receveurs de transplantation

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

L'induction de la tolérance en transplantation est souvent associée à l'apparition d'une population de cellules régulatrices. L'absence de réponse immunitaire contre le donneur, tout en préservant l'immunité contre les antigènes exogènes. Nous disposons de différents protocoles pour évaluer in vitro et in vivo la capacité suppressive de tout sous-ensemble de cellules régulatrices ainsi que l'état des réponses humorales de l'hôte.Anesthésiez un rat donneur Lewis 1W par inhalation d'isoflurane dans l'O₂, complétée par 1 % de N₂O après cinq minutes. Placez l'animal en décubitus dorsal et désinfectez l'abdomen avec du bétadine afin d'effectuer une thoracotomie. Serrez la veine cave inférieure et la veine cave supérieure avec des ligatures, puis sectionnez-les.Ensuite, sectionner l'artère pulmonaire et l'aorte, et conserver le greffon dans du NaCl 0,9 % à froid. Anesthésier un rat récipient Lewis 1A de 150 grammes âgé de huit à douze semaines à l'aide d'une inhalation d'isoflurane dans O₂ complétée par 1 % de N₂O. Placer l'animal en décubitus dorsal et désinfecter l'abdomen avec du bétadine afin de réaliser une laparotomie céphalo-pubienne. Externe les intestins, pincer les vaisseaux sa

in-vitro-vivo-assessment-t-b-myeloid-cells-suppressive-activity

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Tregs sont suppresseurs puissants du système immunitaire. Il ya un manque de marqueurs de surface unique de les définir, par conséquent, les définitions des Treg sont principalement fonctionnelle. Nous décrivons ici une...

Homme In Vitro</emRépression> comme outil de dépistage pour la reconnaissance d&#39;un Etat précoce de déséquilibre immunitaire

Murin de transplantation de moelle osseuse est une technique largement utilisée pour étudier les mécanismes immunologiques qui régissent la réaction du greffon contre l'hôte chez l'homme. La capacité de surveiller les tendances du trafic de cellules...

L&#39;induction de la réaction du greffon contre l&#39;hôte et des maladies<em&gt; In Vivo</em&gt; Suivi des lymphocytes T utilisant un modèle murin MHC-apparié

Nous décrivons un test de diagnostic précieux qui pourrait être utilisé pour décider du retrait de l'immunosuppression après transplantation sans risque élevé de rejet du greffon. Le test utilise les principes de type hypersensibilité retardée et fournit une évaluation précise de ces deux réponses immunitaires effectrices et réglementaires spécifiques donneur supporté par les bénéficiaires.

Trans-vivo de type hypersensibilité retardée test pour le règlement spécifique de l&#39;antigène

La capacité de surveiller les réponses des cellules T en détail in vivo est importante pour le développement de la compréhension de la réponse immunitaire. Nous décrivons ici l'utilisation de réseaux de cibles fluorescentes (ALE) dans un test in vivo de cellules T en évaluant&gt; 250 paramètres simultanément par cytométrie de flux.

L&#39;utilisation des tableaux cibles fluorescentes pour l&#39;évaluation des réponses des cellules T<em&gt; In vivo</em

Le présent document décrit un procédé de mesure alloréactivité dans une population mixte de cellules T en utilisant la cytométrie de flux d'imagerie.

Mesure de cellules T alloréactivité basés sur l&#39;imagerie cytométrie en flux

Nous présentons ici une demande d’une norme technique immunologique (CFSE teinté OT-j’ai la prolifération) permettent de contrôler rapidement induite par le traitement adjuvant des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) génération in vivo. Cette estimation rapide des capacités CTL est utile pour le développement de vaccins prophylactiques contre les pathogènes intracellulaires, mais aussi des vaccins thérapeutiques contre le cancer.

Évaluation rapide In Vivo des fonctions de génération de l’Adjuvant T cytotoxique Lymphocytes pour le développement de vaccins

Ce protocole décrit un flux de travail détaillé pour la génération et ex vivo de caractérisation des virus oncolytiques pour l’expression des immunomodulateurs, en utilisant le codage bispécifiques lymphocytes T recruteurs comme un exemple de virus de la rougeole. Application et l’adaptation à d’autres plates-formes de vecteur et les transgènes vont accélérer le développement de nouveaux immunovirotherapeutics pour la traduction clinique.

Paramyxovirus pour tumeur ciblées Immunomodulation : conception et évaluation Ex Vivo

Nous décrivons ici un essai de tuerie in vivo basé sur la cytométrie en flux qui permet l’examen de l’immunodominance dans les réponses cytotoxiques des lymphocytes T (CTL) à un antigène tumoral modèle. Nous fournissons des exemples de la façon dont ce dosage élégant peut être utilisé pour les études mécanistes et pour les tests d’efficacité des médicaments.

Adaptation des dosages de cytotoxicité in vivo à l’étude de l’immunodominance dans des réponses cellulaires spécifiques à la tumeur et aux lymphocytes T

La maladie de greffe-contre-hôte est une complication principale après la transplantation allogeneic de moelle. Les cellules dendritiques jouent un rôle critique dans la pathogénie de la maladie de greffe-contre-hôte. L’article actuel décrit une nouvelle plate-forme de transplantation de moelle osseuse pour étudier le rôle des cellules dendritiques dans le développement de la maladie de greffe-contre-hôte et de l’effet de greffe-contre-leucémie.

Plate-forme de transplantation de moelle osseuse pour étudier le rôle des cellules dendritiques dans la maladie de greffe-contre-hôte

L’étude démontre le rôle de la peau dans la modulation des réponses immunitaires chez la souris par l’immunisation épicutanée (EC). L’immunisation par EC avec un antigène protéique peut supprimer les réponses immunitaires en cas d’hypersensibilité de contact ou inverser la suppression induite par la peau lorsqu’elle est associée à des profils moléculaires associés à des agents pathogènes. L’immunisation EC est prometteuse en tant qu’approche efficace et sans aiguille de l’immunothérapie.

Modèle murin d’immunomodulation induite par l’épi-peau

Ce protocole fournit une stratégie de co-culture in vitro pour étudier les effets des lymphocytes T régulateurs sur la prolifération et la différenciation des lymphocytes T effecteurs.

In Vitro Analyse fonctionnelle des lymphocytes T régulateurs : accent sur la prolifération et la différenciation

Découvrez un protocole d'évaluation in vitro et in vivo de la capacité suppressive des cellules régulatrices T, B et myéloïdes dans un modèle de transplantation cardiaque chez le rat.

In Vitro et In Vivo l’évaluation d’activité Suppressive T, B et les cellules myéloïdes et des réponses humorales de receveurs de transplantation (Vidéo) | JoVE Journal

In Vitro et In Vivo l’évaluation d’activité Suppressive T, B et les cellules myéloïdes et des réponses humorales de receveurs de transplantation

Explorer plus de vidéos