Une méthode polyvalente de patterning Les protéines et les cellules

L’objectif global de cette procédure est de modéliser des cellules ou des substrats en les distribuant dans des microcanaux complexes, longs et fermés à l’aide d’outils de paillasse simples disponibles dans la plupart des laboratoires biologiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie concernant les interactions entre cellules et entre cellules et protéines. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile à réaliser et qu’elle ne nécessite que des outils facilement disponibles dans la plupart des laboratoires biologiques.

Généralement, les individus novices dans cette méthode auront des difficultés car elle nécessite une optimisation des conditions d’incubation des cellules et des substrats choisis par le chercheur. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car le bon placement du tampon et de la solution PDMS améliore considérablement la reproductibilité de l’expérience. Commencez par dessiner la disposition du microcanal à l’aide d’un outil de dessin CAO.

Ensuite, imprimez le dessin sur du papier blanc. Ensuite, utilisez de l’isopropanol pour nettoyer une lame de verre suffisamment grande pour s’adapter au design. Et puis séchez la diapositive avec un pistolet à air comprimé.

Fixez du ruban adhésif sur la lame de verre nettoyée, en prenant soin de ne pas piéger de bulles d’air. Ensuite, collez les côtés du verre sur le papier avec le motif, de sorte que le côté du ruban soit vers le haut. À l’aide d’un scalpel, coupez le ruban adhésif sur la lame de verre, en utilisant le motif en papier comme référence.

Une fois coupé, décollez le ruban des zones indésirables de la lame de verre. Ensuite, rincez la lame de verre avec de l’isopropanol pour éliminer tout résidu d’adhésif. Et puis utilisez un pistolet à air comprimé pour sécher la surface.

Une fois décorée et nettoyée, faites cuire la lame de verre dans un four à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, roulez doucement sur le ruban avec un rouleau en caoutchouc, pour éliminer les bulles d’air et laissez la lame refroidir à température ambiante dans une boîte de Pétri. Commencez par mélanger 10 parties d’un élastomère PDMS avec 1 partie de son agent de durcissement et remuez vigoureusement le mélange.

Ensuite, placez le mélange dans une chambre à vide pour dégazer le mélange jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles d’air. Versez une couche de 2 mm d’épaisseur du mélange sur le moule à ruban adhésif et dégazez le moule jusqu’à ce que toutes les bulles d’air disparaissent. Une fois refroidi, utilisez un scalpel pour couper la couche PDMS à au moins 5 mm des caractéristiques.

Et puis, décollez le PDMS durci du moule à l’aide d’une pince à épiler. Percez un seul trou d’entrée avec un poinçon de biopsie de 1 mm, de préférence à l’extrémité d’un réseau de microcanaux. Ensuite, nettoyez le plâtre PDMS avec du ruban adhésif, pour éliminer les particules de poussière de l’appareil.

Stérilisez le dispositif à microcanaux PDMS en le rinçant avec une solution de 70 % d’ehtanol, suivie d’eau désionisée stérile, et exposez-le à la lumière UV pendant 30 minutes. À l’aide d’une pince à épiler, placez le PDMS moulé stérile sur une lamelle en verre stérile et appliquez une légère pression à l’aide de la pointe de la pince à épiler. Ensuite, placez une gouttelette de poly d lysine dans un tampon de tétraborate de sodium à l’entrée des microcanaux.

Placez la boîte de Pétri sous vide pendant 10 minutes. Pendant ce temps, observez l’air sortant du canal sous forme de bulles. Relâchez le vide et observez la solution de substrat s’écouler dans le microcanal Incuber la parabole à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, décollez soigneusement le tampon PDMS à l’aide d’une pince à épiler stérile et lavez le motif trois fois avec de l’eau déminéralisée. Ajoutez une solution BSA à 1 % à la lamelle de verre, pour réduire l’adhérence non spécifique, et incubez l’échantillon pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, aspirez la solution BSA.

Pour commencer la structuration indirecte des cellules, préparez une suspension cellulaire dans un milieu de culture exempt de sérum comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Ajoutez la suspension cellulaire dans la boîte de Pétri à motifs, en immergeant complètement la région à motifs dans la suspension cellulaire. Ensuite, incubez la boîte de Pétri à 37 degrés Celsius dans un incubateur pendant 15 minutes pour permettre aux cellules de se fixer au substrat à motifs.

Après l’incubation, aspirez l’excès de suspension cellulaire de la boîte de Pétri et lavez les cellules à motifs trois fois avec du PBS, tout en secouant doucement pendant dix secondes pour retirer les cellules non attachées. Ensuite, ajoutez le milieu de culture approprié aux cultures cellulaires à motifs et incubez les cellules à motifs à 37 degrés Celsius dans un incubateur tamponné au dioxyde de carbone. Pour la structuration directe des cellules, stérilisez d’abord le dispositif microfluidique en le rinçant avec une solution d’éthanol à 70 % suivie d’eau déminéralisée.

Ensuite, faites tremper l’appareil pendant la nuit dans une solution de BSA à 1 % pour éviter l’adhésion cellulaire non spécifique au PDMS. Séchez l’appareil à température ambiante, puis fixez-le au fond de la boîte de Pétri traitée pour la culture tissulaire. Placez 4 à 8 microlitres de suspension cellulaire, suffisamment pour remplir les microcanaux, sur l’entrée, en recouvrant complètement le trou.

Ensuite, mettez la boîte de Pétri dans une chambre à vide pendant 10 minutes. Relâchez le vide et observez la suspension cellulaire s’écouler dans le microcanal. Incuber la boîte de Pétri à 37 degrés Celsius dans un incubateur tamponné au dioxyde de carbone, pendant une heure maximum.

Ensuite, retirez le plat de l’incubateur et utilisez une pince à épiler pour décoller soigneusement le PDMS du plat. Lavez le motif avec du PBS, puis ajoutez du milieu de culture cellulaire dans la boîte de Pétri. Lorsque vous avez terminé, remettez les cellules dans l’incubateur.

On voit ici des neurones corticaux embryonnaires de rat modelés sur des surfaces de poly d lysine et de laminine. L’emplacement des cellules démontre une adhérence générale aux zones à motifs et une croissance le long de la PDL et des bandes de laminine. Ici, à un grossissement plus élevé, on voit des myoblastes C2C12.

Ce type de cellule adhère également aux zones à motifs et démontre la fusion en myotubes multinucléés. Cette technique a également été adaptée pour la structuration cellulaire directe, illustrée ici avec des fibroblastes. Cette méthode de structuration cellulaire directe n’a aucun effet négatif sur la survie cellulaire.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la microscopie fluorescente peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires impliquant la localisation des protéines ou les interactions cellule-substrat. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que le placement correct de la gouttelette de cellules ou de la solution de substrat pour couvrir l’ensemble de l’inlay est essentiel pour réussir. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer le guidage des axones des photorécepteurs en biologie rétinienne.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de structurer les cellules et le substrat avec des dispositifs microfluidiques PDMS perméables au gaz en utilisant une pression négative. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans votre expérience.