La détection de G Protein-Coupled Receptor Internalisation activé de ligand par microscopie confocale

L’objectif global de cette expérience est de fournir une méthode efficace et facilement interprétable pour détecter la localisation subcellulaire et l’internalisation des protéines de fusion GPCR exprimées dans les cellules de mammifères. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la localisation des protéines subcellulaires, telles que l’internalisation et le recyclage des récepteurs. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée facilement et efficacement.

Cette méthode peut donc fournir des informations sur la surveillance et la localisation des RCPG. Et cela peut également s’appliquer à d’autres systèmes, tels que les protéines cytoplasmiques et nucléaires. Après avoir récupéré et passé les cellules HEK293 selon le protocole de texte, lorsque les cellules ont atteint une confluence proche, jetez le milieu de croissance équilibré, ajoutez deux millilitres de PBS et faites tourner le plat pour laver les cellules.

Jetez le PBS et ajoutez un millilitre de trypsine EDTA. Pour digérer complètement les cellules, faites tourner soigneusement la boîte et aspirez la solution. Ensuite, placez le plat dans cet incubateur de CO2 à 37 degrés Celsius pendant trois minutes.

Pendant que les cellules sont en incubation, préparez une plaque à six puits en ajoutant deux millilitres de milieu de croissance équilibré à chaque puits. Ensuite, lorsque les cellules se sont soulevées du fond de la boîte, ajoutez un millilitre de milieu de croissance équilibré dans la boîte. Mélanger par pipetage et transférer immédiatement 0,1 millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à six puits préparée.

Pipetez doucement la suspension dans les puits et incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Le lendemain, assurez-vous que les cellules sont confluentes à 85-95 %. Ensuite, dans deux tubes de microcentrifugation stériles, ajoutez trois microgrammes d’ADN plasmidique et 100 microlitres de milieu sérique réduit dans un tube.

Pendant ce temps, ajoutez neuf microlitres de réactif un et 100 microlitres de milieu sérique réduit dans un autre tube. Incuber les tubes à température ambiante pendant cinq minutes. Combinez le mélange de plasmide dilué avec le réactif dilué.

Ensuite, mélangez doucement la solution et incubez-la à température ambiante pendant 20 minutes. Aspirez le milieu des cellules et ajoutez 1,5 millilitres de DMEM frais sans FBS. Ensuite, ajoutez goutte à goutte 215 microlitres de mélange de réactifs de transfection d’ADN dans chaque puits et mélangez doucement en remuant la plaque.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant quatre à huit heures. Ensuite, remplacez le milieu par du DMEM frais avec 10 % FBS. Incuber les cellules pendant encore 24 à 48 heures avant d’effectuer des expériences.

L’efficacité de la transfection peut varier considérablement d’une lignée cellulaire à l’autre. Par conséquent, l’optimisation du sit et du stab dans le dépôt peut être nécessaire en fonction du type de cellule particulier utilisé. Retirez le milieu de croissance de la plaque de culture à six puits.

Ensuite, utilisez un millilitre de PBS pour laver la monocouche cellulaire. Ajoutez 0,5 millilitre de trypsine EDTA, faites tourner le plat et aspirez la solution. Ensuite, incubez la plaque de culture à 37 degrés Celsius pendant trois minutes.

Pendant l’incubation, insérez des lamelles stériles de 15 millimètres de diamètre dans chaque puits d’une plaque à 12 puits. Remettez les cellules en suspension dans un petit volume de milieu de croissance complet frais et transférez le nombre requis de cellules sur la plaque à 12 puits avec lamelles. Ensuite, incubez les cellules pendant 16 à 24 heures.

Après 16 à 24 heures d’incubation, lorsque les cellules se sont développées jusqu’à ce qu’elles se rapprochent de la confluence, ajoutez cinq micromolaires d’aneth de sonde à membrane dans chaque puits et remettez les cellules dans l’incubateur pendant 30 minutes. Retirez le milieu de croissance équilibré et utilisez du PBS froid pour laver les cellules deux fois. Ensuite, ajoutez un millilitre de PFA à 4 % dans chaque puits et agitez les cellules pendant 15 minutes pour fixer les cellules.

Avec le PBS, lavez deux fois les cellules fixes, puis ajoutez 200 à 300 microlitres de DAPI dans chaque puits, et incubez la plaque pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir lavé les cellules avec du PBS deux fois, retirez soigneusement les lamelles de la plaque et évacuez l’excès de tampon. Inversez les lamelles sur des lames de microscope chargées d’une goutte de support de montage.

Ensuite, retirez l’excédent de support de montage des glissières. À l’aide de cellules qui se sont développées près de la confluence, retirez le milieu de croissance équilibré et ajoutez du DMEM frais et réchauffé. Incuber les cellules pendant une heure.

Traitez les cellules avec différentes concentrations de ligand pendant 30 minutes. Et traitez les cellules avec un ligand de 10 à moins six molaires pendant les différents temps indiqués ici. Utilisez du PBS froid pour laver les cellules deux fois, puis ajoutez un millilitre de 4 % de PFA dans du PBS dans chaque puits, avant d’agiter doucement les cellules pendant 15 minutes.

Après avoir lavé les cellules deux fois dans du PBS, retirez soigneusement les lamelles des puits de la plaque et montez-les comme nous venons de le démontrer plus tôt dans cette vidéo. Pour effectuer la microscopie confocale, allumez le matériel du microscope confocal, y compris l’alimentation de la lampe à mercure, le microscope PC, le scanner et le laser. Lancez le logiciel, puis vérifiez la configuration et sélectionnez le laser.

Allumez les différentes unités du système de microscopie confocale conformément aux instructions. Placez une lame préparée sur la platine du microscope et utilisez le contrôleur de platine pour positionner l’échantillon sur la lentille de l’objectif. Pour une lentille à immersion dans l’huile, ajoutez une goutte d’huile de cèdre sur la lamelle et orientez la lame avec une lamelle face à la lentille.

Sous fluorescence, trouvez les cellules d’intérêt, puis passez en mode balayage, et choisissez la puissance laser et la plage spectrale du fluorophore d’émission. Capturez des images de haute qualité en ajustant l’intensité du laser et d’autres paramètres. Cette figure illustre l’expression de pEGFP-N1 dans les cellules HEK293.

Le signal GFP a été détecté dans le cytoplasme et le noyau. La localisation subcellulaire dans les cellules HEK293 des récepteurs de l’hormone de libération des gonadotrophines de S-Japonica, ou SjGnRHR, est illustrée ici. Les récepteurs EGFP sont en vert, et la coloration Dil, qui met en évidence la membrane cellulaire, est en rouge.

Les récepteurs sont vus en train de se localiser dans la membrane plasmique. Pour visualiser l’internalisation des SjGnRHR, les cellules ont été traitées avec de l’hormone de libération des gonadotrophines à différentes concentrations. Comme on le voit ici, l’internalisation des récepteurs s’est déroulée de manière dose-dépendante, et le récepteur a été complètement internalisé à partir de la surface de la cellule avec le ligand molaire de 10 à moins six.

Lorsqu’ils ont été traités avec un ligand de 10 à moins six molaires pendant différentes périodes, les SjGnRHR internalisés étaient détectables 10 minutes après la simulation de l’agoniste, et l’internalisation extrême s’est produite en 60 minutes. Comme démontré dans les cellules HEK293, dans les deux expériences, la protéine de fusion fluorescente SjGnRHR EGFP s’est principalement localisée dans la membrane plasmique et a été internalisée de manière spectaculaire et rapide dans les cellules. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder les cellules dans les bonnes conditions sans contamination par des bactéries, des champignons et des mycoplasmes.

À la suite de cette procédure, des méthodes telles que la vérification et l’immobilisation des cellules peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le deuxième passage V des récepteurs protéiques. Après chaque développement, la technologie a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire et de la biochimie pour explorer la localisation et l’internalisation des récepteurs transmembranaires dans diverses lignées cellulaires.