Une méthode simple pour identifier les kinases qui réglementent la pluripotence des cellules souches embryonnaires par un dépistage des inhibiteurs à haut débit

L’objectif global de ce criblage est d’identifier les inhibiteurs de protéines kinases à petites molécules qui modulent la pluripotence des cellules souches embryonnaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation des cellules souches embryonnaires en identifiant de nouvelles voies de signalisation des protéines kinases qui régulent la pluripotence des cellules souches embryonnaires. Le principal avantage de cette technique est donc que le dépistage est relativement facile à réaliser à l’aide d’un équipement de laboratoire standard et de réactifs facilement disponibles.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons réalisé que la plupart des recherches sur les voies de signalisation de la pluripotence avaient complètement ignoré les vastes ondes du kinome. Préparez des plats de 10 centimètres enrobés de gélatine en ajoutant cinq millilitres de gélatine à 0,1 % dans des assiettes de 10 centimètres. Après l’incubation à température ambiante pendant cinq minutes, aspirez la gélatine et laissez sécher la plaque pendant deux minutes.

Ensuite, plaquez n’importe quelle lignée de cellules ES de souris standard sur les boîtes enrobées dans un milieu cellulaire ES de souris standard contenant 100 nanogrammes par millilitre de LIF marquée GST, 10 % de sérum de veau fœtal et 5 % de sérum de remplacement knock-out. Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius 5 % CO2 et remplacez le milieu tous les jours. Passage des cellules ES de souris à environ 80 % de confluence tous les deux jours en aspirant le milieu et en les lavant avec cinq millilitres de solution saline tamponnée au phosphate par plaque.

Ensuite, ajoutez un millilitre de trypsine EDTA par plaque de cellules ES de souris et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation, réintroduisez les cellules trypsinisées dans quatre millilitres de milieu et centrifugez les cellules à 1200 tr/min pendant cinq minutes. Remettez soigneusement en suspension la pastille cellulaire obtenue dans cinq millilitres de milieu, en pipetant de haut en bas pour générer une suspension à cellule unique.

Comptez les cellules en combinant une suspension de cellules de 10 microlitres et 10 microlitres de bleu trypan. Placez le mélange dans une chambre de comptage cellulaire ou utilisez un hémocytomètre et un microscope optique. Ensuite, ensemencez 3000 cellules ES de souris dans des plaques à 96 puits recouvertes de gélatine à 0,1 % dans un volume final de 100 microlitres de milieu à l’aide d’une pipette multicanaux.

Ensuite, appliquez les inhibiteurs de kinases à une dilution de un à 100 à l’aide d’une pipette multicanaux. Pipetez doucement le milieu pour mélanger l’inhibiteur et la suspension cellulaire. Ensuite, laissez les cellules se déposer dans un capot de culture tissulaire pendant une heure pour assurer une répartition uniforme sur la surface de placage.

Cultivez les cellules pendant 48 heures sans changer de milieu. Pour commencer l’analyse de dépistage, laver 96 plaques de cellules ES de souris dans 200 microlitres de PBS à l’aide d’un aspirateur multicanaux et de pipettes. Après le lavage, mélangez les extraits cellulaires dans 150 microlitres de tampon de lyse.

Clarifier les extraits par centrifugation à 1500 fois G pendant 30 minutes dans des plaques à fond en V à 96 puits. Ensuite, immobiliser 100 microlitres de surnageants sur une membrane de nitrocellulose à l’aide d’un collecteur de 96 puits sous vide. Séchez la membrane et la teinture avec 40 millilitres de Ponceau S pour assurer un transfert régulier.

Après avoir lavé la membrane avec du TBST, bloquez-la dans du TBST plus 3 % de lait. Ensuite, incubez la membrane dans les anticorps Nanog et Dnmt3b à une dilution de un à 1000 dans le tampon de blocage pendant la nuit. Le lendemain, lavez la membrane trois fois pendant 10 minutes dans du TBST.

Ensuite, incubez-le dans 30 millilitres d’anticorps secondaires à une dilution de un à 10 000 dans un tampon de blocage. Développer la membrane à l’aide d’un système d’imagerie numérique par immunobuvardage. Il est essentiel de valider les inhibiteurs de kinases identifiés dans le dépistage à l’aide de l’immunotransfert conventionnel avant de procéder.

Cela permet d’éliminer les faux positifs avant une analyse plus approfondie en aval. Analysez les données de criblage et validez les inhibiteurs en tant que régulateurs de pluripotence de bonne foi, comme décrit dans le protocole textuel. Voici un graphique représentatif des points Nanog de l’écran effectué.

Les inhibiteurs de contrôle positif qui entraînent une pluripotence amorcée ou naïve sont mis en évidence. Un graphique de points Dnmt3b représentatif de l’écran d’exécution est également présenté. Les inhibiteurs de contrôle positif qui entraînent une pluripotence amorcée ou naïve sont à nouveau mis en évidence.

Dans ce graphique, les inhibiteurs ont été classés en fonction du rapport Nanog/Dnmt3b. Un double seuil de rapport Nanog à Dnmt3b est fixé pour identifier les inhibiteurs qui stabilisent la pluripotence naïve ou amorcée. Des signaux Nanog et Dnmt3b additionnés sont également fournis.

De plus, les inhibiteurs de kinases sélectionnés pour une validation plus poussée sont notés. Voici une validation immunoblot conventionnelle de certains inhibiteurs de kinases, immunotransferts Nanog et Dnmt3b, ainsi que le rapport Nanog/Dnmt3b et le signal total sont fournis. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier les inhibiteurs de kinases à petites molécules qui modulent la pluripotence des cellules souches embryonnaires.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 72 heures si elle est correctement exécutée. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des voies de signalisation des kinases qui contrôlent la pluripotence, elle peut également être appliquée à la différenciation des cellules souches embryonnaires et à d’autres systèmes de régulation tels que les modificateurs épigénétiques. À la suite de la procédure, d’autres banques d’inhibiteurs de petites molécules, telles que celles ciblant les modificateurs épigénétiques, peuvent être utilisées pour identifier de nouveaux acteurs de la régulation de la pluripotence.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie à notre groupe de recherche pour élucider de nouvelles voies de signalisation de la pluripotence. Nous utilisons cette technique pour identifier un nouveau rôle pour la voie amplifiée dans la régulation de la pluripotence.