Turbidimétrie sur Human Washed: L'effet Plaquettes du Pannexin1 inhibiteur bleu brillant FCF sur l'agrégation induite par le collagène

L’objectif général de cette procédure est de décrire une méthode simple pour l’isolement des plaquettes lavées du sang humain, suivie de mesures d’agrégation plaquettaire induites par les agonistes par turbidimétrie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie plaquettaire humaine, telles que les effets de l’inhibition de la pannexine-1 sur l’agrégation plaquettaire induite par les agonistes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide et facile à réaliser tout en permettant un suivi fiable et reproductible des réponses d’agrégation.

L’agrégométrie par transmission lumineuse n’est pas seulement utilisée à des fins de recherche, mais elle est également utilisée pour l’étude de la fonction plaquettaire chez les patients atteints de troubles de la coagulation. Pour commencer, dissolvez 1,4 gramme d’acide citrique monohydraté, 2,5 grammes de citrate trisodique dihydraté et deux grammes de D-glucose anhydre dans de l’eau distillée pour préparer 100 millilitres d’une solution d’ACD avec un pH d’environ 4,5. Préparez ensuite le tampon de Tyrode en diluant 2,5 millilitres de solution mère dans un volume final de 15 millilitres d’eau distillée.

Ajustez le pH à 7,35 en ajoutant un chlorure d’hydrogène normal et un filtre, stérilisez la solution à l’aide d’un filtre de 0,22 micron. Enfin, ajoutez cinq millilitres de solution mère un, un millilitre de solution mère deux, deux millilitres de solution mère trois, 0,5 millilitre d’un tas molaire, 1,8 millilitre de 200 grammes par litre d’albumine sérique humaine et 0,1 gramme de d-glucose anhydre à un volume final de 100 millilitres d’eau distillée pour préparer le tampon TA. À l’aide d’un chlorure d’hydrogène normal, ajustez le pH à 7,35 et réglez l’osmolarité à 295 milliosmoles par litre avec de l’eau distillée.

Remplissez des tubes de 50 millilitres avec un volume d’anticoagulant ACD par six volumes de sang à prélever. Introduisez une aiguille de calibre 19 dans une veine antécubitale d’un donneur sain. Jetez le à deux millilitres initiaux de sang prélevé car il peut contenir de la thrombine et du facteur tissulaire et collectez les 45 à 50 millilitres suivants.

Retournez doucement le tube pour mélanger le sang avec la solution de DCA. Ensuite, incubez l’échantillon dans un four à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pour préparer du plasma riche en plaquettes, transférez cinq aliquotes d’un millilitre du sang recueilli dans des tubes de 15 millilitres et centrifugez les échantillons à 250 fois g à 37 degrés Celsius pendant 13 minutes.

Une fois centrifugés, aspirez la couche supérieure des échantillons, évitant ainsi toute contamination des globules rouges et blancs. Transférez ensuite le plasma riche en plaquettes obtenu dans un nouveau tube de 15 millilitres et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Centrifuger le plasma riche en plaquettes à 2, 200 fois g pendant 12 minutes.

Ensuite, retirez le surnageant et, à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, remettez soigneusement la pastille en suspension dans 10 millilitres du tampon TA contenant deux microlitres par millilitre d’héparine et 2,5 microlitres par millilitre de prostacycline micromolaire dans le tampon Tris-HCL. Incuber l’échantillon pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Ajoutez ensuite 2,5 microlitres par millilitre de prostacycline à 25 micromolaires et centrifugez l’échantillon à 1 900 fois g pendant huit minutes.

Après l’essorage, retirer le surnageant et, à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, remettre la pastille en suspension dans cinq millilitres de tampon TA contenant 2,5 microlitres par millilitre de prostacycline micromolaire. Incuber les plaquettes à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes une fois de plus. Pendant l’incubation de l’échantillon, transférez 150 microlitres de suspension plaquettaire dans un tube de 1,5 millilitre et comptez les plaquettes à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.

Après l’incubation, ajoutez 2,5 microlitres par millilitre de prostacycline 25 micromolaires à la suspension plaquettaire et centrifugez immédiatement l’échantillon à 1 900 fois g pendant huit minutes. Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension pour atteindre une densité de 250 000 plaquettes par microlitre en utilisant un volume adéquat de tampon TA contenant de l’apyrase à 0,32 unité par millilitre. Avant les mesures agrégées, incubez la suspension cellulaire à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes.

Pour procéder à l’agrégationmétrie, dissoudre le fibrinogène dans le tampon de Tyrode pour obtenir une solution de 56 milligrammes par millilitre. Pipeter 260 microlitres de suspension plaquettaire dans des cuvettes en verre contenant 10 microlitres de solution de fibrinogène et une tige d’agitation magnétique. Ensuite, incubez les suspensions pendant deux à trois minutes à 37 degrés Celsius dans un puits d’incubation à l’intérieur de l’agrégateur.

Ensuite, ajoutez 10 microlitres d’une solution mère de FCF bleu brillant de 2,8 millimolaires préparée dans de l’eau distillée et pré-incubez la suspension à 37 degrés Celsius pendant sept minutes. Pour calibrer l’agrégateur, préparez une cuvette contenant une solution de 10 microlitres de fibrinogène, une solution de 10 microlitres de bleu brillant FCF et le tampon TA sans plaquettes qui correspond à 100 % d’agrégation. Placez la cuvette dans un canal d’agrégation avec l’agitation automatique activée.

Indiquer le canal expérimental dans le logiciel contrôlant l’appareil et mesurer la densité optique de la solution. Ensuite, dans des conditions d’agitation constantes, calibrez l’agrégateur à l’aide d’un échantillon de plaquettes sans ajout d’agoniste correspondant à 0 % d’agrégation. Placez la cuvette dans l’agrégateur et indiquez le canal d’expérimentation dans le logiciel contrôlant l’appareil.

Attendez environ 20 à 30 secondes pour vous assurer qu’aucune agrégation ne se produit. Ajoutez ensuite 20 microlitres de l’agoniste souhaité dans la cuvette. Commencez immédiatement à enregistrer les données d’agrégation.

Procédez à une lecture pendant six minutes et enregistrez les données une fois terminée. Voici les courbes d’agrégation obtenues pour des plaquettes stimulées par le collagène qui ont été incubées avec de l’eau ou différentes concentrations de FCF bleu brillant. La faible concentration de FCF en bleu brillant n’a pas influencé la réponse plaquettaire au collagène, tandis que le bleu brillant FCF à un millimolaire a complètement aboli l’agrégation plaquettaire induite par le collagène.

Enfin, l’activité inhibitrice plaquettaire du bleu brillant FCF s’est avérée spécifique aux plaquettes activées par la stimulation du collagène alors qu’elle n’a pas influencé l’agrégation des plaquettes activées par l’acide arachidonique, comme le démontrent cinq mesures indépendantes prises chez des volontaires sains. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à six heures, selon le nombre de tests, si elle est bien réalisée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des tests d’agrégation basés sur la turbidimétrie sur des plaquettes lavées isolées du sang humain.

N’oubliez pas que travailler avec du sang humain peut être dangereux et que des précautions particulières telles que le port de gants de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.