Name: CAPRRESI: Assemblage de la chimère par insertion de plasmides et restriction Enzyme Site Insertion (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Apprenez la méthode CAPRRESI pour assembler des gènes chimériques par insertion de sites de restriction dans des séquences synonymes. Cette technique rapide et économique facilite la fusion de gènes codant pour des protéines.

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Ce travail a été soutenu par le Conseil national de la science et la technologie, le CONACYT, le Mexique (numéro de subvention 154833) et l&#39;Université nationale autonome du Mexique. Les auteurs souhaitent remercier Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos et Soledad Juárez pour leurs conseils administratifs et techniques.

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

CAPRRESI a été conçu comme une alternative au PRM 2 . Le PRM original est une technique puissante; Il permet la fusion des séquences d&#39;ADN le long de n&#39;importe quelle partie des gènes sélectionnés. Pour PRM, les gènes de type sauvage doivent être clones dans le même plasmide. Ensuite, les oligonucléotides sont conçus dans des gènes de résistance de type sauvage et antibiotiques trouvés sur le plasmide. La rupture des plasmides est obtenue par PCR en utilisant des ADN polymérases à extrémi...

L&#39;assemblage de gènes chimériques a été largement utilisé dans la biologie moléculaire pour élucider la fonction protéique et / ou à des fins biotechnologiques. Différents procédés existent pour fusionner des gènes, tels que l&#39;amplification de produit de PCR 1 , la récupération de plasmide 2 , la recombinaison homologue 3 , les systèmes CRISPR-Cas9 4 , la recombinaison 5 dirigée par site et l&#39;assemblage 6 de Gibson. Chacun de ces avantages offre différents avantages techniques; Par exemple, la flexibilité de la conception de la PCR en chevauchement, la sélection in vivo des constructions lors de la récupération du plasmide ou la haute efficacité des systèmes CRISPR-Cas9 et Gibson. En revanche, certaines difficultés peuvent survenir lors de l&#39;exécution de certaines de ces méthodes; Par exemple, les deux premières approches s&#39;appuient sur des fragments d&#39;ADN à extrémités franches, et la ligature de ces types de produits pourrait être techniquement difficile par rapport à SticLigature ky-terminée. La recombinaison dirigée par le site peut laisser des traces de séquences supplémentaires d&#39;ADN (cicatrices) sur l&#39;original, comme dans le système Cre- LoxP 5 . CRISPR-Cas9 peut parfois modifier d&#39;autres régions génomiques en plus du site cible 4 . Ici, nous introduisons l&#39;assemblage de chimère par récupération de plasmide et insertion de site d&#39;enzyme de restriction (CAPRRESI), un protocole pour fusionner des gènes codant pour des protéines qui combinent la méthode de récupération de plasmide (PRM) avec l&#39;insertion de sites d&#39;enzymes de restriction sur des séquences d&#39;ADN synonyme, améliorant l&#39;efficacité de ligature . Pour assurer l&#39;intégrité de la séquence d&#39;acides aminés, les sites d&#39;enzymes de restriction sont insérés sur des tronçons de séquence d&#39;ADN synonyme. Parmi les avantages de CAPPRESI, il est possible de le faire en utilisant des réactifs / outils de laboratoire ordinaires ( par exemple , enzymes, cellules compétentes, solutions et thermocycleurs) et qu&#39;il peut donner des résultats rapides (lorsque les enzymes appropriées sont utilisées). S&#39;appuyant sur la restrictionLes sites enzymatiques issus des séquences d&#39;ADN synonymes peuvent limiter la sélection des points de fusion exacts à l&#39;intérieur des protéines d&#39;intérêt. Dans de tels cas, les gènes cibles doivent être fusionnés en utilisant des oligonucléotides se chevauchant, et les sites d&#39;enzymes de restriction doivent être insérés sur le gène de résistance du vecteur. CAPRRESI se compose de sept étapes simples ( Figure 1 ): 1) sélection du vecteur de clonage, pUC18 ou pUC19 6 ; 2) analyse in silico des séquences de type sauvage à fusionner; 3) sélection des régions de rupture pour l&#39;assemblage de la chimère et la rupture des plasmides; 4) génération in silico de séquences d&#39;ADN synonymes contenant des sites d&#39;enzymes de restriction; 5) clonage indépendant des gènes de type sauvage dans le plasmide sélectionné; 6) rupture de plasmide par PCR, suivie d&#39;une digestion par une enzyme de restriction; Et 7) la récupération du plasmide en utilisant une ligature d&#39;ADN et une transformation bactérienne. Les gènes chimériques produits par cette technique devraient être vérifiés wAvec séquençage. Les vecteurs pUC18 / 19 offrent des avantages techniques pour le clonage et l&#39;assemblage des chimères, tels que la petite taille ( c.-à-d., 2,686 paires de bases), le nombre élevé de copies, les caractéristiques de réaction de séquençage avantageuses et la disponibilité commerciale 7 . Ici, un hôte Escherichia coli a été utilisé pour assembler et manipuler les chimères parce que les cultures bactériennes sont bon marché et se développent rapidement. Compte tenu de cela, le clonage ultérieur des fragments de fusion dans les plasmides cible finaux sera nécessaire ( par exemple, les vecteurs d&#39;expression comme pRK415 dans des bactéries ou pCMV dans des cellules de mammifères). CAPRRESI a été testé pour la fusion de deux principaux gènes du facteur sigma: E. colirpoD et Rhizobium etlisigA . Les facteurs de sigma primaires sont des sous-unités de l&#39;ARN polymérase responsables de l&#39;initiation de la transcription, et elles sont constituées de quatre domaines ( c&#39;est-à-dire σ1, σ2, σ3 et σ4) 8 . La séquence d&#39;acides aminés lengtH de protéines codées par rpoD et sigA sont respectivement 613 et 685. RpoD et SigA partagent 48% d&#39;identité (98% de couverture). Ces principaux facteurs sigma ont été divisés en deux fragments complémentaires entre les régions σ2 et σ3. Deux gènes chimériques ont été assemblés selon cette conception: la chimère 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) et la chimère 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). Les produits de fusion d&#39;ADN ont été vérifiés par séquençage.

<table><tbody><tr><td>Platinum Taq ADN polymérase Haute fidélité Thermo</td><td>Fisher</td><td>11304011</td><td>Produit un mélange de produits PCR à extrémité émoussée/3'-A en porte-à-faux Kit d’isolement</td></tr><tr><td>de plasmide de haute pureté</td><td>Roche</td><td>11754785001</td><td>Utilisé pour toutes les réactions de purification de plasmide</td></tr><tr><td>Kit de purification de produit PCR de haute pureté</td><td>Roche</td><td>11732676001</td><td>Utilisé pour toutes les réactions de purification par PCR à partir de gels d’agarose</td></tr><tr><td>Enzyme de restriction AflII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520L</td><td>Reconnaît la séquence 5'-CTTAAG-3' et coupe à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>KpnI-HF</td><td>enzyme de restriction New England Biolabs</td><td>R3142L</td><td>Reconnaît la séquence 5'-GGTACC-3' et coupe à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Enzyme de restriction SpeI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3133L</td><td>Reconnaît la séquence 5'-ACTAGT-3' et coupe à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>XbaI enzyme de restriction</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145L</td><td>Reconnaît la séquence 5'-TCTAGA-3' et coupe à 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Ampicilline sel sodique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td>Antibiotiques</td></tr><tr><td>Acide nalidixique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878-5G</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotiques Extrait de levure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625-1KG</td><td>Culture cellulaire bactérienne</td></tr><tr><td>Caséine peptone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70171-500G</td><td>Culture cellulaire bactérienne</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td>chlorure de sodium</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05040-1KG</td><td>Culture cellulaire bactérienne</td></tr><tr><td>XbaI enzyme</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0684</td><td>Digestion rapide XbaI enzyme</td></tr><tr><td>KpnI enzyme de restriction</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0524</td><td>KpnI enzyme</td></tr><tr><td>Kit de ligature rapide</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Kit de ligature rapide de l’ADN</td></tr><tr><td>AflII enzyme de restriction</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0834</td><td>Digestion rapide AflII enzyme</td></tr><tr><td>SpeI enzyme</td><td>de restriction Thermo Fisher</td><td>FD1253</td><td>Digestion rapide SpeI enzyme</td></tr></tbody></table>

caprresi: assemblage de la chimère par insertion de plasmides et restriction enzyme site insertion

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Ici, nous présentons l&#39;assemblage de la chimère par récupération du plasmide et l&#39;insertion du site enzymatique de restriction (CAPRRESI). CAPRRESI bénéficie de nombreuses forces de la méthode de récupération du plasmide d&#39;origine et introduit une digestion enzymatique de restriction pour faciliter les réactions de ligature d&#39;ADN (requises pour l&#39;assemblage de la chimère). Pour ce protocole, les utilisateurs clonent des gènes de type sauvage dans le même plasmide (pUC18 ou pUC19). Après la sélection in silico des régions de séquence d&#39;acides aminés où les chimères doivent être assemblées, les utilisateurs obtiennent toutes les séquences d&#39;ADN synonymes qui les codent. Les scripts ad hoc Perl permettent aux utilisateurs de déterminer toutes les séquences d&#39;ADN synonymes. Après cette étape, un autre script Perl recherche des sites d&#39;enzymes de restriction sur toutes les séquences d&#39;ADN synonymes. Cette analyse in silico est également effectuée en utilisant le gène de résistance à l&#39;ampicilline ( ampR ) trouvé sur les plasmides pUC18 / 19. Les utilisateurs conçoivent des oligonucléotides dans des régions synonymes pour perturber les gènes de type sauvage et ampR par PCR. Après obtL&#39;administration et la purification de fragments d&#39;ADN complémentaires, la digestion enzymatique de restriction est réalisée. L&#39;assemblage de la chimère est réalisé en ligant des fragments d&#39;ADN complémentaires appropriés. Les vecteurs pUC18 / 19 sont sélectionnés pour CAPRRESI car ils offrent des avantages techniques, tels que la petite taille (2,686 paires de bases), le nombre élevé de copies, les caractéristiques de réaction de séquençage avantageuses et la disponibilité commerciale. L&#39;utilisation d&#39;enzymes de restriction pour l&#39;assemblage de chimères élimine la nécessité d&#39;ADN polymerases produisant des produits à extrémités franches. CAPRRESI est une méthode rapide et peu coûteuse pour fusionner des gènes codant pour des protéines.

La figure 1 représente CAPRRESI. En utilisant cette méthode, deux gènes chimériques ont été assemblés en échangeant les domaines de deux facteurs sigma primaires bactériens ( c&#39;est-à-dire E. coli RpoD et R. etli SigA). Les séquences d&#39;ADN des gènes rpoD et sigA ont été obtenues en utilisant le navigateur Artemis Genome 14 à partir des fichiers génomiques GenBank NC_000913 et NC_007761, respectivement. La...

Ici, nous présentons l&#39;assemblage de la chimère par récupération du plasmide et l&#39;insertion du site enzymatique de restriction (CAPRRESI), un protocole basé sur l&#39;insertion des sites d&#39;enzymes de restriction dans des séquences d&#39;ADN synonymes et une récupération fonctionnelle du plasmide. Ce protocole est une méthode rapide et peu coûteuse pour fusionner des gènes codant pour des protéines.

CAPRRESI: Assemblage de la chimère par insertion de plasmides et restriction Enzyme Site Insertion

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Ce vidéo montre une procédure appelée Assemblage de chimères par Récupération de Plasmide et Insertion de Sites d'Enzymes de Restriction, ou CAPRRESI, au cours de laquelle deux gènes chimériques sont générés en introduisant des sites spécifiques d'enzymes de restriction dans de l'ADN synonyme, puis en coupant et en échangeant les séquences d'ADN. Dans CAPRRESI, les gènes d'intérêt de type sauvage sont d'abord insérés dans les sites de clonage multiples du même vecteur. Ensuite, les régions de cassure pour chaque gène ayant la même séquence en acides aminés sont sélectionnées, et la région de cassure pour le gène de résistance à l'ampicilline est choisie.Des scripts Perl sont utilisés pour déterminer les séquences synonymes contenant des sites de restriction pour chaque région de cassure. À l'aide d'oligonucléotides spécialement conçus, une PCR est réalisée pour produire quatre fragments complémentaires contenant de l'ADN synonyme avec les sites d'enzyme de restriction souhaités. Les produits de PCR obtenus sont purifiés, digérés, puis ligaturés pour produire une séquence chimérique.Le principal avantage de cette technique est qu'elle facilite les fusions de gènes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie moléculaire, telles que : quelles sont les fonctions de notre protéinase. Commencez cette procédure avec les gènes d'intérêt déjà insérés dans les sites de clonage multiples des vecteurs.Ici, les gènes rpoD et sigA, qui codent pour des facteurs sigma bactériens nécessaires à l'initiation de la synthèse de l'ARN, ont chacun été clonés dans le vecteur pUC18, comme détaillé dans le texte accompagnant. Pour concevoir l'oligonucléotide destiné à produire la protéine chimérique, exécutez d'abord le script Perl translate.pl afin d'obtenir la séquence en acides aminés des gènes rpoD, sigA et ampR.Ensuite, à l'aide du serveur web Muscle, alignez les séquences d'acides aminés de rpoD et de sigA. Pour chaque séquence, sélectionnez une région de cassure présentant la même séquence de trois à six acides aminés. Enregistrez les séquences dans le fichier regions.fas.Ensuite, sélectionnez une séquence de trois à six acides aminés à l'intérieur du gène ampR, puis enregistrez cette séquence dans le fichier regions.fas. Pour déterminer toutes les séquences d'ADN synonymes, exécutez le script Perl synonym.pl. Ensuite, pour identifier les enzymes de restriction qui coupent les séquences synonymes, exécutez le script resynonym.pl.Ensuite, utilisez les séquences d'ADN synonymes pour concevoir des oligonucléotides qui intègrent le même site d'enzyme de restriction dans les régions de cassure de rpoD et de sigA. Concevez un oligonucléotide destiné à interrompre le gène ampR qui intègre un site d'enzyme de restriction différent. Les oligonucléotides directs et inverses se chevaucheront au niveau du site d'enzyme de restriction.Les oligonucléotides doivent avoir une longueur comprise entre 21 et 27 nucléotides et contenir une cytosine ou une guanine ainsi qu'un site de restriction. Un oligonucléotide direct possède la même séquence que sa région cible sur l'ADN matrice. Un oligonucléotide inverse correspond à la séquence complémentaire et inversée de la région cible sur l'ADN matrice.Commander les oligos auprès d'un fournisseur de synthèse d'ADN. Lorsque les oligonucléotides arrivent, utilisez-les pour réaliser une PCR en utilisant les constructions rpoD et sigA sur vecteur pUC18 comme ADN matrice. Cela produira deux fragments complémentaires pour chaque construction.Après la PCR, réalisez une électrophorèse sur gel d'agarose afin de séparer les produits de PCR du modèle d'ADN. La purification des fragments plasmidiques complémentaires est essentielle pour éviter toute contamination par le plasmide parent. Les plasmides parentaux peuvent être éliminés par purification sur gel, comme nous le démontrons ici, ou par digestion à l'aide de l'enzyme de restriction dpn1, qui permet de dégrader les plasmides parentaux.Après l'électrophorèse, colorer le gel avec une solution de bromure d'éthidium. Visualiser les bandes en plaçant le gel coloré dans une chambre à UV à 300 nanomètres. Minimiser au maximum l'exposition du gel.Ensuite, découpez les bandes contenant les produits de PCR et placez-les dans des tubes de microcentrifugeuse. Utilisez un kit pour purifier les échantillons d'ADN, puis effectuez une double digestion sur tous les fragments d'ADN complémentaires à l'aide des enzymes de restriction à digestion rapide appropriées. AFL2 et SPE1 sont utilisés afin de fusionner les parties complémentaires du plasmide.Incuber la réaction de digestion à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, inactiver les enzymes de restriction conformément aux recommandations du fabricant. Par exemple, inactiver AFL2, SPE1 à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes.Ensuite, combiner les fragments d'ADN appropriés avec le tampon de ligature, de l'eau et la ligase T4 de l'ADN. Laisser la réaction de ligature à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes. De cette manière, l'intégrité du gène ampR est restaurée, produisant une protéine fonctionnelle.Après la ligation, transformer des cellules E.Coli DH5 alpha avec trois à cinq microlitres de la réaction de ligation d'assemblage du chimère. Étaler les cellules transformées sur des plaques LB contenant de l'ampicilline, du X-gal et de l'IPTG, puis les incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, sélectionner des colonies blanches de E.Coli transformées et les repiquer en stries sur une nouvelle plaque LB avec ampicilline.Incuber les plaques toute la nuit à 37 degrés Celsius. Pour sélectionner les colonies candidates au séquençage, réaliser une PCR sur colonies. Visualiser les bandes sur un gel d'agarose 2 % en effectuant une électrophorèse comme précédemment.Sélectionnez les colonies candidates présentant une courbure de l'ADN de la taille correcte afin d'ensemencer des cultures. Le lendemain, extrayez l'ADN plasmidique à l'aide d'un kit. Après purification du plasmide, envoyez les échantillons pour séquençage.Les constructions chimériques rpoD sigA ont été générées comme décrit dans cette vidéo. Après le séquençage, l'alignement des gènes de type sauvage et chimériques a été réalisé à l'aide du logiciel muscle. Les séquences des gènes chimériques ont ensuite été assemblées avec le logiciel mura, comme illustré ici.Les séquences synonymes apparaissent en noir et le site AFL2 est souligné. Ces données de séquençage démontrent l'utilisation réussie de la méthode CAPRRESI pour générer des constructions chimériques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée pour fusionner des segments de gènes.

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Apprenez la méthode CAPRRESI pour assembler des gènes chimériques par insertion de sites de restriction dans des séquences synonymes. Cette technique rapide et économique facilite la fusion de gènes codant pour des protéines.

CAPRRESI: Assemblage de la chimère par insertion de plasmides et restriction Enzyme Site Insertion

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