In Vitro Imaging et la quantification de l'efficacité de ciblage des médicaments d'Analogues GnRH marqué par fluorescence

L'objectif général de cette procédure est d'étudier et de prédire l'efficacité des systèmes de délivrance de médicaments basés sur la GnRH dans des cultures cellulaires cancéreuses humaines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thérapie anticancéreuse ciblée, telles que l'efficacité avec laquelle les cellules de différents types de cancers humains internalisent les médicaments anticancéreux ciblés par la GnRH. Le principal avantage de cette méthode réside dans l'utilisation de nouveaux analogues de la GnRH marqués par un fluorochrome, permettant une analyse simultanée par microscopie confocale et cytométrie en flux.

Les implications de cette technique s'étendent vers la thérapie anticancéreuse, car les récepteurs de la GnRH sont fortement exprimés sur plusieurs types de cellules cancéreuses, permettant ainsi leur ciblage sélectif. Bianka Gurbi, étudiante au doctorat de mon laboratoire, démontrera la procédure. Commencez par retirer le milieu cultivé de chacun des sept puits d'une lame microscopique ensemencée.

Ensuite, ajoutez 250 microlitres du milieu complet préchauffé dans le puits du témoin négatif et 250 microlitres du milieu de trempage contenant la GnRH préchauffé dans chacun des six puits restants. Incubez la lame dans une étuve à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant cinq heures. Après cinq heures d'incubation, aspirez le milieu de chaque puits et lavez les cellules avec 250 microlitres de PBS.

Ensuite, ajouter 250 microlitres de solution de fixation dans chaque puits et incuber la lame à température ambiante pendant 10 minutes. Une fois les cellules fixées, éliminer la solution de fixation et laver les cellules avec 250 microlitres de PBS. Ajouter 250 microlitres de solution de sonde fluorescente à cinq micromolaire préparée dans du PBS dans chaque puits et incuber la lame à température ambiante pendant 10 minutes.

Après avoir retiré la solution de sonde fluorescente, lavez soigneusement les cellules deux fois avec 250 microlitres de PBS. Enfin, ajoutez trois à quatre gouttes de milieu de montage dans chaque puits. Conservez la lame à l’abri de la lumière à température ambiante jusqu’à son observation au microscope.

Retirer le milieu cultivé de chacun des cinq puits d'une lame microscopique semée. Ensuite, ajouter 250 microlitres du milieu complet préchauffé au puits du témoin négatif et au deuxième puits contenant les cellules non traitées. Prétraiter les cellules des trois puits restants avec les milieux de traitement préchauffés contenant 10 micromolaire de GnRH marquée par la fluorescéine (FITC).

Incuber la lame dans une étuve à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Ensuite, retirer uniquement le milieu des cellules traitées et laver les cellules avec 250 microlitres de milieu complet préchauffé. Puis, retirer le milieu de lavage.

Ensuite, ajoutez 250 microlitres du milieu complet préchauffé dans chacun des trois puits. Incubez la lame dans une étuve à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant une heure. Après l'incubation, éliminez les milieux des cinq puits et lavez les cellules avec 250 microlitres de PBS.

Ensuite, retirez le PBS et fixez les cellules avec 250 microlitres de solution de fixation à température ambiante pendant 10 minutes. Puis, jetez la solution de fixation et lavez les cellules avec 250 microlitres de PBS. Ajoutez 250 microlitres de solution de blocage dans chaque puits et incubez la lame à température ambiante pendant une heure.

Aspirez la solution de blocage de chaque puits, sauf du témoin négatif. Après avoir lavé les cellules avec 250 microlitres de PBS, ajoutez 250 microlitres de solution d'anticorps primaire dans chaque puits. Incubez la lame à température ambiante pendant une heure, à l'abri de la lumière.

Retirer les solutions de chacun des cinq puits et laver les cellules avec 250 microlitres de PBS. Ensuite, retirer le PBS et ajouter 250 microlitres de solution d'anticorps secondaire. Incuber la lame à température ambiante pendant une heure à l'abri de la lumière.

Aspirez la solution de chaque puits et lavez les cellules avec 250 microlitres de PBS. Éliminez le PBS de lavage, puis ajoutez 250 microlitres de PBS contenant une sonde fluorescente à cinq micromolaire dans chaque puits. Incubez la lame pendant 10 minutes à température ambiante.

Retirer la solution de sonde fluorescente de chaque puits et laver soigneusement les cellules deux fois avec 250 microlitres de PBS. Enfin, ajouter trois à quatre gouttes de milieu de montage dans chaque puits. Conserver la lame à l'abri de la lumière à température ambiante jusqu'à observation au microscope.

Observer les cellules au microscope confocal à balayage laser inversé. Activer les lasers de 488 nanomètres et de 633 nanomètres. Vérifier l'amplification du laser et la taille du diaphragme.

Imager l'échantillon témoin négatif. Optimiser le signal observé pour le noyau et ajuster les signaux de FITC et d'Alexa 546 de manière à ce qu'ils soient proches de zéro. Ensuite, en utilisant les mêmes paramètres, imager les échantillons traités.

Jetez le milieu complet des sept puits d'une plaque de culture ensemencée. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu complet préchauffé dans le puits du témoin négatif et un millilitre des milieux de traitement préchauffés dans les six puits restants. Incubez la plaque dans une étuve à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant cinq heures.

Après avoir éliminé le milieu de tous les puits, laver soigneusement les cellules deux fois avec deux millilitres de PBS. Retirer le PBS, puis ajouter 500 microlitres de solution de trypsine-EDTA dans chaque puit. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius jusqu'au détachement des cellules, ce qui prendra environ 10 minutes.

À l’aide d’un millilitre de milieu complet, neutralisez la trypsine dans chaque puits et agitez la plaque. Ensuite, mettez les cellules en suspension par pipetage doux. Transférez les suspensions dans des tubes FACS séparés et centrifugez les échantillons à 150 ×g à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes.

Versez délicatement les surnageants. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de PBS glacé dans chaque tube FACS et resuspendez doucement les cellules. Conservez les tubes sur de la glace jusqu'à l'analyse par cytométrie en flux.

On présente ici l'analyse de l'absorption de GnRH par des cellules de carcinome du pharynx. Un traitement de cinq heures avec un micromolaire de complexe fluorescent de GnRH a entraîné une absorption faible mais discernable, manifestée par un signal fluorescent vert localisé dans les cellules cancéreuses du pharynx. Une augmentation supplémentaire de la dose du complexe a conduit à une absorption accrue, démontrant la dépendance à la dose de l'absorption de GnRH dans les cellules de carcinome du pharynx.

L'absorption dépendante du récepteur de la GnRH et la distribution cellulaire du ligand avec son récepteur dans les cellules cancéreuses du poumon ont été analysées par un traitement simultané avec un complexe fluorescent de GnRH et une coloration du récepteur de type un de la GnRH ainsi que des noyaux. Les résultats montrent que le récepteur de type un de la GnRH est associé à la membrane cellulaire, tandis que la protéine de la GnRH est internalisée dans les cellules et reste dans leur cytoplasme. L'absorption de la GnRH dans les cellules de carcinome du pharynx a également été étudiée par analyse FACS.

Les résultats montrent que l'absorption de GnRH observée lorsque les cellules étaient traitées avec un micromolaire de conjugué de GnRH était fortement augmentée lorsque la dose appliquée aux cellules était portée à 10 micromolaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à protéger les échantillons traités et les colorants fluorescents de la lumière directe.

Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que les tests de viabilité cellulaire ou d'apoptose, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'efficacité avec laquelle le médicament ciblant la GnRH peut inhiber la croissance d'un type de cancer donné. Suite à ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la thérapie anticancéreuse pour explorer l'efficacité des systèmes de délivrance de médicaments basés sur la GnRH sur les cellules cancéreuses adhérentes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser ces conjugués de GnRH marqués par fluorescence pour étudier la sensibilité des cellules cancéreuses aux thérapies ciblant la GnRH.