In Vitro Imaging et la quantification de l'efficacité de ciblage des médicaments d'Analogues GnRH marqué par fluorescence

L’objectif global de cette procédure est d’étudier et de prédire l’efficacité des systèmes d’administration de médicaments basés sur la GnRH dans les cultures de cellules cancéreuses humaines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thérapie anticancéreuse ciblée, telles que l’efficacité avec laquelle les cellules de différents types de cancer humain absorbent les médicaments anticancéreux ciblés sur la GnRH. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle utilise de nouveaux analogues de la GnRH marqués par fluorescence qui permettent l’utilisation simultanée de la microscopie confocale et de l’analyse par cytométrie en flux.

Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie anticancéreuse car les récepteurs de la GnRH sont fortement exprimés sur plusieurs types de cellules cancéreuses, ce qui permet de les cibler de manière sélective. La démonstration de la procédure sera faite par Bianka Gurbi, une étudiante au doctorat de mon laboratoire. Pour commencer, retirez le milieu de culture de chacun des sept puits d’une lame microscopique ensemencée.

Ensuite, ajoutez 250 microlitres du milieu complet préchauffé dans le puits de contrôle négatif et 250 microlitres du milieu de traitement des semences préchauffé à la GnRH dans chacun des six puits restants. Incuber la lame dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq heures. Après cinq heures d’incubation, aspirez le milieu de chaque puits et lavez les cellules avec 250 microlitres de PBS.

Ensuite, ajoutez 250 microlitres de solution de fixation dans chaque puits et incubez la lame à température ambiante pendant 10 minutes. Une fois les cellules fixées, jetez la solution de fixation et lavez les cellules avec 250 microlitres de PBS. Ajoutez 250 microlitres de solution de sonde fluorescente à cinq micromolaires préparée dans du PBS dans chaque puits et incubez la lame à température ambiante pendant 10 minutes.

Après avoir retiré la solution de sonde fluorescente, lavez soigneusement les cellules deux fois avec 250 microlitres de PBS. Enfin, ajoutez trois à quatre gouttes de milieu de montage dans chaque puits. Conservez la lame dans l’obscurité à température ambiante jusqu’à ce qu’elle soit imagée au microscope.

Retirer le milieu de culture de chacun des cinq puits d’une lame microscopique ensemencée. Ensuite, ajoutez 250 microlitres du milieu complet préchauffé dans le puits de contrôle négatif et dans le deuxième puits avec les cellules non traitées. Prétraiter les cellules dans les trois puits restants avec le milieu de traitement préchauffé contenant 10 micromolaires de GnRH FITC.

Incuber la lame dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Ensuite, retirez le milieu uniquement des cellules traitées et lavez les cellules avec 250 microlitres du milieu complet préchauffé. Ensuite, retirez le produit de lavage.

Ensuite, ajoutez 250 microlitres du milieu complet préchauffé dans chacun des trois puits. Incuber la lame dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Après l’incubation, jetez le milieu des cinq puits et lavez les cellules avec 250 microlitres de PBS.

Ensuite, retirez le PBS et fixez les cellules avec 250 microlitres de solution de fixation à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, jetez la solution de fixation et lavez les cellules avec 250 microlitres de PBS. Ajoutez 250 microlitres de solution de blocage dans chaque puits et incubez la lame à température ambiante pendant une heure.

Aspirer la solution de blocage de chaque puits, à l’exception du témoin négatif. Après avoir lavé les cellules avec 250 microlitres de PBS, ajoutez 250 microlitres de solution d’anticorps primaires dans chaque puits. Incuber la lame à température ambiante pendant une heure dans un endroit sombre.

Retirez les solutions de chacun des cinq puits et lavez les cellules avec 250 microlitres de PBS. Ensuite, retirez le PBS et ajoutez 250 microlitres de solution d’anticorps secondaire. Incuber la lame à température ambiante pendant une heure dans l’obscurité.

Aspirez la solution de chaque puits et lavez les cellules avec 250 microlitres de PBS. Retirez le PBS de lavage, puis ajoutez 250 microlitres de PBS contenant cinq sondes fluorescentes micromolaires dans chaque puits. Incuber la lame pendant 10 minutes à température ambiante.

Retirez la solution de sonde fluorescente de chaque puits et lavez soigneusement les cellules deux fois avec 250 microlitres de PBS. Enfin, ajoutez trois à quatre gouttes de milieu de montage dans chaque puits. Conservez la lame dans l’obscurité à température ambiante jusqu’à ce qu’elle soit imagée au microscope.

Imagez les cellules à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser inversé. Allumez les lasers de 488 nanomètres et de 633 nanomètres. Vérifiez l’amplification laser et la taille du sténopé.

Imagez l’échantillon de contrôle négatif. Optimisez le signal observé pour le noyau et ajustez le signal de FITC et d’Alexa 546 pour qu’il soit proche de zéro. Puis, en utilisant les mêmes paramètres, imager les échantillons traités.

Jetez le milieu complet des sept puits d’une plaque de culture ensemencée. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu complet préchauffé dans le puits de contrôle négatif et un millilitre de milieu de traitement préchauffé dans les six puits restants. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq heures.

Après avoir jeté le milieu de tous les puits, lavez soigneusement les cellules deux fois avec deux millilitres de PBS. Retirez le PBS, puis ajoutez 500 microlitres de solution de trypsine EDTA dans chaque puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules se détachent, ce qui prendra environ 10 minutes.

À l’aide d’un millilitre de milieu complet, neutralisez la trypsine dans chaque puits et secouez la plaque. Ensuite, suspendez les cellules par un pipetage doux. Transférez les suspensions dans des tubes FACS séparés et centrifugez les échantillons à 150 fois G à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes.

Décantez soigneusement les surnageants. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de PBS glacé dans chaque tube FACS et remettez doucement les cellules en suspension. Conservez les tubes sur de la glace jusqu’à ce qu’ils soient analysés par FACS.

L’analyse de l’absorption de la GnRH dans les cellules de carcinome du pharynx est présentée ici. Un traitement de cinq heures avec une micromolaire d’un complexe fluorescent de GnRH a entraîné un apport léger, mais distinct, se manifestant par un signal fluorescent vert localisé dans les cellules cancéreuses du pharynx. Une augmentation supplémentaire de la dose complexe a conduit à une meilleure absorption, démontrant une dépendance à la dose de l’absorption de la GnRH dans les cellules de carcinome du pharynx.

L’absorption de la GnRH dépendante du récepteur et la distribution cellulaire du ligand dans son récepteur dans les cellules cancéreuses du poumon ont été analysées par traitement simultané avec un complexe fluorescent de GnRH et une coloration du récepteur de la GnRH de type un et des noyaux. Les résultats montrent que le récepteur de la GnRH de type un est associé à la membrane cellulaire tandis que la protéine GnRH est internalisée dans les cellules et reste dans leur cytoplasme. L’absorption de la GnRH dans les cellules de carcinome du pharynx a également été étudiée à l’aide de l’analyse FACS.

Les résultats montrent que l’absorption de GnRH observée lorsque les cellules ont été traitées avec une micromolaire de conjugué de GnRH était fortement augmentée lorsque la dose appliquée aux cellules était augmentée à 10 micromolaires. Une fois maîtrisée, cette technique peut être terminée en huit heures si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de protéger les échantillons traités et les colorants fluorescents de la lumière directe.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que les tests de viabilité cellulaire ou d’apoptose peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’efficacité avec laquelle le médicament ciblé par la GnRH peut inhiber la croissance d’un type de cancer donné. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la thérapie anticancéreuse pour explorer l’efficacité des systèmes d’administration de médicaments basés sur la GnRH dans les cellules cancéreuses adhérentes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser ces conjugués de GnRH marqués par fluorescence pour explorer la sensibilité des cellules cancéreuses aux thérapies ciblées sur la GnRH.