Le modèle WinCF - Un microcosme peu coûteux et abordable d'une menthe bronchée à mousqueton pour étudier la microbiologie des infections pulmonaires

L'objectif général de cette procédure est de reproduire l'environnement pulmonaire et de cultiver des agents pathogènes de manière plus proche de celle dans laquelle ils provoquent la maladie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie des voies respiratoires, telles que la façon dont des agents pathogènes bactériens divers interagissent dans un poumon atteint de fibrose kystique. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une manipulation facile des conditions expérimentales.

Pour observer les réponses microbiennes de manière similaire à ce qu'elles seraient dans un bronche pulmonaire réel. La procédure sera démontrée par Will Comstock de notre laboratoire. Pour préparer le milieu de crachats artificiel, mélanger 16 millilitres de solution mère de muceum préparée précédemment, 2 millilitres de solution mère de chlorure de potassium, 2 millilitres de solution mère de chlorure de sodium, 200 microlitres d'émulsion de jaune d'œuf, 5,6 millilitres de solution mère d'ADN, 120 microlitres de solution mère de ferritine, 5,78 millilitres de solution d'acides aminés essentiels, 5,78 millilitres de solution d'acides aminés non essentiels et 2,44 millilitres d'eau stérile.

La préparation minutieuse d'un milieu artificiel stérile de crachats est extrêmement importante. En effet, toute contamination peut modifier l'activité bactérienne dans les capillaires incubés par la suite. Après avoir doucement agité pour homogénéiser, prélevez à la pipette cinq millilitres du milieu et répartissez-les dans huit tubes stériles de 15 millilitres.

Le milieu peut désormais être modifié afin d'obtenir les conditions chimiques souhaitées. Par exemple, les milieux présentés ici ont vu leur PH modifié et des colorants ajoutés afin de refléter leurs différentes acidités. Ensuite, sous une hotte biologique stérile, ajouter 900 microliters de milieu dans chacun des huit tubes stériles de 1,5 millilitre.

Homogénéisez les échantillons de crachats préalablement obtenus en utilisant une seringue de trois millilitres pour prélever et rejeter à plusieurs reprises le crachat jusqu'à l'obtention d'une consistance lisse. Ajoutez 100 microlitres de crachat homogénéisé dans chacun des huit tubes de microcentrifugation. Ensuite, vortexez les tubes pour bien mélanger.

Étiquetez huit autres tubes stériles de centrifugation de 15 millilitres selon les tubes microcentrifuge contenant le milieu précédemment préparé. Ce seront les tubes d'incubation. Utilisez une solution d'éthanol à 70 % pour stériliser une serviette en papier et laissez-la sécher.

Déchirez la serviette en morceaux d'environ quatre pouces carrés chacun. Ensuite, froissez un morceau au fond de chaque tube d'incubation. Avec un amas de papier au fond de chaque tube d'incubation, utilisez 1 millilitre d'eau stérile pour humidifier légèrement chaque amas afin de créer un environnement humide à l'intérieur du tube.

Pour chaque tube de milieu, remplir trois tubes capillaires en verre avec le milieu en tenant une extrémité du tube dans le milieu et en l'inclinant horizontalement, en laissant l'action capillaire guider le milieu à l'intérieur du tube. Arrêter le remplissage en plaçant doucement un doigt ganté sur l'extrémité ouverte du tube, puis sceller l'autre extrémité du tube en l'enfonçant dans un bloc de mastic scellant capillaire.

Placer chaque ensemble de trois tubes capillaires dans des tubes d'incubation de 15 millilitres, scellés avec de la pâte et orientés vers le bas. Ensuite, boucher les tubes et s'assurer qu'ils sont étiquetés. Ces trois tubes capillaires servent à la réplication de chaque condition témoin.

Lorsque tous les tubes d'incubation sont remplis de leurs tubes capillaires désignés, placer les porte-tubes à 37 degrés Celsius de manière à ce que les tubes soient incubés horizontalement afin que tout gaz produit ne s'échappe pas par l'extrémité ouverte. Incuber les tubes pendant 48 heures.

Retirer les tubes de l’incubateur en veillant à les maintenir horizontaux. Extraire délicatement les tubes capillaires des tubes d’incubation, en gardant chaque ensemble de trois séparé des autres ensembles. Disposer les tubes capillaires côte à côte sur une boîte lumineuse, parfaitement alignés afin que le contenu des tubes soit visible et éclairé par en dessous.

Tissez un espace tous les trois tubes afin de séparer les différentes conditions chimiques. Ensuite, focalisez la caméra directement au-dessus des tubes de manière à ce que tous les tubes soient visibles dans le champ de vision, et à ce que la lumière provenant de la boîte lumineuse assure un contraste suffisant et une bonne visualisation de la couleur des colorants présents dans les tubes. Pour extraire le contenu des tubes en vue d'une analyse ultérieure, retirez un jeu de capillaires en triplicat de la boîte lumineuse à la fois. Insérez une aiguille de calibre 25 de 0,5 pouce à extrémité émoussée dans l'extrémité bouchée du tube capillaire afin de rompre le scellement.

Ensuite, retourner le tube capillaire à l’envers pour permettre au milieu de s’écouler de la partie supérieure vers un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Si le milieu ne s’écoule pas, utiliser une pipette de 200 microlitres pour expulser le milieu du tube en appuyant sur le piston de la pipette lorsqu’il est inséré dans l’extrémité du tube capillaire. Comme illustré ici, lorsqu’aucun échantillon de crachats n’a été ajouté au milieu, le seul changement observé sur l’ensemble du spectre de pH après 48 heures d’incubation a été une légère diminution du volume du milieu, résultant d’une évaporation mineure.

Les tubes capillaires inoculés ont montré des changements de volume, l'apparition de bulles de gaz, une coloration modifiée et la formation de dépôts opaques. Ces résultats montrent que les bactéries et autres micro-organismes présents dans le crachat ajouté sont capables de croître et d'évoluer dans le milieu artificiel. Après incubation, d'autres méthodes telles que la métabolomique et le séquençage de l'ADN peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires concernant le comportement des micro-organismes qui se développent dans les tubes capillaires.

Le système winCF est une nouvelle méthode permettant d'étudier l'activité du microbiome pulmonaire ; importante pour de nombreuses maladies, notamment la mucoviscidose, la BPCO, l'asthme et d'autres affections.