Name: Le modèle WinCF - Un microcosme peu coûteux et abordable dune menthe bronchée à mousqueton pour étudier la microbiologie des infections pulmonaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Découvrez le système WinCF pour étudier la microbiologie pulmonaire en simulant l'environnement des bronchioles obstruées par le mucus. Cette méthode permet d'analyser les interactions microbiennes dans la mucoviscidose et autres maladies respiratoires chroniques.

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Les auteurs souhaitent remercier Vertex Pharmaceuticals et le Cystic Fibrosis Research Innovation Award pour le financement de R. Quinn et du NIH / NIAID pour le financement de la subvention 1 U01 AI124316-01, une approche de la biologie des systèmes pour le traitement des agents pathogènes résistant aux multiples médicaments. Nous tenons également à remercier le Département de l&#39;ingénierie mécanique et aérospatiale du cours de conception senior de génie mécanique de premier cycle de l&#39;UCSD pour faciliter la collaboration avec les aspects techniques de ce travail.

1. Préparation des stocks pour l&#39;expectoration artificielle médias <ol><li> Créer une solution de 5% de mucine. Ajouter 1,0 g d&#39;estomac de porc déshydraté mucine à 20 ml d&#39;eau déminéralisée. Autoclaver la solution résultante. REMARQUE: La stérilisation mucine détruira sa structure inhérente; d&#39;autres méthodes pour stériliser les mucine sous sa forme sèche comprennent la stérilisation UV et irradiation. Ces méthodes ne sont pas largement utilisées pour le système WinCF cependant. </li><li> Ajouter 2,2 g de KCI à 50 ml d&#39;eau déminéralisée et permettre la dissolution. Ajouter 5,0 g de NaCl à 50 ml d&#39;eau déminéralisée et permettre la dissolution. Ces deux solutions autoclaver. </li><li> Ajouter 100 mg d&#39;ADN de sperme de saumon à 10 ml d&#39;eau déminéralisée stérile. Chauffer cette solution à environ 85 ° C dans un bain d&#39;eau pendant quelques heures pour assurer la dissolution. </li><li> Ajouter 5,0 mg de ferritine à 5,0 ml d&#39;eau déminéralisée stérile. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;expectoration artificielle moyen <ol><li> Combinerles composants suivants: 16 ml de mucine solution mère, 2,0 mL de solution mère de KCl, 2,0 ml de solution mère de NaCl, 200 pl de l&#39;émulsion de jaune d&#39;oeuf, 5,6 ml d&#39;ADN de la solution mère, 120 uL de solution mère ferritine, 5,78 ml d&#39;essentiel solution d&#39;acides aminés, 5,78 ml d&#39;une solution d&#39;acides aminés non essentiels, et 2,44 mL d&#39;eau stérile. <ol><li> Si de petites quantités de sédiments apparaissent, mélanger délicatement. </li><li> Pipeter 5,0 ml de milieu dans huit tubes de centrifugation stériles de 15 mL. REMARQUE: peut être manipulé comme on le souhaite, les conditions chimiques de chaque tube. Par exemple, des solutions tampons et des indicateurs de pH peuvent être ajoutés à chaque tube dans le but de comparer le comportement microbien à des niveaux de pH distincts. Une démonstration de ceci est montré dans la section des résultats représentatifs avec 8 niveaux de pH différents, de 5,0 à 8,5 en incréments de 0,5 de pH. </li></ol></li><li> Une fois que les conditions chimiques des médias sont manipulés avec succès, gel pour une utilisation ultérieure. Les médias demeurera stable FROZen à -20 ° C pendant plusieurs mois. Vortex lors de la décongélation. </li></ol> 3. Préparation d&#39;une course de contrôle des tubes capillaires <ol><li> Dans une bio-vie stérile, remplissez huit tubes microcentrifuges stériles avec 250 μL de milieu chacun. </li><li> Acquérir huit tubes stériles de centrifugation 15 mL, chaque tube correspondant à un tube de microcentrifugeuse mentionné à l&#39;étape 3.1. <ol><li> Stériliser une serviette en papier avec une solution d&#39;éthanol à 70% et laisser sécher. Une fois sec, déchirez la serviette en morceaux d&#39;environ quatre pouces carrés chacun, et froisser chaque pièce dans le fond d&#39;un tube de centrifugation de 15 mL. Pour des tubes supplémentaires, vaporiser et sécher des serviettes en papier supplémentaires au besoin. </li><li> Avec un morceau de papier au bas de chaque tube de centrifugation, humectez légèrement chaque groupe de papier avec environ 1,0 ml d&#39;eau stérile pour créer un environnement humide. </li></ol></li><li> Obtenez trois tubes capillaires en verre pour chaque tube de microcentrifugeuse préparé à l&#39;étape 3.1 et un bloc de mastic de tube capillaire sealaNT. </li><li> Pour chaque tube de microcentrifugeuse, remplissez trois tubes capillaires avec un support à environ 5 mm du marqueur bleu près du haut du tube. <ol><li> Remplissez en tenant une extrémité du tube dans le tube de microcentrifugeuse et basculant vers l&#39;orientation horizontale, ce qui permet une action capillaire pour guider le milieu dans le tube (voir la figure 1 ). </li><li> Arrêtez le remplissage en plaçant doucement un doigt ganté sur l&#39;extrémité ouverte du tube, puis scellez l&#39;autre extrémité du tube en le pressant vers le bas dans le bloc d&#39;étanchéité. </li></ol></li><li></li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig1.jpg" /> Figure 1: Exemple de dégradé du pH, remplissage du tube capillaire avec un mélange de sputum artificiel. Le milieu est ajouté en insérant une extrémité du tube dans le liquide et en basculant pour faciliter l&#39;action capillaire. La coloration moyenne dans cet exemple est due à l&#39;ajout d&#39;un indicateur de pH pour aider le démonStrate des changements potentiels d&#39;acidité après incubation. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <ol start="5"><li> Placez chaque ensemble de trois tubes capillaires dans des tubes de centrifugation de 15 mL remplis de papier absorbant complètement avec de l&#39;eau stérile, avec un joint étanche au mastic vers le bas. Capter le tube et l&#39;étiquette. Ces trois tubes capillaires sont destinés à la replication de chaque condition de contrôle. </li><li> Lorsque tous les tubes de centrifugation de 15 ml sont remplis avec leurs tubes capillaires désignés, placez les tubes dans un support. Placez la crémaillère pour que les tubes soient incubés horizontalement (pour attraper les bulles de gaz) (voir la figure 2 ). Incuber les tubes capillaires à l&#39;intérieur des tubes de centrifugation (contenant les agglomérats humidifiés) à 37 ° C pendant 48 h. </li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig2.jpg" /> Figure 2: Exemple de gradient de pH, tubes capillaires prêts à être incubés. Une fois que trois tubes capillaires ont été remplis et scellés, ils sont placés dans un tube centrifuge avec une serviette en papier humide en bas. Ce tube est ensuite plafonné et mis dans un rack. La crémaillère doit être orientée latéralement pendant l&#39;incubation, telle que représentée ici, de sorte que la production de gaz puisse être observée une fois l&#39;incubation terminée. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 4. Imagerie des tubes capillaires de contrôle après incubation <ol><li> Retirez la crémaillère des tubes centrifuges de l&#39;incubateur, en vous assurant de garder les tubes à l&#39;horizontale. Faites glisser avec précaution les tubes capillaires hors des tubes centrifuges, en gardant chaque ensemble séparé des autres ensembles. </li><li> Disposez les tubes capillaires l&#39;un à côté de l&#39;autre sur une boîte à lumière, tous alignés afin que le contenu des tubes soit visIble et éclairé. Laissez un espace tous les trois tubes pour séparer différentes conditions chimiques. </li><li> Avec les tubes alignés et la boîte lumineuse allumée, photographiez directement depuis. (Voir la figure 3 ) </li></ol><img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig3.jpg" /> Figure 3: Exemple de gradient de pH, contrôle, pré-incubation, absence de Sputum. Méthode de crachat artificiel après avoir été ajoutée à des tubes capillaires dans des ensembles de trois, augmentant de pH de gauche à droite. La combinaison d&#39;indicateurs ajoutés au milieu entraîne l&#39;apparition de plus de tubes acides, tandis que les tubes moins acides deviennent plus violet. Les tubes sont disposés horizontalement et sont éclairés par le bas, photographiés par le haut. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <ol start="4"><li> Éliminer leles matériaux de contrôle de déchets biologiques. </li></ol> 5. inoculer le Tubes Capillaire WinCF avec un échantillon d&#39;expectoration <ol><li> Dans un biohood stérile, remplir huit tubes de microcentrifugation stériles avec 225 pl de chaque support. </li><li> Homogénéiser l&#39;échantillon de crachat par le retrait et l&#39;éjection de l&#39;expectoration à plusieurs reprises avec une seringue de 3 ml (une seringue en plastique sans l&#39;aiguille). Pour ce faire, jusqu&#39;à ce que le crachat est de consistance lisse. </li><li> Ajouter 25 pl de crachat homogénéisé à chaque tube de microcentrifugation (1/10 de dilution dans ASM médias) préparé à l&#39;étape 5.1. Ensuite, les tubes vortex pendant 30 s pour mélanger suffisamment. </li><li> Ajouter le support à tubes capillaires selon la même procédure que les étapes 3.2 à 3.5. </li></ol> 6. L&#39;imagerie de l&#39;échantillon Capillary Tubes après incubation <ol><li> Après le temps d&#39;incubation de 48 h, retirer l&#39;image et les tubes capillaires suivant la même procédure que les étapes 4.1 à 4.3. </li><li> Si des bulles sont présentes dans les tubes, faireBien sûr, les photographies prises représentent clairement la délimitation entre les bulles et les milieux dans les tubes. Si le biofilm est présent, assurez-vous que les photographies peuvent clairement représenter sa présence ainsi. </li></ol> 7. Suppression des supports pour les applications en aval <ol><li> Pour faciliter l&#39;analyse en aval, retirez le support des tubes capillaires après l&#39;imagerie. Les applications potentielles comprennent la culture et le séquençage ADN / ARN et le profil métabolomique. Attention: Les tubes capillaires en verre remplis de pathogènes sont un danger biologique important, ces étapes doivent donc être faites avec beaucoup d&#39;attention avec des équipements spécifiques. Si les tubes capillaires se cassent, jetez le contenant approprié. </li><li> Utilisez des aiguilles à extrémités émoussées de calibre 25 et 0,5 pouce de longueur pour enlever le support. Insérez l&#39;aiguille à extrémités émoussées dans l&#39;extrémité bouchée du tube pour briser le joint. </li><li> Après avoir cassé le joint d&#39;étanchéité, tournez le tube capillaire à l&#39;envers et le support tombera de la partie supérieure. jeSi les médias ne s&#39;égouttent pas facilement, utilisez une pipette avec une pointe de 200 μL et expulsez le support du tube en appuyant sur le piston de la pipette lorsqu&#39;il est inséré dans l&#39;extrémité du tube capillaire. Recueillir le milieu du tube expulsé dans un récipient approprié (tube de centrifugation de 1,5 ml). REMARQUE: pour les analyses transcriptomiques ou d&#39;autres ARN, les médias peuvent être expulsés directement dans des tampons de stabilisation d&#39;ARN. </li></ol> 8. Le système WinFF FLUD REMARQUE: Le système WinFF Fluid Load Utility Device (FLUD) est une suite optionnelle de périphériques complémentaires conçus pour optimiser le débit du système WinCF. Le système WinCF FLUD comprend principalement des matériaux imprimables en 3D. La fabrication imprimée 3D permet un remplacement rapide et facile des matériaux pour assurer un temps d&#39;arrêt minimal pour les chercheurs ainsi que des exigences de fabrication minimales. Les dessins, les fichiers stl, les instructions d&#39;impression 3D et le manuel WinCF FLUD sont disponibles dans le souplé en ligneNT. <ol><li> Préparation des supports pour le chargement du tube capillaire <ol><li> Dans une bioité stérile, remplissez huit tubes stériles de microcentrifugeuse de 2 mL avec 900 μL de milieu chacun. </li><li> Homogénéiser tous les échantillons de crachats en retirant et en éjectant plusieurs fois l&#39;éprouvette avec une seringue de 3 mL (une seringue plastique sans aiguille). Faites ceci jusqu&#39;à ce que l&#39;expectoration soit de consistance lisse. </li><li> Ajouter 100 μl d&#39;expectoration homogénéisée à chaque tube de microcentrifugeuse (dilution 1/10 dans le milieu) préparé à l&#39;étape 8.1.1. Ensuite, tourbillonner les tubes pendant 30 s pour mélanger suffisamment. </li><li> Branchez les tubes de microcentrifugeuse remplis et ouverts dans le support du tube rotatif orientés de sorte que les tubes soient verticaux. </li></ol></li><li> Placement de tubes capillaires <ol><li> Récupérer trois tubes capillaires pour chaque tube de microcentrifugeuse à l&#39;étape 8.1. </li><li> Branchez trois tubes dans le berceau en caoutchouc afin qu&#39;ils soient alignés avec les tubes à microcentrifuges à l&#39;autre extrémité de l&#39;appareil.Assurez-vous que les extrémités marquées des tubes sont éloignées des tubes de microcentrifugeuse. Monter les trois trous sur le fond du berceau correctement sur les trois goujons sur le support du berceau. </li><li> Avec les tubes capillaires placés reposant dans leurs canaux de guidage sur l&#39;appareil, placez le tampon en caoutchouc sur leurs sections de sécurité de manière sécurisée pour éviter tout déplacement. (Voir la figure 4 ) </li></ol></li></ol><img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig4.jpg" /> Figure 4: Le système FLUD entièrement chargé avec des tubes capillaires sécurisés par le caoutchouc en caoutchouc au dessus de leurs socles. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <ol start="3"><li> Chargement des médias dans les tubes capillaires <ol><li> Utilisez avec soin une main pour saisir la fin de l&#39;appareil où les tubes capillaires sontADED, et utiliser l&#39;autre main pour tenir la crémaillère des rotateurs dans lequel les tubes de microcentrifugeuse sont chargés. </li><li> Délicatement tourner la crémaillère de microcentrifugation de sorte que les tubes de microcentrifugeuse sont à peu près horizontal et procéder à pousser lentement la crémaillère vers les tubes capillaires. (Voir la figure 5) </li><li> Lorsque les extrémités des tubes capillaires en contact avec les médias dans les microtubes, assurez-vous que l&#39;action capillaire commence immédiatement le remplissage des tubes capillaires. Pour régler le taux de remplissage et le niveau de remplissage, tourner doucement l&#39;appareil dans son ensemble. Tout en faisant cela, faites attention à ne pas renverser les médias sur des microtubes. (Voir la figure 6) </li><li> Lorsque les tubes capillaires sont remplis à des niveaux souhaités, placer le niveau de l&#39;appareil sur une surface et soigneusement encore rapidement tirer la grille des tubes de microcentrifugation les extrémités des tubes capillaires pour faire cesser le remplissage. Les microtubes peuvent maintenant être rétractés tout le chemin du retour à la position verticale et fermée. </li><li> Sceller les extrémités en saillie des tubes capillaires en appuyant sur un bloc d&#39;étanchéité sur chaque ensemble triplé, en scellant un ensemble à la fois jusqu&#39;à ce que tous les ensembles soient scellés. Pour réduire le risque de contamination, appuyez sur une partie différente du bloc d&#39;étanchéité sur chaque ensemble triplé (voir Figure 7 ). </li></ol></li></ol><img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig5.jpg" /> Figure 5: Le système FLUD avec des tubes moyens déployés dans une orientation horizontale, prêt à prendre contact avec des tubes capillaires. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig6.jpg" /> Figure 6: Le système FLUD avec les tubes capillaires Chargement avec les médias via l&#39; action capillaire. </strOng&gt; <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig6large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig7.jpg" /> Figure 7: étanchéité des tubes capillaires remplis sur le système FLUD Un ensemble triplé à la fois à l&#39;aide d&#39;un bloc scellant. Ce bloc d&#39;étanchéité avait du plastique le long des bords qui a été coupé afin d&#39;éviter tout contact avec les ensembles de tri triés voisins pendant l&#39;étanchéité. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig7large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <ol start="4"><li> Incubation <ol><li> Retirez le tampon en caoutchouc sur les socles du tube et soulevez le berceau en caoutchouc de l&#39;appareil principal. Cela devrait prendre tous les tubes capillaires avec elle. Réglez maintenant le berceau et les tubes sur le support d&#39;image. Ce raCk a trois talons qui s&#39;insèrent dans le berceau, ainsi que de petits canaux de guidage pour mettre les tubes en place. </li><li> Réglez la grille d&#39;imagerie dans son ensemble dans la boîte d&#39;incubation en plastique transparent. Faire tremper de petites quantités de serviettes en papier stérile dans de l&#39;eau stérile et placer le long des deux côtés plus courts de la boîte pour assurer l&#39;humidité pendant l&#39;incubation. (Voir la figure 8 ) </li><li> Fermez complètement la boîte et placez-la dans un incubateur de 37 ° C, en vous assurant de garder les tubes horizontaux. Incuber pendant 48 h. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig8.jpg" /> Figure 8: Tubes capillaires en berceau en caoutchouc transférés du système FLUD à un rack d&#39;imagerie, qui a été placé dans une boîte d&#39;incubation claire à côté des serviettes en papier humide pour fournir de l&#39;humidité. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig8large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une plus grande version de</a>Est une figure. <ol start="5"><li> Imagerie et extraction <ol><li> Retirez la grille d&#39;imagerie qui retient les tubes de la boîte d&#39;incubation et mettez-la sur une boîte à lumière, éclairée par le bas. Avec les tubes déjà dans la grille d&#39;imagerie, les ensembles triplicés seront correctement espacés et prêts à l&#39;image immédiatement. </li><li> Concentrez la caméra sur les tubes de sorte que tous soient visibles dans le champ de vision et que la lumière provenant de la boîte lumineuse offre un contraste et une visualisation suffisants de la couleur dans les colorants du tube. Photo de directement ci-dessus. </li><li> Pour extraire le contenu des tubes, retirer les tubes capillaires du berceau en caoutchouc d&#39;un ensemble de triplicats à la fois. Soulevez doucement les tubes et sortez du berceau ou glissez-les. </li><li> Pour chaque ensemble de triplés, suivre la procédure d&#39;extraction détaillée aux étapes 7.1 à 7.3. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Le maquillage microbiologique d&#39;un poumon avec CF contient une grande variété d&#39;organismes, mais les conditions dans le poumon ont vraisemblablement une influence importante sur les types de microbes qui peuvent survivre et prospérer 13 , 15 . Les mécanismes spécifiques par lesquels ces conditions changent et les effets exacts qu&#39;elles ont sur le microbiome pulmonaire sont généralement peu clairs actuellement. Dans cette méthode expérimentale, nous p...

La méthode décrite dans ce manuscrit s&#39;appelle le système WinCF 1 . L&#39;objectif global de WinCF est de fournir une configuration expérimentale capable de simuler l&#39;environnement d&#39;une bronchole pulmonaire remplie de mucus. Cela permettra à un système traçable d&#39;étudier les agents pathogènes microbiens des maladies pulmonaires avec un phénotype de l&#39;hypersécrétion du mucus incluant la fibrose kystique (FC), la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), l&#39;asthme et d&#39;autres. La procédure a été conçue spécifiquement pour l&#39;étude de la FC, qui se caractérise par des mutations qui font que les sécrétions pulmonaires deviennent épaisses et difficiles à nettoyer, finissant par remplir les bronchioles et d&#39;autres petits passages avec le mucus 2 . De tels blocages dans les poumons inhibent l&#39;échange de gaz parce que l&#39;air inhalé n&#39;est plus capable d&#39;atteindre de nombreux alvéoles et fournit également un habitat pour la colonisation bactérienne 3 , 4 . L&#39;incapacité à prévenir la croissance microbiennemucus pulmonaire excessive conduit finalement au développement d&#39;infections chroniques complexes des voies respiratoires. Ces communautés contiennent une variété d&#39;organismes, y compris les virus, les champignons et les bactéries comme Pseudomonas aeruginosa, toutes les composantes interagissent entre eux 5, 6, 7, 8. On croit que l&#39;activité du microbiome pulmonaire des FC à participer à des poussées de symptômes appelés exacerbations pulmonaires 1, 9, 10, 11. WinCF permet d&#39;étudier le comportement de la communauté microbienne autour de ces exacerbations et est maintenant étendu à agir en tant que système expérimental de base pour étudier l&#39;écologie microbienne du poumon. Traditionnellement, les exacerbations ont été étudiés par l&#39;analyse directe des échantillons prélevés dans les poumons. De nombreux facteurs de confusion rendent l&#39;analyse directe de b microbienneehavior dans les poumons difficiles, avec le système WinCF, bon nombre de ces facteurs sont retirés et le comportement du microbiome pulmonaire peuvent être étudiés plus directement, ce qui permet une analyse plus fine de l&#39;activité bactérienne dans un bronchioles branché mucus. Le système WinCF fournit une méthode pour développer et analyser les bactéries d&#39;une manière qui imite efficacement l&#39;environnement pulmonaire. Les méthodes traditionnelles pour la culture des bactéries pulmonaires échantillons de culture souvent impliqués sur des plaques d&#39;agar traditionnelles. Ces méthodes laissent les échantillons ouverts à l&#39; oxygène atmosphérique, en négligeant de tenir compte du hypoxique et des conditions souvent anoxiques trouvées dans les bronchioles pulmonaires bouchés avec du mucus 12, 13. Agar sur la culture dans des conditions aérobies est rien comme l&#39;environnement du poumon CF et peut induire en erreur les cliniciens et les chercheurs concernant le comportement des agents pathogènes qu&#39;ils essaient de traiter. De plus, les éléments nutritifs aux bactéries sur des plaques de géloseSont différents de ceux disponibles dans l&#39;expectoration réelle, qui est comptabilisé dans WinCF en utilisant des mousses artificielles (ASM). Comme le montrent les cultures de Pseudomonas dans Sriramulu et al. 14 , ASM comprend un ensemble spécifique de composants qui imite les ressources disponibles pour les microbes de crachats et réplique également la consistance physique des expectorations. Étant donné qu&#39;un poumon malade possède un microbiome spécifique, l&#39;étude de ces microorganismes devrait également se faire dans les conditions spécifiques du poumon. Le système WinCF permet une analyse rapide et une manipulation facile des conditions expérimentales pour observer des changements microbiens semblables à la façon dont ils se produiraient dans une bronchole pulmonaire réelle. Cette technique permet l&#39;inoculation d&#39;une myriade de types d&#39;échantillons apparentés, y compris les expectorations, la salive, les autres sécrétions corporelles et les cultures bactériennes pures ou mélangées. La nature de l&#39;installation expérimentale permet une interprétation visuelle immédiate dele comportement de la communauté microbienne et est conçu pour permettre l&#39;application en aval facile d&#39;une multitude de procédés microbiologiques et omiques. De telles études sont importantes parce que les changements de composition de la communauté bactérienne sur la base des conditions physico-chimiques de leur environnement. Avec WinCF les conditions chimiques des médias peuvent être manipulés pour analyser les effets sur l&#39;activité bactérienne. Par exemple, peut être modifié l&#39;acidité des médias avant l&#39;inoculation d&#39;un échantillon. Après incubation, l&#39;activité bactérienne dans chacune de ces conditions peut être comparé directement et conclusions peuvent être tirées sur la façon dont les bactéries dans les échantillons de crachats se comportent en réponse à un pH variable. Ici, nous présentons les modalités d&#39;application du système WinCF et des exemples de la façon dont la chimie des médias peut être manipulé pour étudier les effets sur le microbiome pulmonaire.

<table><tbody><tr><td>Tubes capillaires à code couleur</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-260943</td><td></td></tr><tr><td>Composé d’étanchéité de tube Cha-seal</td><td>Kimble-Chase</td><td>43510</td><td></td></tr><tr><td>Mucine de l’estomac porcin</td><td>Sigma</td><td>M1778</td><td></td></tr><tr><td>Ferritine, cationisée de la rate de cheval</td><td>Sigma</td><td>F7879</td><td></td></tr><tr><td>Sperme de saumon ADN Sel de sodium (sonifié)</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A2159</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels MEM</td><td>Corning cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés MEM</td><td>Cellgro</td><td>25-030-CI</td><td></td></tr><tr><td>Émulsion de jaune d’œuf, 50 %</td> <td>Dalynn Biologicals</td><td>VE30-100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher Scientific</td><td>P2157500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271500</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de centriguage de 15 mL avec graduations imprimées et capuchons plats VWR</td><td></td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 50 mL avec graduations imprimées et capuchons plats</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL</td><td>Corning</td><td>MCT-150-R</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 2,0 mL</td><td>Corning</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr></tbody></table>

le modèle wincf - un microcosme peu coûteux et abordable d&#39;une menthe bronchée à mousqueton pour étudier la microbiologie des infections pulmonaires

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Beaucoup de maladies chroniques des voies respiratoires entraînent une bouchage de mucus des voies respiratoires. Les poumons d&#39;un individu atteints de fibrose kystique sont un cas exemplaire où leurs bronchioles bouchées de mucus créent un habitat favorable pour la colonisation microbienne. Divers agents pathogènes se développent dans cet environnement en interaction entre eux et entraînent une grande partie des symptômes associés à la maladie des FC. Comme toute communauté microbienne, les conditions chimiques de leur habitat ont un impact significatif sur la structure et la dynamique de la communauté. Par exemple, différents microorganismes se développent dans différents niveaux d&#39;oxygène ou d&#39;autres concentrations de soluté. Ceci est également vrai dans le poumon des FC, où les concentrations d&#39;oxygène sont censées conduire la physiologie et la structure de la communauté. Les méthodes décrites ici sont conçues pour imiter l&#39;environnement pulmonaire et cultiver des agents pathogènes d&#39;une manière plus similaire à celle d&#39;où ils causent une maladie. La manipulation de l&#39;environnement chimique de ces microbes est ensuite utilisée pour étudier comment le chemiDes infections pulmonaires régit son écologie microbienne. La méthode, appelée système WinCF, est basée sur des tubes artificiels à l&#39;épi et des tubes capillaires étroits destinés à fournir un gradient d&#39;oxygène similaire à celui qui existe dans les bronchioles bouchées de mucus. La manipulation des conditions chimiques, telles que le pH du média de la pression des crachats ou des antibiotiques, permet de visualiser les différences microbiologiques dans ces échantillons en utilisant des indicateurs colorés, en surveillant la production de gaz ou de biofilms, ou en extrayant et séquençant le contenu en acide nucléique de chaque échantillon.

la croissance microbiologique dans les différentes conditions chimiques induites dans les échantillons variait considérablement dans certains cas, et plus subtilement dans d&#39;autres. De nombreux changements dans l&#39;activité étaient de nature visuelle, étant évident que dès que la période d&#39;incubation est terminée. Dans l&#39;exemple de la manipulation du pH, les échantillons à travers le spectre de pH varient considérablement, comme indiqué par des facteurs multiples qui sont a...

Les voies respiratoires du mucus des patients atteints de fibrose kystique (CF) sont un environnement idéal pour que les agents pathogènes microbiens puissent prospérer. Le manuscrit décrit une nouvelle méthode pour étudier le microbiome des poumons des FC dans un environnement qui imite où ils causent des maladies et comment les altérations des conditions chimiques peuvent entraîner une dynamique microbienne.

Le modèle WinCF - Un microcosme peu coûteux et abordable d&#39;une menthe bronchée à mousqueton pour étudier la microbiologie des infections pulmonaires

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

L'objectif général de cette procédure est de reproduire l'environnement pulmonaire et de cultiver des agents pathogènes de manière plus proche de celle dans laquelle ils provoquent la maladie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie des voies respiratoires, telles que la façon dont des agents pathogènes bactériens divers interagissent dans un poumon atteint de fibrose kystique. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une manipulation facile des conditions expérimentales.Pour observer les réponses microbiennes de manière similaire à ce qu'elles seraient dans un bronche pulmonaire réel. La procédure sera démontrée par Will Comstock de notre laboratoire. Pour préparer le milieu de crachats artificiel, mélanger 16 millilitres de solution mère de muceum préparée précédemment, 2 millilitres de solution mère de chlorure de potassium, 2 millilitres de solution mère de chlorure de sodium, 200 microlitres d'émulsion de jaune d'œuf, 5,6 millilitres de solution mère d'ADN, 120 microlitres de solution mère de ferritine, 5,78 millilitres de solution d'acides aminés essentiels, 5,78 millilitres de solution d'acides aminés non essentiels et 2,44 millilitres d'eau stérile.La préparation minutieuse d'un milieu artificiel stérile de crachats est extrêmement importante. En effet, toute contamination peut modifier l'activité bactérienne dans les capillaires incubés par la suite. Après avoir doucement agité pour homogénéiser, prélevez à la pipette cinq millilitres du milieu et répartissez-les dans huit tubes stériles de 15 millilitres.Le milieu peut désormais être modifié afin d'obtenir les conditions chimiques souhaitées. Par exemple, les milieux présentés ici ont vu leur PH modifié et des colorants ajoutés afin de refléter leurs différentes acidités. Ensuite, sous une hotte biologique stérile, ajouter 900 microliters de milieu dans chacun des huit tubes stériles de 1,5 millilitre.Homogénéisez les échantillons de crachats préalablement obtenus en utilisant une seringue de trois millilitres pour prélever et rejeter à plusieurs reprises le crachat jusqu'à l'obtention d'une consistance lisse. Ajoutez 100 microlitres de crachat homogénéisé dans chacun des huit tubes de microcentrifugation. Ensuite, vortexez les tubes pour bien mélanger.Étiquetez huit autres tubes stériles de centrifugation de 15 millilitres selon les tubes microcentrifuge contenant le milieu précédemment préparé. Ce seront les tubes d'incubation. Utilisez une solution d'éthanol à 70 % pour stériliser une serviette en papier et laissez-la sécher.Déchirez la serviette en morceaux d'environ quatre pouces carrés chacun. Ensuite, froissez un morceau au fond de chaque tube d'incubation. Avec un amas de papier au fond de chaque tube d'incubation, utilisez 1 millilitre d'eau stérile pour humidifier légèrement chaque amas afin de créer un environnement humide à l'intérieur du tube.Pour chaque tube de milieu, remplir trois tubes capillaires en verre avec le milieu en tenant une extrémité du tube dans le milieu et en l'inclinant horizontalement, en laissant l'action capillaire guider le milieu à l'intérieur du tube. Arrêter le remplissage en plaçant doucement un doigt ganté sur l'extrémité ouverte du tube, puis sceller l'autre extrémité du tube en l'enfonçant dans un bloc de mastic scellant capillaire.Placer chaque ensemble de trois tubes capillaires dans des tubes d'incubation de 15 millilitres, scellés avec de la pâte et orientés vers le bas. Ensuite, boucher les tubes et s'assurer qu'ils sont étiquetés. Ces trois tubes capillaires servent à la réplication de chaque condition témoin.Lorsque tous les tubes d'incubation sont remplis de leurs tubes capillaires désignés, placer les porte-tubes à 37 degrés Celsius de manière à ce que les tubes soient incubés horizontalement afin que tout gaz produit ne s'échappe pas par l'extrémité ouverte. Incuber les tubes pendant 48 heures.Retirer les tubes de l’incubateur en veillant à les maintenir horizontaux. Extraire délicatement les tubes capillaires des tubes d’incubation, en gardant chaque ensemble de trois séparé des autres ensembles. Disposer les tubes capillaires côte à côte sur une boîte lumineuse, parfaitement alignés afin que le contenu des tubes soit visible et éclairé par en dessous.Tissez un espace tous les trois tubes afin de séparer les différentes conditions chimiques. Ensuite, focalisez la caméra directement au-dessus des tubes de manière à ce que tous les tubes soient visibles dans le champ de vision, et à ce que la lumière provenant de la boîte lumineuse assure un contraste suffisant et une bonne visualisation de la couleur des colorants présents dans les tubes. Pour extraire le contenu des tubes en vue d'une analyse ultérieure, retirez un jeu de capillaires en triplicat de la boîte lumineuse à la fois. Insérez une aiguille de calibre 25 de 0,5 pouce à extrémité émoussée dans l'extrémité bouchée du tube capillaire afin de rompre le scellement.Ensuite, retourner le tube capillaire à l’envers pour permettre au milieu de s’écouler de la partie supérieure vers un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Si le milieu ne s’écoule pas, utiliser une pipette de 200 microlitres pour expulser le milieu du tube en appuyant sur le piston de la pipette lorsqu’il est inséré dans l’extrémité du tube capillaire. Comme illustré ici, lorsqu’aucun échantillon de crachats n’a été ajouté au milieu, le seul changement observé sur l’ensemble du spectre de pH après 48 heures d’incubation a été une légère diminution du volume du milieu, résultant d’une évaporation mineure.Les tubes capillaires inoculés ont montré des changements de volume, l'apparition de bulles de gaz, une coloration modifiée et la formation de dépôts opaques. Ces résultats montrent que les bactéries et autres micro-organismes présents dans le crachat ajouté sont capables de croître et d'évoluer dans le milieu artificiel. Après incubation, d'autres méthodes telles que la métabolomique et le séquençage de l'ADN peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires concernant le comportement des micro-organismes qui se développent dans les tubes capillaires.Le système winCF est une nouvelle méthode permettant d'étudier l'activité du microbiome pulmonaire ; importante pour de nombreuses maladies, notamment la mucoviscidose, la BPCO, l'asthme et d'autres affections.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Nielsen, T. B., et al., Modèle d’aspiration oropharyngée murine de pneumonie bactérienne associée au ventilateur et d’acquisition hospitalière. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo montre la procédure consistant à acheminer des bactéries à travers l’oropharynx jusqu’aux poumons d’une souris anesthésiée afin d’induire une infection pulmonaire et de déclencher une réponse immunitaire.

Préparation d’un modèle d’aspiration oropharyngée murine pour établir les infections bactériennes des poumons

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Cette vidéo décrit le protocole de développement d’un modèle de poumon de porc ex vivo de biofilm bactérien sur du tissu bronchiolaire infecté. Les biofilms sont des agrégats bactériens intégrés dans une matrice adhérente à une surface. Ce modèle est utilisé pour étudier la sensibilité aux antibiotiques des bactéries à différents stades de la formation du biofilm.

Modèle pulmonaire de porc ex vivo de biofilm : une technique pour développer un modèle pulmonaire pour étudier les biofilms bactériens sur le tissu bronchiolaire de porc

Alors que l’étude in vitro des interactions hôte-pathogène permet de caractériser des réponses immunitaires spécifiques, des modèles in vivo sont nécessaires pour observer les effets de réponses complexes. En utilisant l’exposition à Candida albicans suivie d’une infection pulmonaire médiée par Pseudomonas aeruginosa, nous avons établi un modèle murin des interactions microbiennes impliquées dans la pathogénicité de la pneumonie associée à la ventilation assistée.

Etudier communautés microbiennes<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modèle d&#39;interaction hôte intermédiaire Entre<em&gt; Candida albicans</em&gt; Et<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans les Airways

La lithographie douce a été utilisée pour produire un modèle représentatif à l’échelle réelle des voies respiratoires alvéolées pulmonaires qui se dilatent et se contractent périodiquement, imitant le mouvement physiologique de la respiration. Cette plate-forme recrée les flux acineux respiratoires sur une puce et devrait faciliter l’étude expérimentale de la dynamique des aérosols inhalés et du dépôt dans l’acinus pulmonaire.

Un modèle microfluidique de Biomimetically respiration pulmonaire acineuse Airways

La pneumonie infectieuse est parmi les infections les plus courantes chez l’homme. Un modèle approprié en vivo est essentiel pour comprendre la pathogenèse de la maladie et de tester l’efficacité de nouveaux médicaments. Avec ce modèle de pneumonie murine aspiration oropharyngée, on peut examiner la pathogénie et nouveaux traitements contre ces infections mortelles.

Modèle murin Aspiration oropharyngée de pneumonie bactérienne associée à et nosocomiales

Nous décrivons un protocole pour un modèle tridimensionnel de co-culture des voies respiratoires infectées, utilisant CFBE41o- cellules, macrophages THP-1, et Pseudomonas aeruginosa, établi à l’interface air-liquide. Ce modèle fournit une nouvelle plate-forme pour tester simultanément l’efficacité antibiotique, la fonction de barrière épithéliale, et les marqueurs inflammatoires.

P. aeruginosa Co-culture 3D infectée des cellules épithéliales bronchiques et des macrophages à l’interface air-liquide pour l’évaluation préclinique des anti-infectieux

Ce manuscrit décrit l’établissement d’un modèle infectieux de pneumonie chez la souris et la caractérisation respective de la résolution des lésions ainsi que les méthodes de croissance bactérienne et d’instillation intratrachéale. Une nouvelle approche utilisant la cytométrie en flux de grande dimension pour évaluer le paysage immunitaire est également décrite.

Modèle expérimental pour évaluer la résolution de la pneumonie

Les modèles de poumons sur puce surpassent les cultures 2D traditionnelles en imitant l’interface air-liquide et la perfusion de cellules endothéliales, simulant le flux sanguin et l’échange de nutriments essentiels pour les études de physiologie pulmonaire. Cela renforce la pertinence de la recherche pulmonaire, en offrant un environnement dynamique et physiologiquement précis pour faire progresser la compréhension et le traitement des infections respiratoires.

Modèle d’alvéole sur puce immunocompétent pour l’étude des réponses immunitaires de la muqueuse alvéolaire

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Cultiver un biofilm polymicrobien pertinent pour la fibrose kystique afin de sonder les phénotypes des communautés

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Découvrez le système WinCF pour étudier la microbiologie pulmonaire en simulant l'environnement des bronchioles obstruées par le mucus. Cette méthode permet d'analyser les interactions microbiennes dans la mucoviscidose et autres maladies respiratoires chroniques.

Le modèle WinCF - Un microcosme peu coûteux et abordable dune menthe bronchée à mousqueton pour étudier la microbiologie des infections pulmonaires (Vidéo) | JoVE Journal

Le modèle WinCF - Un microcosme peu coûteux et abordable d'une menthe bronchée à mousqueton pour étudier la microbiologie des infections pulmonaires

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