Protocoles pour étudier l'hôte d'un tissu de distribution, en mode de transmission, et l'effet sur la remise en forme de l'hôte d'un Densovirus dans le coton Heliothis

L’objectif global de ce protocole est d’étudier l’effet d’un Densovirus, HaDV2, sur son hôte, le ver de la capsule du cotonnier. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’interaction avec l’hôte de virus, telles que l’effet des virus désormais sur leurs hôtes. Le principal avantage de cette technique que les larves utilisent pour construire des souches virales positives et négatives est dérivé des mêmes par-ne-co-hôtes, assurant le même patrimoine génétique.

Pour commencer l’expérience, huit couples de papillons nouvellement enfermés se sont accouplés à l’aide d’une cage en plastique recouverte de gaze de coton pour assurer une bonne ventilation et servir de substrat pour la position de l’ovule. Pour augmenter la probabilité d’obtenir une colonie exempte de virus, utilisez au moins 30 paires d’accouplements à un seul couple. Nourrissez les papillons adultes avec une boule de coton imbibée d’une solution de sucre à 10 % et à 2 % de vitamines, et reconstituez la solution quotidiennement.

Aujourd’hui, après l’accouplement, lorsque les femelles adultes pondent leurs œufs sur la gaze de coton, commencent à changer la gaze tous les jours. Recueillez et conservez les œufs contenant de la gaze dans la même salle de croissance que les papillons adultes jusqu’à l’éclosion des œufs. Transférez immédiatement les larves nouvellement écloses dans de nouvelles plaques de 24 puits avec un individu par puits.

Cinq jours après la date de la première ponte, récupérez les papillons parents et stockez-les dans de l’azote liquide. Vérifiez la présence de HaDV2 chez les parents à l’aide de la PCR avec des amorces spécifiques, et conservez les individus exempts de HaDV2 en tant que souche non infectée exempte de HaDV2. Prélevez les papillons adultes individuellement et stockez-les immédiatement dans de l’azote liquide.

Broyer complètement les mites individuelles collectées dans de l’azote liquide à l’aide d’un mortier et d’un pilon stérilisés. Transférez environ 10 microgrammes de débris dans un tube propre de 1,5 millilitre. Transférez ensuite les débris restants dans un nouveau tube, puis stockez-les immédiatement à 80 degrés Celsius.

Extrayez l’ADN des 10 microgrammes de débris en suivant les protocoles fournis par le fabricant. Une fois l’ADN du papillon de nuit isolé, vérifiez la présence de HaDV2 à l’aide du protocole. Selon les résultats, divisez les débris restants en deux groupes : HaDV2 positif et HaDV2 négatif.

Ajoutez un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate, ou PBS, à chaque individu pour dissoudre complètement les débris larvaires restants. Pré-refroidissez la centrifugeuse à quatre degrés Celsius, puis faites tourner l’homogénat. Sur glace, filtrez le surnageant liquide à l’aide du filtre à membrane de 0,22 micron.

Collectez 200 microlitres par tube de liquides filtrés et stockez-les immédiatement à 80 degrés Celsius. Déterminer l’efficacité de l’infection buccale avec les liquides filtrés infectés par HaDV2 de différentes concentrations en diluant le liquide contenant HaDV2. Dans une hotte, répartissez uniformément 200 microlitres de HaDV2 contenant des liquides filtrés pour chaque concentration à la surface du régime artificiel solide.

Ensuite, commencez à transférer 100 larves fraîchement écloses dans le HaDV2 contenant un régime artificiel dans une boîte de Pétri. Frappez doucement la gaze de coton, y compris les larves fraîchement écloses, pour transférer les larves de la gaze sur une feuille de papier blanc. Frappez doucement le papier pour que les larves essorent la soie et le ballon du papier.

Utilisez des pinces stérilisées pour toucher la soie et déplacez les larves dans une boîte de Pétri. Après 48 heures, transférez une larve individuelle par puits sur le régime artificiel dans des assiettes à 24 puits. Re-ar les larves inoculées avec HaDV2, en utilisant les mêmes concentrations au stade adulte.

Vérifiez le statut d’infection HaDV2 des adultes à l’aide du protocole. Les adultes inoculés avec 10 à la huitième copie par microlitre de HaDV2 ont donné une infection à 100 % et sont conservés en tant que souche HaDV2 positive. Pour éviter toute contamination, stérilisez trois fois les pinces et les ciseaux à l’éthanol à 75 %, puis chauffez-les à la flamme d’une lampe à alcool.

À l’aide d’une balance analytique, pesez les tubes vides qui doivent être utilisés pour stocker les tissus. Ensuite, placez les larves et les papillons adultes de la souche infectée sur de la glace pendant environ cinq minutes. Fixez les larves congelées sur cystosepiment à l’aide de deux épingles à insectes insérées dans les membranes intersegmentaires près de la tête et du dernier segment de l’abdomen.

Ensuite, dans la partie postérieure de l’abdomen, coupez la patte probe des larves pour que l’hémolymphe s’écoule. Utilisez une pipette pour pipeter environ 10 microlitres d’hémolymphe larvaire en 10 secondes environ pour éviter le brunissement et la coagulation de l’hémolymphe. Avec une paire de ciseaux, faites une incision dans la cuticule allant de la dernière membrane intersegmentaire à la tête.

À l’aide de deux pinces, disséquez l’intestin antérieur, l’intestin moyen, l’intestin postérieur, le corps adipeux et les tubules de Malpighian. Pour éviter la contamination des tissus restants par l’hémolymphe lors de la dissection, lavez les tissus disséqués dans un tampon PBS. Mélangez des échantillons de tissus de trois individus en un seul réplicant.

Transférez immédiatement chaque tissu dans les tubes dans de l’azote liquide. Dans une boîte de Pétri propre contenant un tampon PBS, disséquez les tissus des adultes femelles et mâles et transférez immédiatement chaque tissu dans les tubes dans de l’azote liquide. Pesez les tubes et les tissus ci-dessus séparément et calculez la masse des tissus.

Extrayez l’ADN de ces tissus et effectuez une kPCR pour quantifier le titre viral de chaque tissu. Placez au moins 100 pupes ou papillons adultes nouvellement émergés dérivés de la souche non infectée dans une cage en treillis métallique de 5 litres recouverte de gaze de coton. Après deux jours, les femelles adultes accouplées commenceront à pondre des œufs sur la gaze de coton.

Récupérez et entretenez la gaze de coton contenant les œufs. Procéder à l’inoculation des larves de nouveau-nés en transférant les larves de nouveau-né de la souche non infectée dans le régime artificiel contenant HaDV2 pour établir la souche infectée. De même, transférez les larves nouveau-nées dans le régime artificiel recouvert d’un liquide filtré sans HaDV2 pour établir les groupes témoins, la souche non infectée.

Inclure au moins 240 larves dans chaque traitement. Après 48 heures, transférez une larve individuelle par puits dans des plaques de 24 puits. Numérotez séquentiellement chaque larve dans chaque puits et enregistrez quotidiennement le stade du stade et l’état de survie.

Environ cinq jours plus tard, lorsque le régime artificiel se détériore, transférez simultanément ces personnes dans une nouvelle assiette à 24 puits contenant un régime artificiel frais. Pesez les larves du septième au 11e jour à l’aide d’une balance analytique. Après la pesée, remettez individuellement les larves dans la plaque de 24 puits.

Lors de la mue jusqu’au cinquième stade, environ dix jours après l’éclosion, transférez les larves dans des tubes de verre. Transférez les individus dans le tube de verre à la même heure chaque jour. Les larves du cinquième stade peuvent également être identifiées par la largeur de la capsule céphalique.

Ensuite, codez chaque larve avec son numéro de référence d’origine sur le tube de verre à l’aide de peinture ou de marqueurs. Enregistrez quotidiennement l’état larvaire. Notez les pupes et la date d’éclosion de chaque individu dans le tube de verre, et notez la masse des pupes âgées de trois jours.

Après l’éclosion, placez une femelle et un mâle dans une seule cage avec 10 % de saccharose et 2 % de solution vitaminée. Reconstituez la solution de saccharose tous les jours. Notez la date de décès de chaque papillon de nuit.

Lorsque les œufs sont pondus, changez la gaze de coton tous les jours. Comptez immédiatement le nombre d’œufs. Enfin, comptez la progéniture nouvellement éclose pendant qu’elle éclos.

Des essais ont été effectués pour s’assurer de la qualité des échantillons utilisés dans l’expérience. La descendance des parents mâles et femelles que nous avons exempts de HaDV2 a été élevée comme la souche non infectée. Nous avons réussi à amplifier le gène de l’actine chez les parents et la descendance en utilisant le même modèle d’ADN, ce qui suggère que les modèles d’ADN étaient de bonne qualité.

Les huit descendants sélectionnés au hasard étaient également exempts de HaDV2, HaNPV et Wolbachia. Une courbe standard définissant la relation entre le logarithme de la qualité du matériel de départ et les valeurs CT obtenues montre une forte corrélation linéaire entre les valeurs CT et le log du nombre initial de copies du gène HaDV2. Le nombre de copies de HaDV2 a été calculé par microgramme de chaque tissu, et le pourcentage du titre total de HaDV2 pour le tissu spécifique a révélé que HaDV2 était principalement distribué dans le corps adipeux.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de manipuler les larves délicates pendant les cinq premiers jours suivant leur éclosion pendant la procédure d’en-pneu.