Name: Protocoles pour étudier lhôte dun tissu de distribution, en mode de transmission, et leffet sur la remise en forme de lhôte dun Densovirus dans le coton Heliothis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Découvrez les protocoles pour étudier la distribution tissulaire, le mode de transmission et l'effet sur la fitness de l'hôte du densovirus HaDV2 chez Heliothis armigera. Cette méthode permet de générer des souches positives et négatives avec le même arrière-plan génétique.

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Ce travail a été soutenu par le Programme national de recherche sur la clé de base de la Chine (n ° 2013CB127602) et le Fonds des sciences pour les groupes de recherche Creative de la National Science Foundation de Chine (n ° 31321004).

1. La construction de la libre HaDV2-Cotton Colony Heliothis <ol><li> Coton arrière larves de noctuelle (H. armigera) sur un régime artificiel 32 dans une chambre de croissance contrôlée ou une chambre climatique artificielle à 25 ± 1 ° C, avec 14 h de lumière / 10 h d&#39; obscurité et 60% d&#39; humidité relative. </li><li> Faciliter l&#39;accouplement unique paire de papillons nouvellement éclos à l&#39;aide d&#39;une cage en matière plastique par paire (hauteur 10 cm, diamètre 5 cm) recouvert d&#39;une gaze de coton pour assurer une bonne ventilation et de servir en tant que substrat d&#39;oviposition. Pour augmenter la probabilité d&#39;obtenir une colonie exempte de virus, d&#39;utiliser au moins 30 paires de saillies seule paire. Alimentation papillons adultes avec 10% de sucre et 2% de solution de vitamine 32 imbibés sur une boule de coton et rempli tous les jours. </li><li> Comme les adultes femelles pondent leurs œufs sur la gaze de coton environ 2 jours après l&#39;accouplement, changer la gaze par jour. Recueillir et maintenir gaze contenant des œufs dans la même pièce de croissance (ou artificielle climat ChamsTEB) que les papillons adultes jusqu&#39;à l&#39;éclosion des oeufs. </li><li> transférer immédiatement les larves nouvellement éclos de nouvelles plaques à 24 puits, avec un individu par puits. </li><li> Cinq jours après la première date de ponte, recueillir les papillons de nuit de parents et de les stocker dans de l&#39;azote liquide. NOTE: La collecte des papillons de nuit 5 jours après la première date de ponte assure que les parents sont en vie au moment de la collecte et évite donc les impacts possibles de l&#39;utilisation des papillons morts sur la précision d&#39;extraction d&#39;ADN. </li><li> Isoler l&#39;ADN génomique à partir de ces échantillons en utilisant un kit d&#39;extraction d&#39;ADN selon les instructions du fabricant. <ol><li> Amplifier un fragment de 574 pb du gène de l&#39;actine actine avec des amorces F / R d&#39;actine (actine F: 5-CATCTACGAGGGTTACGC-3 et de l&#39;actine R: 5-CATCTGTTGGAAGGTGGA-3). Visualiser la réaction en chaîne par polymérase produits (PCR) en utilisant une électrophorèse sur gel d&#39;agarose selon des protocoles standards; l&#39;amplification réussie du gène d&#39;actine assure que l&#39;ADN est de bonne qualité. </li><li> évaluer til présence d&#39;HaDV2 dans les papillons mères en utilisant la PCR avec des amorces spécifiques: DVVPF (GGATTGGCCTGGGAAATGAC) et DVVPR (CGTTGTTTTTATATCCGAGG) 31. </li></ol></li><li> Une fois une paire propre a été identifiée, progéniture arrière à partir de cette seule paire d&#39;élevage séronégatifs pour HaDV2 pendant au moins cinq générations et maintenir ce que la colonie libre HaDV2 (NONINF-souche); la colonie infectée par HaDV2 est définie comme la INF-souche. </li><li> Pour confirmer l&#39;état d&#39;infection HaDV2 dans la NONINF-souche (et d&#39;exclure l&#39;effet des bactéries connues ou virus sur le développement hôte), d&#39; évaluer l&#39;état d&#39;infection pour HaDV2, Wolbachia et H. armigera nucleopolyhedrovirus (HaNPV) dans huit individus larves choisies au hasard du NONINF-déformation en utilisant la PCR (avec des amorces spécifiques: DVVPF / DVVPR pour HaDV2, NPVF / NPVR pour HaNPV et 81F / 691R pour Wolbachia 31, 33). NOTE: Il est connu que certains virus pourraient être en retardnt dans l&#39;hôte infecté, avec un niveau indétectable, même en utilisant une technique basée sur la PCR. technologies NGS pourraient être utilisées pour confirmer qu&#39;aucune séquence virale sont présentes dans les échantillons d&#39;ADN génomique. </li></ol> 2. Préparation des fluides liquides contenant HaDV2 NOTE: Nous avons montré que la purification tentative des particules virales HaDV2 inhibe leur infectiosité et l&#39; activité 31; Par conséquent, le protocole suivant est effectué pour parvenir à la solution HaDV2 infectieux en filtrant les individus infectés par le HaDV2. <ol><li> Recueillir les papillons adultes individuellement et les stocker immédiatement dans de l&#39;azote liquide. </li><li> broyer complètement les mites individuelles collectées dans de l&#39;azote liquide en utilisant un mortier et un pilon stérilisé. Transférer environ 10 pg de débris à un propre tube de 1,5 ml. Transférer les débris restant dans un nouveau tube et les stocker immédiatement à -80 ° C. </li><li> Extraire l&#39;ADN à partir du 10 pg de débris, folloaile les protocoles fournis par le fabricant. Une fois que l&#39;ADN a été isolé papillon, vérifier HaDV2 en utilisant le protocole tel que décrit à l&#39;étape 1.6. </li><li> Selon les résultats obtenus à l&#39;étape 2.3, diviser les débris restants en deux groupes: HaDV2 positif et HaDV2 négatif, en fonction de leur statut d&#39;infection. Ajouter 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM de KCl, 8 mM de Na 2 HPO 4, et 1,5 mM KH 2 PO 4; pH 7,5) à chaque individu pour dissoudre complètement les débris restant des larves. </li><li> Centrifugeuse de l&#39;homogénat (de l&#39;étape 2.4) à 6.500 x g pendant 15 min à 4 ° C. On filtre le liquide surnageant avec un filtre à membrane de 0,22 um. Recueillir les liquides filtrés (200 pl par tube) et les stocker immédiatement à -80 ° C. REMARQUE: Le filtre à membrane de 0,22 um filtrera la plupart des particules indésirables, les bactéries et les champignons. Tout d&#39;abord pré-refroidir la centrifugeuse à 4 ° C. Effectuer tous les protocoles involving le fonctionnement du liquide filtré sur de la glace pour empêcher l&#39;homogénat de brunir et coaguler. </li></ol> 3. La construction du coton colonie infectée par Heliothis HaDV2 <ol><li> capacité de transmission horizontale de HaDV2 <ol><li> Générer une courbe standard HaDV2. <ol><li> Amplifier les fragments contenant des amorces (VPF: CTGGTGAGGCGATGGACATG; VPR: TGACAAGATCCAGCGTAGACATC) et la sonde (VP-sonde: GCCACCACTAGAGGACCCACCAGATG), qui sont utilisés pour la quantification du virus HaDV2, avec les amorces de novo (PF: GGACAATGCTGGTGAGGC; PR: AATCCTCTTTGTCCGTTATCTATG). Utiliser le programme suivant: 30 s à 94 ° C, 30 s à 53 ° C et 60 s à 72 ° C pendant 40 cycles de PCR sur une machine 31. Ajouter 1 pi de l&#39;ADN génomique contenant le génome HaDV2 (étape 2.3) pour la réaction de PCR de 25 ul comme matrice d&#39;ADN. Cloner les fragments amplifiés dans un vecteur de clonage selon les protocoles du fabricant. </li><li> Calculer le nombre de copiesdes plasmides avec l&#39;équation suivante: copies / ul = (N A x C) / (n × M × 10 9), où N A est le nombre d&#39;Avogadro (6,02 × 10 23 molécules / mol); C est la concentration en masse de plasmides (ng / ul), qui peuvent être mesurés en utilisant microspectrophotométrie; n est la longueur du plasmide recombinant contenant le produit de PCR (5195 bp); et M est le poids moléculaire d&#39;une paire de base moyen de l&#39; ADN double brin (660 g / mol). </li><li> Préparer six 10 fois des dilutions en série dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml, avec des concentrations de 1,5 x 10 9 à 1,5 × 10 8 à 1,5 x 10 7 à 1,5 x 10 6, 1,5 x 10 5 et 1,5 x 10 4 nombre de copies / ul. </li><li> Effectuer en temps réel une réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) en utilisant des amorces spécifiques (VPF / VPR) et une sonde (VP-sondes) pour générer des cycles threShold valeurs (CT) des plasmides décrits dans l&#39;étape 3.1.1.3. Effectuer trois répétitions techniques indépendantes et les en moyenne pour des calculs ultérieurs. </li><li> En utilisant les résultats ci-dessus, générer une courbe d&#39;étalonnage en corrélation des concentrations HaDV2 transformé log2-aux valeurs moyennes CT connexes. </li></ol></li><li> Quantifier HaDV2 dans les fluides liquides filtrés. <ol><li> Pipeter un échantillon d&#39;essai de 100 pi de fluide de liquide filtré (étape 2.6) contenant HaDV2 pour l&#39;extraction d&#39;ADN. </li><li> Utiliser le temps réel qPCR pour obtenir les valeurs CT pour les fluides liquides et calculer le nombre de copies en utilisant la courbe d&#39;étalonnage dans l&#39;étape 3.1.1. </li></ol></li><li> Déterminer l&#39;efficacité de l&#39;infection par voie orale avec des liquides filtrés infectés par HaDV2 de différentes concentrations. <ol><li> On dilue le fluide liquide contenant HaDV2 aux concentrations suivantes: 10 8, 10 7, 10 6, 10 5, 10 4, 0 et le nombre de copies / pL. </li><li> Etaler la di artificielleet uniformément sur une boîte de Pétri de 9 cm de diamètre avant la solidification. Répartir liquide contenant HaDV2 filtré (200 ul) pour chaque concentration à la surface du régime alimentaire artificiel solide. Pour ce faire, dans une hotte. </li><li> Transfert 100 larves fraîchement éclos à l&#39;alimentation artificielle contenant HaDV2 dans une boîte de Petri. frapper doucement la gaze de coton (y compris les larves fraîchement éclos) pour transférer les larves de la gaze à une feuille de papier blanc. Battre doucement le papier afin que la soie de spin larves et « ballon » le papier. Utilisez des pinces stérilisées pour toucher la soie et déplacer les larves dans une boîte de Petri. </li><li> Après 48 h, transférer les larves sur le régime artificiel des plaques 24 puits (une personne par puits). </li><li> Arrière les larves inoculées avec HaDV2 aux concentrations supérieures au stade adulte. </li><li> Recueillir les papillons adultes, extraire l&#39;ADN, et détecter HaDV2 par PCR, comme décrit à l&#39;étape 1.5. REMARQUE: Ici, obtenir un taux d&#39;infection HaDV2 100% de la cobollworms de tton en utilisant la 10 copie 8 nombre / pl et établir ainsi la colonie infectée par HaDV2 (INF-déformation). </li></ol></li></ol></li><li> Verticale capacité de transmission de HaDV2 <ol><li> Sélectionnez les papillons adultes des NONINF et INF-souches pour générer des paires uniques de ♀- / ♂-, ♀ + / ♂-, ♀- / ♂ + et + ♀ / ♂ + (+: positif pour l&#39;infection HaDV2; -: négatif pour infection HaDV2). </li><li> Transférer la descendance des paires ci-dessus à sans virus plaques à 24 puits; élever les larves au troisième stade larvaire. </li><li> Extraire l&#39;ADN à partir des larves de troisième stade larvaire ont été recueillies à utiliser comme matrice pour déterminer la présence de HaDV2, tel que décrit à l&#39;étape 1.5. </li></ol></li></ol> 4. Distribution tissulaire de HaDV2 <ol><li> Pour éviter la contamination par des virus et des bactéries, stériliser les pinces et ciseaux dans 75% d&#39;éthanol trois fois, puis les chauffer dans la flamme d&#39;une lampe à alcool. REMARQUE: Forceps sterilization est nécessaire en cas de contamination. </li><li> En utilisant une balance analytique, peser les tubes vides qui doivent être utilisés pour stocker les tissus. </li><li> Placez les papillons de nuit de larves et adultes de l&#39;INF-pression sur la glace pendant environ 5 min. </li><li> Disséquer les tissus suivants sous un stéréomicroscope chez les larves, les femelles adultes et les hommes adultes dans une boîte de Petri contenant un tampon propre PBS. <ol><li> Pour les larves, hémolymphe de Pipet et disséquer l&#39;intestin antérieur, l&#39; intestin moyen, gros intestin, corps gras, et malpighien (Figure tubules 1A). Transférer immédiatement chaque tissu sur les tubes dans de l&#39;azote liquide. <ol><li> Fixer les larves congelés sur cystosepiment en utilisant deux broches d&#39; insectes (200 um de diamètre, 20 mm de longueur), l&#39; insertion dans les membranes intersegmentaires près de la tête et du dernier segment de l&#39; abdomen (figure 1A). </li><li> Couper la fausse patte dans l&#39;abdomen postérieur des larves de telle sorte que les flux de l&#39;hémolymphe des larves sur. Pipeter l&#39;hémolymphe de larves dans les 10 s en utilisant un microPipette pour éviter le brunissement et coagulant de l&#39;hémolymphe. NOTE: phénylthiourée (50 ug / ml) peut être mélangé à un rapport de 1:20 vol / vol avec hémolymphe pour empêcher la mélanisation. </li><li> En utilisant une paire de ciseaux, faire une incision dans la cuticule allant de la dernière membrane intersegmental à la tête. Disséquer tous les autres tissus sous une loupe binoculaire à l&#39;aide de deux pinces; l&#39;image pour chaque tissu est représenté sur la figure 1A. </li><li> Mélanger des échantillons de tissus provenant de trois individus ensemble comme une réplique. </li><li> Pour éviter la contamination des tissus restants avec l&#39;hémolymphe lors de la dissection, se laver les tissus disséqués en trois fois tampon PBS. Ensuite, testez l&#39;état HaDV2-infection du PBS utilisé pour le lavage. Si le tampon de lavage final est HaDV2-libre, le tissu doit être propre de la contamination par hémolymphe. </li></ol></li><li> Chez les femmes adultes, disséquer la tête (cerveau), les muscles, la graisse du corps, de l&#39;intestin, tubules malpighiens, et de l&#39;ovaire (Figure 1B) sous un stéréomicroscope dans du tampon PBS. Pour les hommes adultes, disséquer la tête (cerveau), les muscles, la graisse du corps, de l&#39; intestin, tubules malpighiens, et les testicules (figure 1C) sous un stéréomicroscope dans un tampon PBS. Transférer immédiatement chaque tissu sur les tubes dans de l&#39;azote liquide. <ol><li> En utilisant des pinces et ciseaux, enlever les ailes des papillons adultes et laver le corps restant trois fois pour effacer les échelles. </li><li> Séparer la tête, le thorax et l&#39;abdomen à l&#39;aide de ciseaux. </li><li> Retirez le endosquelette du thorax et de recueillir le muscle. </li><li> En utilisant des pinces, retirer la cuticule de l&#39;abdomen et disséquer les autres tissus suivants figures 1B et 1C. </li><li> Mélanger les échantillons de tissus provenant de trois individus ensemble comme une réplique. Laver les tissus disséqués dans du PBS trois fois le tampon. </li></ol></li></ol></li><li> Peser les tubes et les tissus ci-dessus quand ils ont été gelés et veiller à ce que le mânes des différents tissus sont presque égaux. Masse (tissus) = masse (tubes / échantillon de tissu) - masse (tubes uniquement) </li><li> Extraire l&#39;ADN de ces tissus et effectuer qPCR, comme décrit à l&#39;étape 3.1.2. </li><li> Calculer le nombre de copies par mg de chaque tissu en utilisant la courbe d&#39;étalonnage générée à l&#39;étape 3.1.1. Utiliser le titre de virus par unité de masse pour corriger le biais de l&#39;échantillon provoqué par une différence dans la quantité de tissu utilisé pour l&#39;extraction d&#39;ADN. </li><li> Calculer le pourcentage de HaDV2 dans le tissu spécifique comme suit: pourcentage de HaDV2 pour chaque tissu = HaDV2 nombre de copies par mg de tissu testé / (somme du nombre de copies par mg de tous les tissus). </li></ol> 5. Bioassays tester l&#39;effet de HaDV2 sur le développement de l&#39;hôte <ol><li> Placez au moins 100 pupes ou les papillons adultes qui viennent d&#39;émerger dérivées de la souche NONINF dans un couvert de gaze en coton, 5-L, cage grillagée. Après 2 jours, les femelles adultes fécondées commencent à pondre des œufs sur la gaze de coton. Recueillir et maintenirla gaze de coton contenant les oeufs; les œufs éclosent dans environ trois jours. </li><li> Ensemencement des larves avec HaDV2 nouveau-né. <ol><li> Transfert des larves de la NONINF de nouveau - né-souche à l&#39;alimentation artificielle contenant HaDV2 (10 8 nombre de copies / ul) pour établir la INF-souche. </li><li> De même, le transfert de larves nouveau-né à l&#39;alimentation artificielle recouverte de liquide filtré HaDV2 libres (étape 2.4) pour établir les groupes de contrôle (NONINF-déformation). Inclure au moins 240 larves dans chaque traitement (figure 2A). REMARQUE: Larves qui sont utilisés pour construire le NONINF- et les souches INF-sont dérivés de la même cohorte mère et éclosent en même temps, en assurant le même fond génétique. Assurez-vous que les souches INF-NONINF- et sont maintenus dans la même chambre climatique (à 25 ± 1 ° C, avec 14 h de lumière / 10 h d&#39;obscurité et 60% d&#39;humidité relative) pour une vitesse synchrone de développement; le taux peut varier en fonction de la température et de l&#39;humidité. Manipulez le Delicmangé des larves doucement. </li></ol></li><li> Après 48 h, transférer les larves individuellement sur des plaques 24 puits (une personne par puits) (figure 2B). <ol><li> nombre chaque larve Séquentiellement dans chaque puits et enregistrer le stade larvaire et l&#39;état de survie quotidienne. </li><li> 5 jours plus tard, lorsque le régime alimentaire artificiel se détériore, en même temps transférer ces personnes à une nouvelle plaque de 24 puits contenant l&#39; alimentation artificielle frais (figure 2C). </li><li> Peser les larves de 7 à 11 jours après l&#39;éclosion en utilisant une balance analytique avec une précision de 0,0001 g. Après la pesée, de retour individuellement les larves à la plaque 24 puits. </li></ol></li><li> Après la mue au cinquième stade larvaire après la quatrième mue (une dizaine de jours après l&#39; éclosion), transférer les larves dans des tubes de verre (hauteur 10 cm, diamètre 2 cm) (figure 2D); cinquième stade larvaire peut également être identifié par la largeur de la capsule de tête (environ 2,6 mm). REMARQUE: Transférer les personnessur le tube de verre à la même heure chaque jour. <ol><li> Code de chaque larve avec son numéro de référence d&#39;origine sur le tube de verre avec de la peinture ou des marqueurs. Enregistrez l&#39;état larvaire par jour; dans les tubes de verre, les larves nymphoser après environ cinq jours, l&#39;étape de chrysalides dure environ 11 jours. </li><li> Notez la date de pupes et eclosion pour chaque individu dans le tube en verre. Noter la masse de 3 jours âgé pupes. </li></ol></li><li> Après l&#39; éclosion, mettre une femelle et d&#39; un mâle en une seule cage avec du saccharose à 10% et 2% de solution de vitamines (Figure 2E). Reconstituer la solution de saccharose tous les jours. Notez la date du décès pour chaque papillon. </li><li> Lorsque les œufs sont pondus, changer la gaze de coton par jour. Comptez le nombre d&#39;oeufs immédiatement. Nombre de descendants nouvellement éclos alors qu&#39;ils éclosent. </li><li> Pendant les essais biologiques, choisir au hasard huit personnes pour chaque traitement pour confirmer l&#39;état d&#39;infection de HaDV2. Extraire l&#39;ARN total de ces échantillons en utilisant le réactif de trypsine commercialesuivant le protocole du fabricant. Synthétiser l&#39;ADNc premier brin suivant le protocole du fabricant et de l&#39;utiliser comme modèle pour vérifier si les virus sont transcrites avec succès. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

Au cours des dernières décennies, la plupart des études sur les interactions virus d&#39; insectes ont mis l&#39; accent sur la santé des abeilles 34, 35, 36, vecteurs de maladies humaines 37, virus des plantes 38, et certains virus pathogènes d&#39; insectes qui ont un grand potentiel comme agents de lutte biologique 39. Peu d&#39;attention a été accordée ...

Au cours des dernières décennies, a facilité la découverte de nombreux virus d&#39;ADN et d&#39; ARN nouveaux, les virus en particulier non pathogènes, mais aussi des isolats nouveaux de virus connus précédemment 1, 2, 3 le développement de la technologie de séquençage telles que le séquençage de prochaine génération (NGS), 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Dans l&#39;organisme modèle Drosophila melanogaster, plus de 20 nouveaux génomes viraux partiels ont été détectés en utilisant des techniques métagénomiques 13. De nombreuses séquences virales, y compris de nouveaux virus, ont également été identifiés dans d&#39;autres insectes, comme les abeilles, mosquitoes, les psylles d&#39;agrumes asiatiques, libellules, et plusieurs espèces de lépidoptères 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. À l&#39;avenir, on peut penser que les virus plus de nouveaux seront découverts chez les insectes à l&#39;aide de ces technologies de pointe; Par conséquent, notre compréhension de l&#39;interaction virus-hôte peut changer en conséquence 6, 9. Par exemple, les interactions virus-hôte sont considérées comme plus compliquée qu&#39;on ne le pensait, parce que beaucoup de nouveaux virus sont définis comme des partenaires plutôt que des agents pathogènes mutualisme stricts 22. Par exemple, le DplDNV mutualisme de densovirus dans Dysaphis plantaginea induit ailé Morph et<html> augmente la mobilité, ce qui facilite la dispersion de l&#39;hôte ainsi que le virus 23. De plus, les virus mutualisme ont été décrits en ce qui concerne la santé des mammifères, la sécheresse et la tolérance au froid des plantes, et l&#39;impact des infections bactériennes 24. Vallée Seneca virus-001 est montré à la médiation cytotoxicité sélective vers les cellules tumorales avec le cancer neuroendocrine comporte 25. L&#39; hépatite A infections virales répriment la réplication du virus de l&#39; hépatite C et peut conduire à la récupération de l&#39; hépatite C 26. Temps d&#39; attente herpèsvirus confère une protection contre l&#39; infection bactérienne symbiotique 27. La glycoprotéine d&#39;enveloppe du rétrovirus endogène humain HERV-W induit une résistance cellulaire au virus de la nécrose de la rate 28. le virus de la tolérance thermique Curvularia (CThTV) à partir d&#39;un champignon endophyte est impliqué dans l&#39;interaction mutualisme entre ce champignon et une panic tropicaleref &quot;&gt; 29. Par conséquent, la connaissance des interactions entre les virus nouvellement trouvés et leurs hôtes devrait générer de nouvelles perspectives sur leur biologie et de gestion. Cependant, les nouveaux virus, en particulier les virus cachés présentant aucun signe typique d&#39; une infection aiguë, ont rarement été étudié, et nous avons besoin d&#39;un pipeline et des protocoles pour étudier les impacts des nouveaux virus trouvés sur leurs hôtes. Auparavant, nous avons rapporté la prévalence d&#39; une nouvelle monosense densovirus Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2) dans le ver de la capsule, Helicoverpa armigera, et présenté la preuve d&#39;une relation de mutualisme entre HaDV2 et la noctuelle 30 de coton, 31. Dans cet article, nous allons décrire le protocole de laboratoire pour étudier en détail l&#39;interaction entre HaDV2 et son hôte ver de la capsule. Le protocole présenté ici peut également être très utile pour les chercheurs qui examinent la role d&#39;autres virus transmis par voie orale, en particulier dans les lépidoptères nuisibles.

<table><tbody><tr><td>Plaque 24 puits</td><td>Corning</td><td>07-200-740</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>Kit d’extraction d’ADN</td><td>TIANGEN</td><td>DP304-03</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td>thermocycleur</td><td>Veriti ; Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro ; m filtre à membrane</td><td>Millipore</td><td>SLGS025NB</td><td></td></tr><tr><td>pEASY-T Cloning Vector</td><td>TransGen, Pékin, Chine</td><td>CT301-02</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>IDEAL-TEK</td><td>2.SA</td><td></td></tr><tr><td>Premix Ex Taq (Sonde qPCR)</td><td>Takara</td><td>RR390A</td><td></td></tr><tr><td>Sondes</td><td>Invitrogen</td><td>Commande</td><td></td>personnalisée</tr><tr><td>Amorces</td><td>Invitrogen</td><td>Commande personnalisée</td><td></td></tr><tr><td>microspectrophotométrie NanoDrop 2000c&nbsp ;</td><td>Thermo scientifique&nbsp ;</td><td>non disponible</td><td></td></tr><tr><td>7500 Système de PCR en temps réel</td><td>Applied Biosystems</td><td>non disponible</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope SZX-16</td><td>Olympus</td><td>non disponible</td><td></td></tr><tr><td>saccharose</td><td></td><td></td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>complexe vitaminique</td><td>Plusieurs fournisseurs disponibles.</td></tr></tbody></table>

protocoles pour étudier l&#39;hôte d&#39;un tissu de distribution, en mode de transmission, et l&#39;effet sur la remise en forme de l&#39;hôte d&#39;un densovirus dans le coton heliothis

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

De nombreux nouveaux virus ont été découverts chez des hôtes animaux en utilisant des technologies de séquençage de nouvelle génération. Auparavant, nous avons signalé un virus mutualisme, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), dans une espèce lépidoptères, le ver de la capsule, Helicoverpa armigera (Hubner). Ici, nous décrivons les protocoles qui sont actuellement utilisés pour étudier l&#39;effet de HaDV2 sur son hôte. Tout d&#39;abord, nous établissons un ver de la capsule sans HaDV2 colonie à partir d&#39;une seule paire d&#39;élevage. Ensuite, nous inocule par voie orale une progéniture avec des larves HaDV2-nouveau-né contenant du liquide filtré pour produire deux colonies avec le même fond génétique: une infection HaDV2, l&#39;autre non infectées. Un protocole pour comparer les paramètres du tableau de vie (par exemple, des larves, des pupes et les périodes d&#39;adulte et de la fécondité) entre les individus infectés par le HaDV2 et -uninfected est également présentée, ainsi que les protocoles de détermination de la distribution hôte tissu et l&#39; efficacité de transmission de HaDV2. Ces protocoles woULD également adapté pour étudier les effets d&#39;autres virus transmis oralement sur leurs hôtes d&#39;insectes hôtes, en particulier lépidoptères.

Descendances des parents qui ont été HaDV2 libres (figure 3A) ont été élevés comme la NONINF souche. Nous avons amplifié avec succès le gène d&#39;actine en utilisant les mêmes modèles d&#39;ADN, ce qui suggère que les modèles d&#39;ADN étaient de bonne qualité (figure 3B). De plus, les huit étaient également libres descendances sélectionnés au hasard de HaDV2 (figure 3C), HaNPV (figure 3D), et Wolbachia</em...

Nous présentons ici un protocole pour étudier la distribution hôte tissus, mode de transmission, et l&#39;effet sur l&#39;aptitude hôte d&#39;un densovirus au sein d&#39;une espèce lépidoptères, le ver de la capsule. Ce protocole peut être utilisé pour étudier l&#39;interaction entre autres virus transmis oralement et leurs hôtes d&#39;insectes.

Protocoles pour étudier l&#39;hôte d&#39;un tissu de distribution, en mode de transmission, et l&#39;effet sur la remise en forme de l&#39;hôte d&#39;un Densovirus dans le coton Heliothis

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

L'objectif général de ce protocole est d'étudier l'effet d'un Densovirus, HaDV2, sur son hôte, le vers gris (Cotton Bollworm). Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des interactions virus-hôte, telles que l'effet des virus désormais pathogènes sur leurs hôtes. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que les souches de larves positives et négatives au virus sont dérivées des mêmes parents-hôtes, garantissant ainsi un fond génétique identique.Pour commencer l'expérience, réalisez huit accouplements individuels par couple de papillons récemment émergés, en utilisant une cage en plastique par couple recouverte d'une gaze de coton afin d'assurer une bonne ventilation et de servir de support pour la ponte. Pour augmenter la probabilité d'obtenir une colonie exempte de virus, utilisez au moins 30 couples d'accouplements individuels. Nourrissez les papillons adultes avec une boule de coton imprégnée d'une solution de 10 % de sucre et de 2 % de vitamines, et renouvelez la solution quotidiennement.Dès aujourd'hui, après l'accouplement, puisque les femelles adultes pondent leurs œufs sur la gaze de coton, commencez à remplacer la gaze quotidiennement. Récoltez et conservez les gazes contenant les œufs dans la même chambre de croissance que les papillons adultes, jusqu'à l'éclosion des œufs. Transférez immédiatement les larves nouvellement écloses vers de nouvelles plaques 24-puits, avec un individu par puits.Cinq jours après la date de ponte du premier œuf, récupérez les papillons adultes et conservez-les dans de l'azote liquide. Recherchez la présence de HaDV2 chez les parents par PCR en utilisant des amorces spécifiques, et conservez les individus exempts de HaDV2 comme souche non infectée et libre de HaDV2. Récupérez les papillons adultes individuellement et conservez-les immédiatement dans de l'azote liquide.Broyez complètement les papillons individuels récoltés dans de l'azote liquide à l'aide d'un mortier et d'un pilon stérilisés. Transférez environ 10 microgrammes de débris dans un tube propre de 1,5 millilitre. Ensuite, transférez les débris restants dans un nouveau tube, puis stockez-les immédiatement à 80 degrés Celsius.Extraire l'ADN à partir de 10 microgrammes de débris en suivant les protocoles fournis par le fabricant. Une fois l'ADN du papillon isolé, vérifier la présence de HaDV2 en utilisant le protocole. En fonction des résultats, répartir les débris restants en deux groupes : positifs à HaDV2 et négatifs à HaDV2.Ajouter un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate, ou PBS, à chaque échantillon afin de dissoudre complètement les débris larvaires résiduels. Prérefroidir la centrifugeuse à quatre degrés Celsius, puis centrifuger l'homogénéat. Filtrer le surnageant liquide à l’aide d’un filtre membranaire de 0,22 micron, en gardant l’échantillon sur glace.Prélevez 200 microlitres par tube des liquides filtrés, puis stockez-les immédiatement à 80 degrés Celsius. Pour déterminer l'efficacité d'infection orale à l'aide des liquides filtrés infectés par HaDV2 à différentes concentrations, diluez le liquide contenant HaDV2. Dans une hotte, répartissez uniformément 200 microlitres de liquides filtrés contenant HaDV2 pour chaque concentration à la surface du régime artificiel solide.Ensuite, commencez à transférer 100 larves écloses récemment vers le milieu artificiel contenant le HaDV2 dans une boîte de Pétri. Tapez doucement le tulle de coton contenant les larves écloses afin de faire passer les larves du tulle vers une feuille de papier blanc. Secouez doucement le papier afin que les larves produisent de la soie et s'envolent du papier.Utilisez des pinces stérilisées pour toucher la soie et déplacer les larves vers une boîte de Pétri. Après 48 heures, transférez un individu larvaire par puits sur le régime artificiel dans des plaques à 24 puits. Élevez les larves inoculées avec HaDV2, en utilisant les mêmes concentrations, jusqu'au stade adulte.Vérifiez le statut d'infection par HaDV2 des adultes en utilisant le protocole. Les adultes inoculés avec 10 à la puissance huit copies par microlitre de HaDV2 présentaient une infection à 100 % et sont conservés comme souche positive pour HaDV2. Pour prévenir toute contamination, stérilisez les pinces et les ciseaux trois fois dans de l'éthanol à 75 %, puis chauffez-les à la flamme d'une lampe à alcool.À l’aide d’une balance analytique, peser les tubes vides qui seront utilisés pour stocker les tissus. Ensuite, placer les larves et les papillons adultes de la souche infectée sur de la glace pendant environ cinq minutes. Fixer les larves congelées sur du cystosepiment à l’aide de deux épingles à insectes insérées dans les membranes intersegmentaires près de la tête et du dernier segment abdominal.Ensuite, dans l'abdomen postérieur, couper la fausse patte des larves afin que l'hémolymphe s'écoule. Utiliser une pipette pour prélever environ 10 microlitres d'hémolymphe larvaire en moins de 10 secondes afin d'éviter le brunissement et la coagulation de l'hémolymphe. À l'aide d'une paire de ciseaux, pratiquer une incision dans la cuticule allant de la dernière membrane intersegmentaire jusqu'à la tête.À l’aide de deux paires de forceps, disséquez l’intestin antérieur, l’intestin moyen, l’intestin postérieur, le tissu adipeux et les tubes de Malpighi. Pour éviter la contamination des tissus restants par l’hémolymphe pendant la dissection, lavez les tissus disséqués dans un tampon PBS. Mélangez les échantillons tissulaires de trois individus ensemble pour former un seul réplicat.Transférez immédiatement chaque tissu dans les tubes contenant de l'azote liquide. Dans une boîte de Pétri propre contenant du tampon PBS, disséquez les tissus d'adultes femelles et mâles, puis transférez immédiatement chaque tissu dans les tubes contenant de l'azote liquide. Pesez séparément les tubes et les tissus mentionnés ci-dessus, puis calculez la masse des tissus.Extraire l'ADN à partir de ces tissus et réaliser une kPCR pour quantifier la charge virale de chaque tissu. Placer au moins 100 nymphes ou papillons adultes récemment émergés issus de la souche non infectée dans une cage en treillis métallique de 5 litres recouverte d'une gaze de coton. Après deux jours, les femelles adultes accouplées commenceront à pondre des œufs sur la gaze de coton.Collectez et conservez le tampon de gaze contenant les œufs. Procédez à l'inoculation des larves néonates en transférant les larves néonates de la souche non infectée sur le régime artificiel contenant HaDV2 afin d'établir la souche infectée. De la même manière, transférez des larves néonates sur le régime artificiel recouvert d'un liquide filtré exempt de HaDV2 pour établir les groupes témoins, c'est-à-dire la souche non infectée.Inclure au moins 240 larves pour chaque traitement. Après 48 heures, transférer un individu larvaire par puits dans des plaques de 24 puits. Numéroter séquentiellement chaque larve dans chaque puits et noter quotidiennement le stade d'instar et l'état de survie.Environ cinq jours plus tard, lorsque le régime artificiel se dégrade, transférez simultanément ces individus dans une nouvelle plaque 24-puits contenant du régime artificiel frais. Pesez les larves du septième au onzième jour à l’aide d’une balance analytique. Après la pesée, replacez les larves individuellement dans la plaque 24-puits.Après la mue au cinquième stade larvaire, environ dix jours après l'éclosion, transférez les larves dans des tubes en verre. Transférez les individus dans le tube en verre au même moment chaque jour. Les larves du cinquième stade peuvent également être identifiées par la largeur de la capsule céphalique.Ensuite, codez chaque larve avec son numéro de référence d'origine sur le tube en verre à l'aide de peinture ou de marqueurs. Notez quotidiennement l'état des larves. Enregistrez la date de nymphose et d'éclosion pour chaque individu dans le tube en verre, et notez la masse des nymphes âgées de trois jours.Après l'éclosion, placer une femelle et un mâle dans une même cage avec une solution de 10 % de saccharose et une solution vitaminée à 2 %. Renouveler la solution de saccharose chaque jour. Noter la date du décès de chaque papillon.Lorsque les œufs sont pondus, changer la gaze de coton quotidiennement. Compter immédiatement le nombre d'œufs. Enfin, compter les descendants nouvellement éclos au fur et à mesure de leur éclosion.Des essais en triple ont été réalisés afin de garantir la qualité des échantillons utilisés dans l'expérience. Les descendants issus des parents mâles et femelles non infectés par le HaDV2 ont été élevés comme souche non infectée. Nous avons amplifié avec succès le gène de l'actine chez les parents et les descendants en utilisant le même modèle d'ADN, ce qui suggère que les modèles d'ADN étaient de bonne qualité.Huit progénies choisies aléatoirement étaient également exemptes de HaDV2, de HaNPV et de Wolbachia. Une courbe standard définissant la relation entre le logarithme de la quantité de matériau initial et les valeurs de CT obtenues montre une forte corrélation linéaire entre les valeurs de CT et le logarithme du nombre initial de copies du gène de HaDV2. Le nombre de copies de HaDV2 a été calculé par microgramme de chaque tissu, et le pourcentage du titre total de HaDV2 pour le tissu spécifique a révélé que HaDV2 était principalement distribué dans le corps gras.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de manipuler délicatement les larves pendant les cinq premiers jours suivant leur éclosion, et ce, tout au long de la procédure.

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Immunologie et infection

Dans cette vidéo, nous avons la démonstration des techniques d'infection orale avec des larves de lépidoptères baculovirus afin de déterminer l'efficacité insecticide.

Protocoles pour l&#39;infection orale des larves de lépidoptères avec des baculovirus

L'amélioration de notre compréhension et notre capacité à gérer la plupart des virus de plantes transmises par les insectes nécessite l'utilisation du vecteur. Transmission par les insectes de virus de plantes est une interaction tritrophique, et à ce titre nécessite la manipulation d'insectes, virus, et les plantes. Vecteurs doivent être élevés en grand nombre et manipulés de manière à assurer des taux élevés de transmission des plantes d'essai. Les bases de l'élevage et la manipulation de...

La transmission des virus de plante à l&#39;aide aleurodes

Source: Liu, P., et al. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the process of isolating recombinant Aedes aegypti densovirus (rAaeDV) from infected mosquito-derived epithelial cells. The infected cells are collected and exposed to repeated freeze-thaw cycles for lysis. Lysate is centrifuged, and the supernatant containing viral particles is filtered, aliquoted, and...

Harvesting Recombinant Aedes aegypti Densovirus from Infected Cells

Nous décrivons ici d'une simple hybridation fluorescente in situ (FISH) Méthode pour la localisation des virus et des bactéries dans les tissus d'insectes et de plantes. Ce protocole peut être étendu pour la visualisation de l'ARNm dans la montagne ensemble et coupes microscopiques.

Fluorescence<em&gt; In situ</em&gt; Hybridations (FISH) pour la localisation des virus et des bactéries dans Endosymbiotic plantes et d&#39;insectes tissus

Les rats cotonniers sont extrêmement excitables et ont une forte réaction de fuite ou de combat. Une méthode de manipulation optimisée pour réduire le stress des animaux est décrite, qui rendra les rats cotonniers plus accessibles en tant que modèle préclinique.

Manipulation du Rat coton en études pour l&#39;évaluation pré-clinique de virus oncolytiques

Nous rapportons en utilisant une artificiel intronic petit RNA expression stratégie à élaborer un recombinant non défectueux densovirus (AaeDV) Aedes aegypti in vivo système de livraison. Une procédure détaillée pour la construction, emballage et l’analyse quantitative des vecteurs rAaeDV aussi bien en ce qui concerne l’infection larvaire est décrite.

Utilisation d’un moustique Recombinant Densovirus comme un vecteur de livraison de gène pour l’analyse fonctionnelle des gènes chez les larves de moustiques

Tables de survie permettent de quantifier les sources et les taux de mortalité dans les populations d’insectes et de contribuent à comprendre, de prédire et de manipuler la dynamique des populations dans les agroécosystèmes. Méthodes pour réaliser et analyser les tableaux de vie fondées sur une cohorte dans le domaine pour un insecte avec les stades immatures sessiles sont présentées.

Méthodologie pour l’élaboration des Tables de survie pour les insectes sessiles dans le champ à l’aide de l’aleurode, Bemisia tabaci, en coton comme modèle d’un système

Nous présentons ici un protocole pour produire chambre carboxylestérase mouche protéines in vitro avec un système d’expression baculovirus médiée par cellule insectes et plus tard fonctionnellement caractériser leurs rôles en métabolisant perméthrine, ainsi, conférant aux pyréthrinoïdes résistance en procédant à base de cellules MTT dosage et in vitro études métaboliques.

Caractérisation fonctionnelle des carboxylestérases chez les mouches maison résistant aux insecticides, Musca Domestica

Ici, un protocole est présenté pour le criblage non destructif soudifieux rapide des génotypes de coton pour la résistance aux nématodes reniformes. Le protocole consiste à examiner visuellement les racines des semis de coton infectés par les nématodes afin de déterminer la réponse à l'infection. La pousse végétative de chaque plante est ensuite propagée pour récupérer les plantes pour la production de semences.

Dépistage des génotypes de coton pour la résistance au nématode reniforme

Ce protocole décrit comment établir une infection virale in vivo chez Drosophila melanogaster en utilisant la méthode de nano-injection et les techniques de base pour analyser l’interaction virus-hôte.

Mise en place d’une Infection virale et analyse de l’Interaction hôte-Virus chez Drosophila Melanogaster

Nous décrivons une méthode d’immunofluorescence et quantitative de PCR pour la localisation et la quantification des bégomovirus dans les tissus d’insecte. Le protocole d’immunofluorescence peut être utilisé pour colocaliser les protéines virales et vectorielles. Le protocole pcR quantitatif peut être étendu pour quantifier les virus dans des corps entiers de mouche blanche et des plantes infectées par le virus.

Localisation et quantification des bégomovirus dans les tissus de la mouche blanche par immunofluorescence et PCR quantitatif

Découvrez les protocoles pour étudier la distribution tissulaire, le mode de transmission et l'effet sur la fitness de l'hôte du densovirus HaDV2 chez Heliothis armigera. Cette méthode permet de générer des souches positives et négatives avec le même arrière-plan génétique.

Protocoles pour étudier lhôte dun tissu de distribution, en mode de transmission, et leffet sur la remise en forme de lhôte dun Densovirus dans le coton Heliothis (Vidéo) | JoVE Journal

Protocoles pour étudier l'hôte d'un tissu de distribution, en mode de transmission, et l'effet sur la remise en forme de l'hôte d'un Densovirus dans le coton Heliothis

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