Racine Dorsale Ganglion Injection et Racine Dorsale Crush blessures comme modèle pour la régénération sensorielle Axon

Le but de cette approche chirurgicale est d’appliquer directement des traitements au niveau du corps cellulaire neuronal, et d’évaluer la régénération axonale suite à une intervention thérapeutique, sans avoir à réaliser une lésion plus dommageable au sein du système nerveux central. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération axonale, telles que : les axones traités thérapeutiquement peuvent-ils se régénérer dans la moelle épinière et éventuellement atteindre les cibles du tronc cérébral ? Le principal avantage de cette technique est que les chercheurs peuvent examiner la régénération axonale du SNC sans avoir à blesser directement la moelle épinière.

Cela réduit les complications post-chirurgicales et améliore le bien-être des animaux. Commencez par anesthésier correctement l’animal. Confirmation d’un plan chirurgical d’anesthésie par l’absence de réaction à un pincement de l’orteil.

Ensuite, pesez l’animal et notez le poids préopératoire. Pour une injection chirurgicale de DRG, rasez la fourrure sur le cou d’entre les oreilles jusqu’en dessous jusqu’à l’omoplate. Désinfectez la zone rasée avec un produit antiseptique.

Injectez deux millilitres de solution saline par voie sous-cutanée sur le flanc de l’animal, ainsi qu’une dose appropriée d’analgésique et d’antibiotique. Appliquez une pommade oculaire sur les deux yeux pour éviter le dessèchement de la cornée pendant la procédure. Placez l’animal dans un cadre stéréotaxique rachidien et placez un coussin chauffant à 37 degrés Celsius sous l’animal.

Commencez la chirurgie en localisant les apophyses épineuses C2 et T2 proéminentes sur la peau. Ensuite, utilisez un scalpel numéro 10 pour faire une incision cutanée entre les apophyses épineuses C2 et T2. Une fois la peau ouverte, une ligne médiane de tissu fibreux blanc devrait être visible sur la première couche du muscle, qui a une texture gélatineuse.

Faites une incision de taille similaire sur la première couche de muscle le long de la ligne médiane blanche. N’allez pas au-delà du premier processus épineux T2 proéminent, car il y a un vaisseau sanguin majeur situé à proximité. Rétractez la première couche musculaire à l’aide de deux écarteurs, l’un placé rostrally, et l’autre caudal.

La deuxième couche musculaire d’aspect strié devrait maintenant être visible. Localisez la ligne médiane de la deuxième couche musculaire, où l’on peut observer deux muscles longitudinaux, reliés par un tissu mince et membraneux. Ensuite, utilisez une paire de micro-ciseaux pour disséquer le tissu membraneux et séparer les deux muscles longitudinaux.

Ajustez les écarteurs pour exposer la troisième couche de muscle mince recouvrant la colonne vertébrale. Les apophyses épineuses peuvent être ressenties en touchant légèrement avec une paire de pinces sur la troisième couche musculaire. Utilisez des micro-ciseaux pour faire une petite incision sur la troisième couche de muscle et grattez doucement le muscle de l’os, à l’aide d’une curette ou d’un scalpel de manière latérale, pour exposer clairement les vertèbres.

Pour exposer les DRG C5 à C8 gauches, utilisez une paire de cisailles osseuses fines pour effectuer une hémi-laminectomie gauche sur les vertèbres C4 à T1, en retirant soigneusement une partie de la lame et du pédicule. Une fois qu’une quantité suffisante de DRG a été exposée pour l’injection, préparez la seringue en plaçant la seringue de microlitre remplie de virus équipée d’une aiguille émoussée de calibre 33 sur mesure sur le porte-seringue stéréotaxique. Ensuite, utilisez une aiguille biseautée de calibre 30 pour faire une petite ouverture superficielle sur chacun des DRG ciblés afin de faciliter l’insertion de l’aiguille d’injection.

Ajustez doucement les coordonnées stéréotaxiques pour insérer l’aiguille de calibre 33 au centre du DRG. Idéalement, l’aiguille doit être placée au centre même du DRG pour assurer une diffusion uniforme de la solution d’injecteur dans tout le DRG. Une fois l’aiguille insérée, utilisez la pompe à seringue pour injecter un microlitre du virus dans chaque DRG.

Pendant l’injection, le DRG changera lentement de couleur si la solution virale contient un colorant coloré. N’insérez pas trop l’aiguille, car cela pourrait provoquer une fuite de liquide par la face ventrale du DRG. En cas de fuite pendant l’injection, ajustez immédiatement la position de l’aiguille.

Trois minutes après la fin de l’injection, retirez l’aiguille d’injection. Pour effectuer une blessure simultanée par écrasement de la racine dorsale C5 à C8, écrasez chaque racine trois fois pendant 10 secondes, à l’aide d’une paire de pinces à pointe fine. Opposez complètement les extrémités de la pince.

Une ligne blanche dans le tissu devrait apparaître au site d’écrasement. Après les chirurgies, assurez-vous qu’il n’y a pas de saignement ou de petits morceaux de fragments d’os au site d’incision avant de fermer. Si vous le souhaitez, placez un petit morceau d’éponge résorbable chirurgicale sur la moelle épinière exposée et le DRG.

Permettez à la troisième couche du muscle de se rétracter naturellement sur la colonne vertébrale, sans suture. Suturez sans serrer les deux muscles longitudinaux de la deuxième couche avec un matériau de suture résorbable 6-0. Suturez la première couche musculaire avec un matériau de suture résorbable 6-0.

Suturez la peau avec un matériau de suture résorbable 5-0. Si des saignements abondants se sont produits pendant l’opération, injectez par voie sous-cutanée un à deux millilitres de solution saline pour reconstituer la perte de liquide de l’animal, comme le permettent les réglementations locales. Fournissez un gel hydratant comestible et permettez à l’animal de se remettre complètement de l’anesthésie.

Surveillez fréquemment l’animal pendant au moins une heure avant de retourner dans l’aire d’attente. Les images suivantes montrent la récupération des animaux post-chirurgicaux au premier jour, au septième jour, après l’ablation des sutures cutanées et au 14e jour. Une semaine avant le prélèvement de tissus, anesthésie correctement l’animal comme avant, puis stabilise la patte avant gauche en collant le membre à la table.

Avant l’injection de CTB, utilisez une aiguille biseautée de calibre 30 pour faire une petite ouverture superficielle sur la peau afin de faciliter l’insertion de l’aiguille d’injection. Ensuite, à l’aide d’une seringue d’un microlitre équipée d’une aiguille courte de calibre 33 sur mesure, injectez lentement un microlitre de 1 % CTB par voie sous-cutanée au centre du coussinet plantaire glabre et des quatre doigts. Laissez l’animal se remettre complètement de l’anesthésie avant de retourner dans la zone d’attente.

Cette image montre le résultat de l’injection de DRG sans blessure par écrasement de la racine dorsale. Les corps cellulaires et les axones positifs à la GFP dans la moelle épinière sont clairement visibles quatre semaines après l’injection de AAV5GFP. Cette image à fort grossissement montre les axones de la colonne dorsale et de la corne dorsale.

Les corps cellulaires marqués GFP dans le DRG sont vus ici. Cette image montre des terminaisons axonales CTB positives dans le noyau cunéiforme une semaine après l’injection de CTB. Les images suivantes montrent les résultats d’une blessure complète par écrasement de la racine dorsale.

Comme on le voit ici, les axones sensoriels axotomisés marqués à la GFP peuvent se régénérer jusqu’à la zone d’entrée de la racine dorsale, mais pas dans la moelle épinière après une blessure. Il s’agit d’une image du noyau cunéiforme chez le même animal. Les terminaisons axonales positives au CTB sont absentes à la suite d’une blessure complète par écrasement de la racine dorsale.

La présence d’axones marqués dans la moelle épinière après une blessure représente soit une lésion incomplète, soit une régénération. La présence de terminaisons CTB positives dans le noyau cunéiforme suggère une lésion incomplète, tandis que leur absence suggère une lésion complète et potentiellement une régénération partielle de la moelle épinière. Lors de cette procédure, il est important d’enlever juste la bonne quantité d’os vertèbres pour exposer le DRG et la racine dorsale, sans induire de dommages indésirables, en particulier à la moelle épinière.

Sinon, cela peut entraîner des complications post-chirurgicales inattendues. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une injection de DRG. Vous pouvez incorporer d’autres techniques telles que les lésions de la colonne vertébrale centrale, l’électrophysiologie, les tests de comportement et l’analyse anatomique pour examiner les régénérations axonales.