Analyse d'immunofluorescence de la formation de granules de stress après le dépistage bactérien des cellules de mammifères

Nous décrivons une méthode pour l'analyse qualitative et quantitative de la formation de granules de stress dans des cellules de mammifères après que les cellules sont confrontées à des bactéries et à un certain nombre de contraintes différentes. Ce protocole peut être appliqué pour étudier la réponse des granules de stress cellulaire dans une large gamme d'interactions hôtes-bactéries.

L’objectif global de cette expérience est d’évaluer les effets d’une infection bactérienne sur la capacité des cellules hôtes à former des granules de stress en réponse à un stress exogène. Cette méthode est un outil précieux dans le domaine de la microbiologie cellulaire pour évaluer si un agent pathogène donné est capable ou non de modifier ou de subvertir l’ensemble de la voie des granules de stress. Le principal avantage de cette technique est que les granules de stress peuvent être analysés qualitativement et quantitativement de manière rigoureuse et automatisée à l’aide de programmes d’analyse d’images gratuits.

Cette méthode donne un aperçu de la dynamique de la formation et de la composition des granules de stress et de la façon dont ces paramètres sont affectés par un agent pathogène spécifique. Merci. Avant de commencer le défi, inoculez une colonie de bactéries rouges S.flexneri M90T à partir d’une plaque de gélose tryptique de soja 1 % Congo fraîchement striée dans un tube conique de 15 millilitres, contenant huit millilitres de bouillon de soja tryptique.

Après avoir serré le couvercle, incubez la colonie pendant la nuit en secouant à 222 tr/min et 30 degrés Celsius. Le lendemain, sous-cultivez 150 microlitres de la bactérie dans huit millilitres de bouillon de soja tryptique frais pendant environ deux heures à 37 degrés Celsius et 222 tr/min pour initier une induction tardive de la phase exponentielle de l’expression du gène de virulence et pour améliorer l’infectibilité bactérienne. Lorsque la densité optique de la sous-culture est comprise entre 0,6 et 0,9, transférez un millilitre de bactéries dans un tube de 1,5 millilitre pour leur collecte par centrifugation.

Et remettre la pastille en suspension dans le milieu d’infection à une densité optique de un. Ensuite, aspirez les surnageants de chaque puits d’une culture de lamelle de cellules HeLa. Et lavez soigneusement les cellules HeLa avec 500 microlitres de milieu cellulaire HeLa frais à température ambiante par puits.

Remplacez le lavage par 500 microlitres de milieu d’infection par puits et centrifugez la plaque à 24 puits pour faire tourner les bactéries sur les cellules. Transférez les cocultures bactériennes stabilisées dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour faciliter l’infection de la cellule hôte. À la fin de l’incubation, éliminez les bactéries exogènes des cellules avec trois rinçages dans un millilitre de milieu de culture frais HeLa à 37 degrés Celsius par lavage.

Ensuite, couvrez les cellules infectées avec un millilitre de milieu de culture frais contenant de la gentamicine et remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation, remplacez le milieu par 500 microlitres du milieu de culture approprié, complété par le facteur de stress d’intérêt, et retournez les cellules dans l’incubateur de culture tissulaire. Après une heure, aspirez complètement le surnageant et fixez les échantillons dans 0,5 millilitre de paraformaldéhyde à température ambiante à 4 % dans du PBS pendant 30 minutes.

Ensuite, jetez le fixateur dans le récipient à déchets approprié et lavez les lamelles avec un millilitre de solution saline tamponnée au tris pendant deux minutes en secouant doucement. A la fin du lavage, aspirez complètement le TBS et perméabilisez les cellules de chaque puits avec 500 microlitres de 0,3 % de Triton X-100 dans du TBS. Après 10 minutes, remplacez la solution de perméabilisation par un millilitre de TBS, faites tourner doucement la plaque et remplacez le TBS par un millilitre de solution de blocage pendant une heure à température ambiante.

Pour marquer les cellules avec un cocktail d’anticorps primaires d’intérêt, placez 50 microlitres du mélange d’anticorps primaires par lamelle sur un morceau de Parafilm en plastique solidement fixé sur la paillasse. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, ramassez la première lamelle. Et tamponnez le bord de la lamelle sur un morceau de papier de soie pour enlever l’excès de liquide.

Placez soigneusement la lamelle sur la goutte et incubez les lamelles dans les conditions d’étiquetage appropriées. À la fin de l’incubation de l’anticorps primaire, transférez chaque lamelle dans un puits individuel d’une nouvelle plaque de 24 puits contenant un millilitre de TBS par puits, et lavez les cellules à température ambiante sur un agitateur à plaque pendant cinq minutes trois fois. Après le dernier lavage, étiquetez les cellules de chaque lamelle avec le mélange de cocktail d’anticorps secondaires approprié, comme nous venons de le démontrer.

Et incubez les lamelles dans l’obscurité pendant une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation secondaire du marquage des anticorps, lavez les cellules dans un millilitre de PBS trois fois dans une nouvelle plaque à 24 puits en secouant doucement comme nous venons de le démontrer, mais à l’abri de la lumière. Après le dernier lavage, trempez brièvement chaque lamelle dans de l’eau déminéralisée pour enlever le sel, tamponnez les bords de la lamelle sur un mouchoir en papier et montez soigneusement les lamelles sur cinq microlitres de support de montage en fluorescence par lame de microscope en verre sans bulles.

Scellez ensuite la lamelle avec du vernis à ongles. Et stockez les lames comme il convient jusqu’à l’imagerie. Pour imager les cellules par microscopie confocale à fluorescence, commencez par sélectionner l’objectif approprié et les canaux fluorescents appropriés pour l’acquisition d’images.

Ensuite, acquérez des piles d’images des cellules à l’aide du logiciel d’imagerie approprié. Une fois que toutes les images ont été capturées, utilisez le logiciel d’analyse d’imagerie approprié pour réduire les piles d’images et les enregistrer sous forme de fichiers TIFF. Ensuite, chargez une commande et une image TIFF expérimentale sur la plate-forme d’analyse d’images, puis sélectionnez Table de correspondance pour ouvrir les paramètres de canal dans la fenêtre Séquence.

Cliquez sur toutes les cases à cocher de l’onglet des chaînes pour désactiver toutes les chaînes. Cliquez ensuite sur le canal zéro, puis sur la barre de couleur du canal zéro pour sélectionner la couleur préférée, en augmentant l’intensité du canal si nécessaire pour visualiser toutes les structures. Après avoir sélectionné et ajusté chacun des canaux de couleur appropriés pour l’analyse expérimentale, sélectionnez l’onglet Canevas et ajustez l’onglet Zoom pour visualiser environ 10 cellules par champ d’affichage.

À l’aide de l’outil polygone, cliquez sur la cellule qui vous intéresse et prolongez la ligne autour de la cellule pour délimiter la limite de la cellule. Pour nommer cette région d’intérêt, dans la fenêtre de la région d’intérêt, faites un clic droit sur la cellule d’intérêt, puis double-cliquez sur le nom de la région d’intérêt pour la modifier. Après avoir sélectionné et nommé toutes les cellules d’intérêt de la même manière, ouvrez l’application Spot Detector dans l’onglet détection et suivi.

Ouvrez l’onglet Prétraitement et sélectionnez le canal à analyser. Dans l’onglet Détecteur, sélectionnez Détecter les points lumineux sur fond sombre et sélectionnez l’échelle et la sensibilité appropriées. Sous l’onglet Région d’intérêt, sélectionnez la région d’intérêt suggérée dans la séquence.

Sous l’onglet Filtrage, sélectionnez NoFiltering. Dans l’onglet Sortie, sélectionnez la sortie appropriée. Sélectionnez Supprimer les points précédents affichés en tant que régions d’intérêt et cliquez sur Aucun fichier sélectionné pour sélectionner le dossier d’enregistrement du fichier.

Ensuite, sous l’onglet Affichage, sélectionnez les options qui vous intéressent et cliquez sur Démarrer la détection. Dans le logiciel d’analyse d’imagerie, le détecteur ponctuel peut être utilisé pour identifier les granules de stress dans chacune des régions d’intérêt désignées. Une image binaire peut ensuite être générée pour afficher tous les granules de stress identifiés.

L’analyse des granules de stress doit être soigneusement adaptée à chaque marché de granules de stress analysé. Par exemple, la modification de la taille requise de la région d’intérêt détectée ou la modification de la sensibilité des paramètres de détection conduisent à des résultats variables. À des échelles de pixels plus élevées, les granules de contrainte plus petits ne seront pas comptés et le nombre de granules de contrainte diminuera.

Alors que l’augmentation de la sensibilité entraîne une augmentation du nombre de granules de stress. Par exemple, dans cette expérience, une échelle de deux avec une sensibilité de 100 a donné le meilleur résultat à partir du marqueur de granules de stress G3BP1. Alors qu’une échelle de deux avec une sensibilité de 55 a donné le meilleur résultat pour le marqueur de granules de stress EIF3B.

La surface peut ensuite être calculée à partir de la taille des granules de contrainte. Les graphiques de distribution de fréquence sont utiles pour mettre en évidence les changements de taille des granules de stress entre différentes populations cellulaires. De plus, l’intensité de la fluorescence peut fournir des informations sur la qualité des granules de stress analysés.

Une fois maîtrisé, l’ensemble du défi cellulaire peut être réalisé en six à sept heures environ, et l’analyse peut être terminée en deux à trois heures supplémentaires. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de toujours traiter les échantillons de contrôle et les échantillons expérimentaux en même temps et dans les mêmes conditions afin de minimiser la variabilité au sein des données. À la suite de cette procédure, l’analyse peut également être étendue à un volume tridimensionnel pour obtenir des informations supplémentaires sur la localisation des granules de stress.

Cette procédure semi-automatisée permet une analyse rigoureuse et impartiale des granules de stress dans les cellules non infectées et infectées. Il peut révéler des sous-versions jusqu’alors inconnues de la voie des granules de stress. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’infecter les cellules avec des bactéries, de la façon d’induire la formation de granules de stress et de la façon d’utiliser une approche semi-automatisée pour analyser les granules de stress de manière qualitative et quantitative.

Et n’oubliez pas qu’avec Shigella flexneri et les granules de stress, les agents induisant comme le clotrimazole peuvent être dangereux, et que des précautions telles que le port de gants, le travail dans un laboratoire BL2 et l’élimination appropriée de tous les réactifs sont nécessaires.