Analyse d'immunofluorescence de la formation de granules de stress après le dépistage bactérien des cellules de mammifères

L'objectif général de cette expérience est d'évaluer les effets d'une infection bactérienne sur la capacité des cellules hôtes à former des granules de stress en réponse à un stress exogène. Cette méthode constitue un outil précieux dans le domaine de la microbiologie cellulaire pour déterminer si un pathogène donné est capable ou non de modifier ou de subvertir l'ensemble de la voie de formation des granules de stress. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que les granules de stress peuvent être analysés de manière qualitative et quantitative de façon rigoureuse et automatisée à l'aide de programmes gratuits d'analyse d'images.

Cette méthode permet d'obtenir des informations sur la dynamique de la formation et de la composition des granules de stress, ainsi que sur la manière dont ces paramètres sont influencés par un pathogène spécifique. Merci. Avant de commencer le test, inoculez une colonie rouge de bactéries S.flexneri M90T provenant d'une boîte de gélose au tryptone-soja additionnée de 1 % de rouge Congo récemment striée dans un tube conique de 15 millilitres contenant huit millilitres de bouillon de culture au tryptone-soja.

Après avoir serré le couvercle, incuber la colonie toute la nuit avec agitation à 222 tr/min et à 30 degrés Celsius. Le jour suivant, sous-cultiver 150 microlitres des bactéries dans huit millilitres de bouillon nutritif trypticasé soja frais pendant environ deux heures à 37 degrés Celsius et 222 tr/min afin d'initier une induction en phase exponentielle tardive de l'expression des gènes de virulence et d'améliorer l'infectiosité bactérienne. Lorsque la densité optique du sous-cultivé se situe entre 0,6 et 0,9, transférer un millilitre des bactéries dans un tube de 1,5 millilitre pour leur collecte par centrifugation.

Et re-suspendre le culot dans le milieu d'infection à une densité optique de un. Ensuite, aspirer les surnageants de chaque puits d'une culture de lamelles de cellules HeLa. Et laver soigneusement les cellules HeLa avec 500 microlitres de milieu frais pour cellules HeLa à température ambiante par puits.

Remplacer le lavage par 500 microlitres de milieu d'infection par puits, puis centrifuger la plaque de 24 puits afin de faire adhérer les bactéries aux cellules. Transférer les cocultures bactériennes sédimentées dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour favoriser l'infection des cellules hôtes. À la fin de l'incubation, éliminer les bactéries exogènes des cellules par trois rinçages avec un millilitre de milieu de culture HeLa frais à 37 degrés Celsius par lavage.

Ensuite, recouvrir les cellules infectées avec un millilitre de milieu de culture frais contenant de la gentamicine et replacer la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire. À la fin de l'incubation, remplacer le milieu par 500 microlitres du milieu de culture approprié, supplémenté avec le facteur de stress d'intérêt, puis replacer les cellules dans l'incubateur de culture tissulaire. Après une heure, aspirer complètement le surnageant et fixer les échantillons dans 0,5 millilitre de paraformaldéhyde à 4 % à température ambiante dans le tampon PBS pendant 30 minutes.

Ensuite, jetez le fixateur dans le contenant à déchets approprié et lavez les lamelles avec un millilitre de solution saline tamponnée au tris pendant deux minutes en agitant doucement. À la fin du lavage, aspirez complètement le TBS et perméabilisez les cellules dans chaque puits avec 500 microlitres de Triton X-100 à 0,3 % dans le TBS. Après 10 minutes, remplacez la solution de perméabilisation par un millilitre de TBS, agitez doucement la plaque, puis remplacez le TBS par un millilitre de solution de blocage pendant une heure à température ambiante.

Pour marquer les cellules avec un cocktail d'anticorps primaires d'intérêt, déposez 50 microlitres du mélange d'anticorps primaires par lamelle sur un morceau de Parafilm en plastique solidement fixé sur le plan de travail. Utilisez ensuite une pince pour prendre la première lamelle et essuyez-en le bord sur un morceau de papier absorbant afin d'éliminer le liquide excédentaire.

Placez soigneusement la lame couvre-objet sur la goutte et incubez les lames couvre-objets dans les conditions d'étiquetage appropriées. À la fin de l'incubation avec l'anticorps primaire, transférez chaque lame couvre-objet dans un puits individuel d'une nouvelle plaque de 24 puits contenant un millilitre de TBS par puits, puis lavez les cellules à température ambiante sur un agitateur de plaque pendant cinq minutes, trois fois. Après le dernier lavage, étiquetez les cellules sur chaque lame couvre-objet avec le mélange adéquat de cocktail d'anticorps secondaires, comme vient de l'être démontré.

Et incuber les lamelles à l’obscurité pendant une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation avec l’anticorps secondaire, laver les cellules trois fois dans un millilitre de PBS dans une nouvelle plaque de 24 puits avec un léger agitation, comme vient d’être démontré, mais à l’abri de la lumière. Après le dernier lavage, tremper brièvement chaque lamelle dans de l’eau déionisée pour éliminer le sel, essuyer délicatement les bords des lamelles sur un papier absorbant, puis monter soigneusement les lamelles sur cinq microlitres de milieu de montage fluorescent par lame de microscope en verre, sans former de bulles.

Ensuite, scellez la lame avec du vernis à ongles. Conservez les lames comme il convient jusqu'à l'acquisition d'images. Pour observer les cellules en microscopie confocale à fluorescence, commencez par sélectionner l'objectif approprié ainsi que les canaux fluorescents adéquats pour l'acquisition d'images.

Ensuite, acquérez des séries d'images des cellules à l'aide du logiciel d'imagerie approprié. Une fois toutes les images capturées, utilisez le logiciel d'analyse d'image adéquat pour fusionner les séries d'images et enregistrer les séries au format TIFF. Chargez ensuite une image TIFF témoin et une image TIFF expérimentale sur la plateforme d'analyse d'image, puis sélectionnez Table de correspondance pour ouvrir les paramètres de canal dans la fenêtre Séquence.

Cliquez sur toutes les cases à cocher des onglets de canal pour désactiver tous les canaux. Ensuite, cliquez sur le canal zéro et sur la barre de couleur du canal zéro pour sélectionner la couleur souhaitée, en augmentant l'intensité du canal selon les besoins afin de visualiser toutes les structures. Après avoir sélectionné et ajusté chacun des canaux de couleur appropriés pour l'analyse expérimentale, sélectionnez l'onglet « canvas » et ajustez l'onglet de zoom pour visualiser environ 10 cellules par champ d'observation.

À l’aide de l’outil polygone, cliquez sur la cellule d’intérêt et prolongez la ligne autour de la cellule pour délimiter sa frontière. Pour nommer cette région d’intérêt, dans la fenêtre de région d’intérêt, effectuez un clic droit sur la cellule d’intérêt, puis double-cliquez sur le nom de la région d’intérêt pour le modifier. Après avoir sélectionné et nommé toutes les cellules d’intérêt de la même manière, ouvrez l’application Spot Detector dans l’onglet détection et suivi.

Ouvrez l'onglet Prétraitement et sélectionnez le canal à analyser. Dans l'onglet Détecteur, sélectionnez Détecter les points brillants sur fond sombre et choisissez l'échelle et la sensibilité appropriées. Sous l'onglet Région d'intérêt, sélectionnez la région d'intérêt suggérée à partir de la séquence.

Sous l'onglet Filtrage, sélectionnez Aucun filtrage. Dans l'onglet Sortie, sélectionnez la sortie appropriée. Sélectionnez Supprimer les points précédents rendus comme régions d'intérêt et cliquez sur aucun fichier sélectionné pour choisir le dossier où enregistrer le fichier.

Ensuite, sous l'onglet Affichage, sélectionnez les options appropriées d'intérêt et cliquez sur Démarrer la détection. À l'aide du logiciel d'analyse d'image, le détecteur de points peut être utilisé pour identifier les granules de stress dans chacune des régions d'intérêt désignées. Une image binaire peut alors être générée pour afficher tous les granules de stress identifiés.

L'analyse des granules de stress doit être soigneusement adaptée à chaque marché de granules de stress analysé. Par exemple, modifier la taille requise de la région d'intérêt détectée ou changer la sensibilité des paramètres de détection conduit à des résultats variables. À des échelles de taille de pixel plus élevées, les plus petits granules de stress ne seront pas comptabilisés, et le nombre de granules de stress diminuera.

Alors que l'augmentation de la sensibilité entraîne une augmentation du nombre de granules de stress. Par exemple, dans cette expérience, une échelle de deux avec une sensibilité de 100 a donné le meilleur résultat pour le marqueur de granules de stress G3BP1. Alors qu'une échelle de deux avec une sensibilité de 55 a donné le meilleur résultat pour le marqueur de granules de stress EIF3B.

La surface peut ensuite être calculée à partir de la taille des granules de stress. Les graphiques de distribution de fréquence sont utiles pour mettre en évidence les décalages de taille des granules de stress entre différentes populations cellulaires. En outre, l'intensité de la fluorescence peut fournir des informations sur la qualité des granules de stress analysés.

Une fois maîtrisée, l'épreuve sur cellules entières peut être réalisée en environ six à sept heures, et l'analyse peut être achevée en deux à trois heures supplémentaires. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de toujours traiter simultanément les échantillons témoins et expérimentaux et dans les mêmes conditions afin de minimiser la variabilité des données. Après cette procédure, l'analyse peut également être étendue à un volume tridimensionnel afin d'obtenir des informations supplémentaires sur la localisation des granules de stress.

Cette procédure semi-automatisée permet une analyse rigoureuse et impartiale des granules de stress dans des cellules non infectées et infectées. Elle peut révéler des détournements auparavant inconnus de la voie des granules de stress. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment infecter des cellules avec des bactéries, comment induire la formation de granules de stress, et comment utiliser une approche semi-automatisée pour analyser les granules de stress de manière qualitative et quantitative.

Et n'oubliez pas que Shigella flexneri et les agents inducteurs de granules de stress, tels que le clotrimazole, peuvent présenter des dangers, et que des précautions telles que le port de gants, le travail en laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BL2) et l'élimination appropriée de tous les réactifs sont nécessaires.