Name: Analyse des molécule laser Localisés psoralène adduits (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Découvrez l'analyse moléculaire des réticulations interbrins localisées par laser dans l'ADN génomique. Cette méthode permet l'imagerie directe des lésions ADN et l'étude des réponses cellulaires aux dommages génétiques.

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Cette recherche a été financée en partie par le programme de recherche intra-muros des NIH, l&#39;Institut national sur le vieillissement (Z01 AG000746-08) et le Fonds de recherche anémie de Fanconi.

1. Préparation de Dig-TMP <ol><li> Mélanger 50 mg (0,18 mmoles) de 4&#39;-chlorométhyl-4,5&#39; , 8-triméthylpsoralène et 590 mg (2,7 mmoles) de 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amine dans 25 ml rond sec flacon -bottom sous azote. Ajouter 10 ml de toluène et reflux pendant 12 h. Retirer le solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite. <ol><li> Purifier le résidu par Chromatographie sur colonne éclair sur gel de silice. Eluer la colonne avec du chloroforme, de methanol, et 28% de solution d&#39;ammoniac (9: 1: 0,5). Evaporer le solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite, et récupérer le pur 4 « - [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminométhyl-4,5 », 8-triméthylpsoralène comme visqueuse jaune pâle liquide. </li><li> Mélanger 5,5 mg (0,012 mmoles) de 4 &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminométhyl-4,5&#39;, 8-triméthylpsoralène avec 5 mg (0,008 mmoles) d&#39;ester NHS dans la digoxigénine un ballon à fond rond sec sous azote. Ajouter 0,5 mL anhydre de diméthylformamide (DMF) und 3,4 ul de triméthylamine et on agite à 50 ° C pendant 18 h. </li><li> Retirer le solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite. </li><li> Dissoudre le résidu dans une quantité minimale de dichlorométhane. Appliquer la solution dans les points 2 pl horizontalement à travers le fond d&#39;une plaque preparative sur couche mince de gel de silice comme phase stationnaire. Exécuter le CCM preparative dans du chloroforme: methanol: 28% d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium (8: 1: 0,1). </li><li> Masque la plaque à l&#39;exception des bords verticaux et d&#39;identifier la bande de produit avec une lampe UV à courte longueur d&#39;onde de 254 nm. Racler le produit à partir de la plaque avec une spatule et d&#39;isoler le produit pur en utilisant du chloroforme: methanol mélange: 28% d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium (0,1 8: 1). </li><li> Éliminer les solvants dans un évaporateur rotatif sous pression réduite. Dissoudre les pastilles résiduelles dans 1 ml de 50% d&#39; EtOH: H 2 O, distribuer dans des aliquotes de 50 ul dans des tubes de 1,5 ml (~ 20 aliquotes) et sèche dans un évaporateur centrifuge jusqu&#39;à ce que tout le solvant est évaporé (~ 3 h). </li><li>Redissoudre chaque aliquote dans 200 ul de 50% d&#39; EtOH: H 2 O et sèche à nouveau dans un évaporateur centrifuge. Dissoudre de nouveau chaque aliquote dans 200 ul de 50% d&#39; EtOH: H 2 O, sèche dans un évaporateur centrifuge et pellets conserver à -20 ° C pour le stockage à long terme. </li></ol></li><li> Pour l&#39; utilisation, on dissout le culot dans 50 ul de 50% d&#39; EtOH: H 2 O. Préparer une dilution 1: 100 du Dig-TMP dissous dans H 2 O et de mesurer la DO à 250 nm. Le coefficient d&#39;extinction de Dig-TMP est 25 000. La solution est stable pendant environ un mois si elles sont conservées à -20 ° C. Vérifier la concentration en mesurant la DO à 250 nm avant chaque utilisation. <ol><li> Calculer la concentration en stock: Abs x 100 x 10 6/25 000 = concentration (en uM). En général, la solution mère est d&#39;environ 3 mM. Il est important d&#39;être dans cette gamme afin de réduire le volume de EtOH ajouté au milieu. </li></ol></li></ol> 2. Laser Localisés Dig-TMP ICL <ol><li> Pelocalisation laser rform avec un microscope confocal avec un laser à azote SRS (337 nm) pompé à travers une cellule à colorant émettant une ligne de 365 nm et de tir 3 impulsions ns à 10 Hz, avec une puissance de 0,7 nW. </li><li> Faire une marque verticale sur le côté d&#39;une boîte de culture cellulaire à fond de verre de 35 mm avec un marqueur. Gratter une croix au centre de la vitre sur la surface de culture avec un stylo de diamant de telle sorte que la bande noire sur le côté de la cuvette se trouve en haut d&#39;un bras de la croix. La croix est marquée sur la surface de croissance du verre pour que les cellules et sera dans le même plan focal. </li><li> Stériliser la plaque après marquage avec un rinçage de 70% d&#39;EtOH. Sec avant étalement des cellules. </li><li> Cellules de la plaque (souches de laboratoire standard telles que HeLa ou U2OS) dans des boîtes de culture croix marqué un ou deux jours avant. Cellule doit être en division active et 50-70% confluentes le jour de l&#39;expérience. Incuber 24 h avec 1 uM de 5-chloro-2-désoxyuridine (CldU) à l&#39;ADN de manière uniforme sur les étiquettes. </li><li> AjouterDig-TMP dans 50% EtOH: H 2 O dans un milieu de culture cellulaire à une concentration finale de 20 uM. Porter le milieu à 37 ° C. Changer le milieu sur les cellules et les placer dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2) pendant 30 minutes pour permettre au Dig-TMP à équilibrer. </li><li> Bien que les cellules sont en incubation, déterminer les coordonnées x / y du champ de vision dans lequel le laser est actif. Suivre la procédure de calibrage, dans lequel le laser est dirigé par le logiciel pour graver une lame de verre en miroir le long d&#39;une ligne horizontale et diagonale du fabricant. Les deux lignes définissent les limites du champ dans lequel le laser peut frapper une cible. </li><li> Placer la plaque dans l&#39;enceinte climatique, à 37 ° C avec du CO2 et de l&#39; humidité contrôlée, sur la platine du microscope et de se concentrer à l&#39;objectif de l&#39; huile 60X sur l&#39;intersection de la croix. </li><li> Diriger le faisceau laser de 365 nm pour un retour sur investissement, établie par l&#39;investigateur à l&#39;outil de forme dans le logiciel, pour former une bande de 3 &amp;# 181; mx 0,6 um. Le contour de la ROI est placé par le curseur dans les noyaux des cellules situées dans le voisinage immédiat de l&#39;intersection de la croix. Ajuster le plan focal z pour cibler le milieu laser à travers le noyau. Utiliser un laser dans la plage de 350-370 nm. 405 nm lasers ne peuvent pas induire des réticulations 19. NOTE: Nous localiser le retour sur investissement dans des zones en dehors de la nucléoplasmiques nucléoles, qui peut être distingué du nucléoplasme en contraste interférentiel différentiel (DIC) imagerie. </li><li> Vérifier la mise au point et l&#39; activité du laser en augmentant le réglage de puissance à un niveau suffisant pour effacer une cellule (la cellule assombrir puis disparaître). Ceci est un diagnostic important pour un trajet de lumière sans obstacle pour le laser à travers le microscope, puis à travers la lamelle et dans les cellules. <ol><li> Baisser le réglage de puissance juste suffisante pour activer le psoralène et l&#39;ICL induite DDR (doit être déterminée de manière empirique pour chaque laser / microroscope combinaison). Utiliser un paramètre de l&#39;intensité du laser (1,7% ici), qui ne déclenche pas la DDR en l&#39;absence de psoralène (suivi par la formation de γ-H2AX). NOTE: Ceci est une détermination importante et les paramètres peuvent nécessiter un ajustement si la source laser ou un composant dans le trajet de la lumière est modifiée. Suivez l&#39;accumulation de GFP protéines marquées de réparation telles que XPC ou FAN1, qui sont tous deux recrutés rapidement (en quelques secondes) aux bandes de psoralène laser, mais pas à un retour sur investissement exposé au laser seul. Certaines protéines du DDR apparaissent en quelques secondes, alors que plusieurs minutes peuvent être nécessaires pour d&#39;autres. Il est nécessaire d&#39;effectuer des déterminations de cours de temps pour chaque protéine d&#39;intérêt. Nous notons également que dans les cellules qui ne sont pas exposés au laser, il n&#39;y a pas de bandes de protéines répondant. </li></ol></li><li> Après toutes les cellules dans un champ ont été déplacement ciblé la plaque à un nouveau champ, en restant près de l&#39;intersection de la croix. </li><li> Dans des expériences conçues pour détermine la distribution des distances inter-lésion exposer les cellules au laser à 20-25 champs (4-5 cellules / champ) autour de l&#39;intersection. Afin d&#39;analyser les modèles de réplication dans le voisinage de la CIST localisées incuber les cellules avec 10 pM de 5-iodo-2-désoxyuridine (IDU) après la cuisson au laser. NOTE: Le temps d&#39;incubation avec IdU est quelque peu arbitraire. Nous avons utilisé aussi court que 20 minutes et aussi longtemps que 60 minutes (voir ci-dessous). des impulsions plus longues (quelques heures) entraînent souvent dans plusieurs secteurs de réplication coalescents, perdant ainsi l&#39;occasion à l&#39;image des progrès des fourches simples. Dans certains bureaux expériences sont marquées avec CldU pendant 24 h à l&#39;ADN de manière uniforme d&#39;étiquette avant l&#39;exposition au Dig-TMP suivie par marquage d&#39;impulsion des voies de réplication. </li></ol> 3. Récolte de cellules et d&#39;étirement des fibres ADN <ol><li> Retirer la plaque de l&#39;étape, éliminer le milieu et laver avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Retirer la solution PBS. Déposer une goutte de 10 ul d&#39;une trypsine commerciale/ Solution d&#39;EDTA sur l&#39;intersection de la croix au milieu de la surface du verre. </li><li> Incuber pendant 3-4 min à température ambiante (RT), puis tirer la solution de trypsine avec les cellules détachées dans l&#39;embout de pipette. Il n&#39;y a pas besoin de neutraliser la trypsine. </li><li> Placer la goutte de trypsine / EDTA avec les cellules à une extrémité d&#39;une lame de microscope en verre silanisée. Lyser les cellules et libérer l&#39;ADN par addition de 10 pi de solution de SDS à 0,5% et incuber pendant 3-4 min à température ambiante en mélangeant doucement avec le bout de la pipette, permettant à la périphérie de la piscine à sécher. </li><li> Inclinaison vers le coulisseau 20 ° et laisser le liquide couler le long de la fin. Les fibres d&#39;ADN sont étendues / étirée par les forces hydrodynamiques du liquide en écoulement. Laisser sécher à l&#39;air les diapositives (~ 10 min) et le fixer à 3: 1 méthanol / acide acétique pendant 10 minutes. Retirez les diapositives de la solution de solution et de l&#39;air sec à nouveau. A ce stade, ils peuvent être stockés indéfiniment dans 70% EtOH à -20 ° C. Le retrait de 70% EtOH laisser sécher avant la neétape xt. </li><li> Laver les lames dans du PBS, et ensuite subir une dénaturation dans du HCl 2,5 M pendant 1 h à TA. Ce traitement depurinates ADN qui rend les nucléobases halogénés incorporés accessible à des anticorps. </li><li> Neutraliser diapositives 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Laver deux fois dans du PBS / 0,5% Tween-20 (PBST) pendant 5 minutes chacun. </li><li> Bloc coulissant avec 5% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) et 10% de sérum de chèvre dans du PBS. Couvrir les lames doucement avec un parafilm pour répandre la solution de blocage uniformément sur la lame et incuber pendant 1 h à TA. </li><li> Pipeter 100 ul de dilution 1: 200 dans une solution de blocage de rat anti-bromodésoxyuridine (détecte spécifiquement CldU) anticorps primaire à chaque diapositive. Couvrir les lames doucement avec un parafilm pour répandre la dilution de façon uniforme sur la lame et incuber dans une chambre humide pendant 1 h à TA. Retirez le parafilm et laver les lames trois fois en PBST pendant 5 minutes chacun. </li><li> Pipeter 100 ul de dilution (1: 100) de chèvre anti-rat Alexa Fluor 647 dans le blocage de solution à chaque diapositive. Couvrir leglisse doucement avec un parafilm et incuber pendant 45 min à température ambiante. Laver les lames trois fois en PBST pendant 5 minutes chacun. </li><li> Pipeter 100 ul de dilution (1:40) de souris anti-bromodésoxyuridine (LDU détecte et CldU Cette spécificité double nécessite le blocage de CldU par le rat anti BrdU dans l&#39;incubation préalable.) Anticorps primaire et un anticorps de lapin anti-DIG (1: 200 ) dans une solution de blocage à chaque diapositive. Couvrir les lames doucement avec un parafilm et incuber dans une chambre humide pendant 1 h à TA. Laver les lames trois fois en PBST pendant 5 minutes chacun. </li><li> Pipeter 100 ul de dilution (1: 100) de chèvre anti-souris Alexa Fluor 488 ANDC (1: 5000) de chèvre anti-lapin de sonde (par exemple, Qdot 655) dans une solution de blocage à chaque diapositive. Couvrir les diapositives doucement avec parafilm et incuber pendant 45 min à température ambiante. Laver les lames trois fois en PBST pendant 5 minutes chacun. </li><li> Drainer l&#39;excès de PBST sur une serviette en papier. Ajouter 50 ul de milieu de montage antifade sur chaque lame et couvrir avec une lamelle. Image ou magasin pourpas plus de 48 h à -20 ° C. </li></ol> 4. Imagerie fibre par microscopie à fluorescence <ol><li> Effectuer l&#39;acquisition d&#39;image à travers un objectif 63X sur un microscope inversé avec une roue de filtre entièrement motorisé fixé avec FITC, Cy5 et Q détection de point 655. Le filtre d&#39;excitation est de 425 nm, et le filtre d&#39;émission est de 655 nm avec 20 nm centrée sur le pic d&#39;émission 20. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

La technologie de localisation laser nécessite l&#39;utilisation de cellules adhérentes avec des noyaux qui sont visibles en microscopie en champ clair. Nous avons essayé de fixer les cellules non adhérentes, telles que les lymphocytes primaires, ou des cellules cultivées faiblement adhérentes telles que AD293, à la surface du verre avec des préparations adhésives des cellules tels que la polylysine ou de collagène, ou des mélanges plus complexes. Bien que ces traitements peuvent lier les cellules à la surface, nous con...

ADN est sous attaque constante des agents exogènes tels que le rayonnement, la lumière ultraviolette, les toxines environnementales, les produits de combustion, etc. De plus, il est également attaqué par des espèces radicalaires endogènes produits par le métabolisme oxydatif. Tous ces éléments ont le potentiel de perturber chimiquement ou physiquement l&#39;intégrité de l&#39; ADN 1. Perturbations dans le génome peut activer l&#39;ADN réponse Damage (DDR), un recrutement et cascade post traductionnelles avec des centaines, voire des milliers, de protéines et microARN impliqués dans la réparation des lésions, la régulation du cycle cellulaire, l&#39;apoptose, la sénescence et les voies inflammatoires 2. La plupart de nos informations sur le DDR proviennent d&#39;études avec DSB. Cela est en grande partie en raison de la disponibilité des technologies pour l&#39; introduction de pauses, y compris les pauses spécifiques de séquence, dans l&#39; ADN génomique dans les cellules vivantes 3. De plus, le propensity des pauses pour induire des foyers de protéines DDR, qui peuvent être affichés par immunofluorescence, a été très utile pour identifier la cinétique et les exigences des protéines répondant. L&#39; une des technologies clés pour l&#39; étude de la DDR a été présenté par Bonner et ses collègues, qui ont utilisé un faisceau laser pour diriger une bande de DSB dans une « région d&#39;intérêt » (ROI) dans les noyaux des cellules vivantes 4. En effet, ils ont créé un foyer long dans lequel les protéines de la DDR pourraient être identifiés par immunofluorescence. Cela a été illustré par la démonstration de la bande forte de l&#39;histone H2AX phosphorylée (γ-H2AX) dans les cellules exposées au laser. Depuis lors, l&#39;approche laser a été utilisé dans de nombreuses études de la DDR induites par DSB. Bien que puissant et populaire, et la source d&#39;images dramatiques immunofluorescence, il convient de noter que, dans la plupart des expériences l&#39;intensité du laser est ajustée de manière à produire des résultats observables, sans se soucier de l&#39;identité de la lésion,la densité, ou l&#39;espacement. En effet, il peut être difficile de faire ces estimations. Ainsi , ils sont largement ignorés, malgré la multiplicité des lésions introduites dans l&#39; ADN par des lasers 5. Cela contribue aux nombreuses contradictions dans la littérature 6. Contrairement aux DSB, la plupart des modifications chimiques de l&#39;ADN ne stimulent pas la formation de foyers discrets de protéines DDR. Ceci est important à la lumière de notre compréhension actuelle des fréquences de lésion. Il a été estimé que les cellules humaines en culture subissent moins de 50 DSB par cycle cellulaire, en grande partie formés au cours de la phase S 7, 8, 9. Moins sont formées dans des cellules non proliférantes. Cela contraste avec le nombre de pertes de nucléobases ou des événements de modification, qui sont des dizaines de milliers par cellule / jour 1, 10. Nous savons donc le plusle DDR induite par des événements qui sont relativement rares, et beaucoup moins sur celles qui sont induites par des lésions des effets de distorsion de l&#39;hélice, ce qui, au total, sont beaucoup plus fréquents. Afin de répondre à des questions sur la réponse cellulaire à covalentes modifications de l&#39;ADN génomique, nous voulions travailler avec un produit d&#39;addition d&#39;ADN de distorsion d&#39;hélice qui avait inhérente l&#39;activité d&#39;induction de DDR. De plus, pour faciliter la conception expérimentale et l&#39;interprétation que nous étions intéressés par une structure dont l&#39;introduction pourrait être contrôlée par rapport au temps et était prête à la visualisation. Par conséquent, nous avons développé une stratégie basée sur psoralène. Les psoralènes sont bien caractérisés intercalants d&#39;ADN favorisant photoactifs 5&#39; TA: AT sites. Contrairement à d&#39;autres agents de reticulation tels que les moutardes d&#39;azote et de la mitomycine C (MMC), ils ne sont pas l&#39;ADN réactif à moins exposé aux UV onde longue (UVA). Les molécules intercalées réagissent avec les bases thymine sur des brins opposés pour produire des reticulations entre brins de distorsion d&#39;hélice (CIST) 11. Avec le psoralène triméthyl utilisé dans nos expériences la plupart des produits sont ICL, relativement peu monoadducts sont générés (moins de 10%) 12 et des réticulations entre les bases intrabrin adjacentes sur un brin ne sont pas formés. Parce qu&#39;ils sont des blocs puissants à la réplication et la transcription, psoralène et d&#39;autres agents de réticulation, comme le cis-platine et MMC, sont couramment utilisés en chimiothérapie. Ainsi psoralène permis d&#39;études qui ont suivi l&#39;activation du DDR par une structure de distorsion de l&#39;hélice, et a également fourni un aperçu de la réponse cellulaire à un composé ayant une importance clinique. Nous avons synthétisé un réactif dans lequel psoralène triméthyl était lié à la digoxigénine (Dig), un stérol végétal ne se trouve pas dans les cellules de mammifères et souvent utilisé comme immunotag. L&#39;exigence de photoactivation permet la localisation par la lumière laser (365 nm) de psoralène CIST en ROI défini dans les noyaux dans des cellules vivantes. Ceux-ci peuvent être affichés par immunofluorescence contre l&#39;étiquette Dig. Réparation de l&#39; ADN et des protéines DDR est apparu dans les bandes de laser localisés ICL 13, 14. Le DDR activé par les fortes intensités de laser utilisées pour produire des DSB peut être dû à des dommages isolés ou regroupés 15, 16. Par conséquent, la pertinence des résultats de ces expériences à des lésions d&#39;origine naturelle, présente une concentration beaucoup plus basse, est incertain. Pour répondre à des questions similaires sur la fréquence des produits d&#39;addition psoralène et l&#39; espacement dans l&#39; ADN, nous avons profité de la technologie de fibre d&#39;ADN 17 et des points de immunoquantum. Les points quantiques sont beaucoup plus lumineux que les colorants fluorescents et ne sont pas blanchies par exposition à la lumière. Ainsi , ils sont fréquemment utilisés pour l&#39; imagerie de la molécule unique 18, une application pour laquelle les colorants fluorescents sont pas suffisamment brillante. fibres d&#39;ADN individuelles peuvent être étirées sur gdiapositives lass et peuvent être affichées par immunofluorescence contre analogues nucléosidiques incorporés au cours incubations avant la récolte des cellules. Nous avons traité les cellules avec Dig-psoralène et le retour sur investissement exposés à une irradiation par micro laser. Les fibres ont été préparées à partir des cellules et des produits d&#39;addition individuels Dig-psoralène peut être visualisée avec les points de immunoquantum. Exposer les cellules à des analogues nucléosidiques pendant des durées relativement courtes (20-60 min) permet l&#39;affichage des voies de réplication dans le voisinage de la CIST localisée au laser.

<table><tbody><tr><td>Digoxigénine NHS ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11333054001</td><td></td></tr><tr><td>Chloro-psoralène</td><td>Berry and Associates</td><td>PS 5000</td><td></td></tr><tr><td>diaminoglycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>369519</td><td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>423550040</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4524</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5002</td><td></td></tr><tr><td>plaques TLC</td><td>Analtech, Inc.</td><td>P02511</td><td></td></tr><tr><td>Colonne en verre Flass 24/40, 100 mL</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG-1196-02</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à disque rotatif Nikon T2000_E2, équipé d’une platine automatisée et d’une chambre de contrôle de l’environnement et d’un porte-plaque</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>avec logiciel Volocity</td></tr><tr><td>Micropoint Galvo&nbsp ;</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>avec un laser pulsé à l’azote&nbsp ;</td></tr><tr><td>pile à colorant</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-2250-2-365</td><td></td></tr><tr><td>365 colorant</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-27-365-DYE</td><td></td></tr><tr><td>IdU&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17125</td><td></td></tr><tr><td>Plaques botomm en verre de 35 mm 1,5 lamelle, diamètre du verre de 10 mm, lames</td> de microscope <td>Matek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td>non revêtues</tr><tr><td>Pièce</td><td>d’approvisionnement New Comer</td><td># 5070</td><td>New Silane</td></tr><tr><td>Slides Anticorps anti BrdU de souris (IdU)</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>1 sur 40</td></tr><tr><td>Anticorps anti BrdU pour rat (CldU)</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1 sur 200& nbsp ;</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Dig pour lapin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>710019</td><td>1 sur 200</td></tr><tr><td>Q-dot 655 chèvre anti IgG Rabbit ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>Q-11421MP</td><td>1 sur 5 000</td></tr><tr><td>AF647- chèvre anti Rat IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-605-167</td><td>1 sur 100</td></tr><tr><td>AF488-chèvre anti souris IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-545-166</td><td>1 sur 100</td></tr><tr><td>Zeiss épifluorescent microscope A200</td><td>Zeiss</td><td></td><td> ; avec logiciel Axiovision</td></tr><tr><td>Filtre Q-dot 655</td><td>Chroma</td><td>39107</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des molécule laser localisés psoralène adduits

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

L&#39;ADN réponse aux dommages (DDR) a été largement caractérisé en études de cassures double brin (CDB) induit par micro irradiation par faisceau laser dans les cellules vivantes. Le DDR à l&#39;hélice de distorsion modifications de l&#39;ADN covalentes, y compris des reticulations entre brins d&#39;ADN (ICL), ne sont pas aussi bien définie. Nous avons étudié la DDR stimulée par ICL, localisée par photoactivation laser de psoralènes immunotagged, dans les noyaux des cellules vivantes. Afin de répondre à des questions fondamentales sur la distribution de produits d&#39;addition et de rencontres de la fourche de réplication, nous avons combiné la localisation laser avec deux autres technologies. des fibres d&#39;ADN sont souvent utilisés pour afficher la progression des fourches de réplication par immunofluorescence d&#39;analogues nucléosidiques incorporés pendant de courtes impulsions. points Immunoquantum ont été largement utilisés pour l&#39;imagerie seule molécule. Dans la nouvelle approche, les fibres d&#39;ADN de cellules portant ICL localisée au laser sont étalées sur des lames de microscope. Les ICL marqués sont affichés avec des points de immunoquantum et ee distances inter-lésion déterminée. les collisions de la fourche de réplication avec ICL peuvent visualiser et différents modèles de rencontre identifiés et quantifiés.

Laser Dig-TMP (figure 1A) localisées ICL peuvent être affichées par immunofluorescence contre le Dig-étiquette liée à la psoralène. Bien que le laser peut être dirigé pour frapper dans une zone de contour quelconque, rayures ne sont pas des formes « naturels » dans les cellules, et les signaux légitimes peuvent être facilement distingués des artefacts dus à une liaison non spécifique par des anticorps primaires ou secondaires. Cette fonction est utile lors de l&#39;utili...

Les lasers sont fréquemment utilisés dans les études de la réponse cellulaire aux dommages de l&#39;ADN. Cependant, ils génèrent des lésions dont l&#39;espacement, la fréquence et les collisions avec les fourches de réplication sont rarement caractérisés. Nous décrivons ici une approche qui permet la détermination de ces paramètres avec réticule laser localisé interbrins.

Analyse des molécule laser Localisés psoralène adduits

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

L'objectif global de cette procédure est d'effectuer une analyse de molécules uniques afin d'étudier la répartition des ponts inter-brins induits par laser dans l'ADN génomique, dans le but d'analyser les réponses cellulaires aux lésions inter-brins de l'ADN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la réparation de l'ADN, notamment concernant la distribution des lésions de l'ADN induites par les technologies laser, un outil expérimental largement utilisé. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à permettre l'imagerie directe des lésions de l'ADN induites par un composé activé par laser au sein de l'ADN génomique.Cela n'avait pas été possible auparavant. La procédure sera démontrée par Julia Gichimu et Hima Gali de notre laboratoire. À chaque utilisation du laser de ciblage, il est important d'effectuer un étalonnage à l’aide d’une lame-miroir afin de vérifier que le laser frappe aux coordonnées XYZ appropriées, et de déterminer la zone du champ capturée par la caméra où le laser peut être programmé pour frapper.Recherchez un champ sur la lame qui a été préalablement gravé. Réglez le temps d'exposition et la puissance du laser. Ensuite, ajustez la mise au point pour passer à un champ voisin non ciblé sur la lame miroir.Lancez la procédure d'étalonnage. Le logiciel déclenchera le laser pour graver la lame-miroir selon une ligne horizontale et une ligne diagonale. Ces lignes définissent les limites du champ dans lequel le laser peut frapper une cellule cible.Définir plusieurs régions d’intérêt, ou ROI, à l’intérieur du champ et activer le laser pour confirmer qu’il cible bien les zones sélectionnées et frappe ainsi les coordonnées XYZ appropriées. Une calibration biologique doit également être réalisée lors de la mise en place du système laser de ciblage du microscope. La première étape consiste à déterminer la puissance minimale du laser nécessaire pour photoactiver le triméthylpsoralène, ou TMP, induire des liaisons interbrins et provoquer le recrutement d’un facteur de réparation marqué par GFP, dont la cinétique peut avoir été caractérisée auparavant.Dans ce laboratoire, une lignée cellulaire U2OS stablement transfectée avec un plasmide exprimant GFP fan one est utilisée. Comme illustré ici, lorsque les cellules sont exposées à six micromolaire de TMP et à 1,2 % de laser pendant 10 minutes, la visualisation de la séquence d'images sous forme de vidéo confirme le recrutement de GFP fan one vers la région d'intérêt ciblée. La deuxième étape consiste à vérifier que ce réglage de puissance ne déclenche pas de recrutement en l'absence du composé.Comme illustré ici, lorsqu'on expose les cellules à un laser de 1,2 % pendant 10 minutes et que l'image est visualisée sous forme de vidéo, aucune recrutement de GFP fan un vers la région cible (ROI) n'est observé. Troisièmement, il est important de définir le réglage de puissance minimal capable de détruire une cellule. La capacité de détruire une cellule à ce niveau de puissance doit être testée comme une calibration biologique de routine chaque jour d'utilisation du laser ciblé.Définir la région d’intérêt (ROI) à l’intérieur du noyau tout en évitant les nucléoles. Ajuster la mise au point. Régler la puissance du laser à 12 % et déclencher.Enfin, il est essentiel de régler le plan focal au milieu de la cellule pour obtenir un ciblage correct. Pour illustrer cela, trois cellules sont ciblées selon trois plans focaux différents. Milieu de la cellule.Trop élevé. Et trop bas. Trois minutes après le ciblage, un empilement d'images couvrant trois micromètres est généré afin d'examiner la distribution du ventilateur GFP sur une bande unique à travers le plan focal imagé.Seule la cellule ciblée au centre de la cellule montre un éventail de GFP d'une seule bande dans tous les plans Z. Avant d'effectuer la localisation par laser, préparez une boîte de culture cellulaire de 35 millimètres avec fond en verre pour la croissance des cellules. À l'aide d'un stylo marqueur, faites une marque verticale sur le côté de chaque boîte.Utilisez un stylet en diamant pour griffer une croix au centre du verre sur la surface de culture, de sorte que la bande noire sur le côté de la boîte se trouve en haut d’un des bras de la croix. La croix est marquée sur la surface de croissance du verre afin qu’elle et les cellules se trouvent dans le même plan focal. Ensemencez les cellules dans des boîtes de culture stérilisées portant la croix marquée et incubez pendant 24 heures en présence d’un micromolaire de cinq chloro désoxyuridine afin de marquer uniformément l’ADN.Le jour de l'expérience, ajouter du TMP lié à la digoxigénine ou du dig TMP dans 50 % d'éthanol au milieu de culture cellulaire pour obtenir une concentration finale de 20 micromolaire. Porter le milieu à 37 degrés Celsius. Remplacer le milieu dans les boîtes de culture par le milieu contenant du dig TMP et incuber à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 pendant 30 minutes afin de permettre l'équilibration du dig TMP.Pendant l'incubation des cellules, effectuez l'étalonnage du miroir et soufflez 12 % d'une cellule, comme démontré précédemment. Placez la plaque dans la chambre environnementale à 37 degrés Celsius avec un taux contrôlé de CO2 et d'humidité sur la platine du microscope. Focalisez avec l'objectif à immersion huile 60X sur l'intersection de la croix.Sélectionnez le premier champ cible et utilisez l'outil de forme pour définir les régions d'intérêt (ROIs) dans les cellules individuelles situées à proximité immédiate de l'intersection de la croix. Sélectionnez des zones nucléoplasmiques situées à l'extérieur des nucléoles. Ajustez le plan focal Z afin de diriger le laser au milieu des noyaux.Réglez ensuite le niveau de puissance au minimum requis pour activer la psoralène dans la réponse aux lésions de l'ADN induites par un pontage interbrin. Ici, 1,2 % est utilisé. Déclenchez le laser.Une fois que toutes les cellules d’un champ ont été ciblées, déplacez la plaque vers un nouveau champ en restant près de l’intersection de la croix. Répétez la procédure précédemment démontrée dans 12 à 18 champs afin de cibler un total de 80 à 100 cellules. Pour récolter les cellules, retirez la boîte de culture de la platine.Retirer le milieu et laver les cellules avec une solution de PBS. Éliminer le PBS et déposer une goutte de 10 microlitres d'une solution commerciale de trypsine-EDTA sur l'intersection de la croix située au centre de la surface en verre. Incuber de trois à quatre minutes à température ambiante, puis aspirer la solution de trypsine contenant les cellules détachées dans une pointe de pipette.Placez une goutte de trypsine EDTA contenant les cellules à une extrémité d'une lame de microscope en verre silanisée. Pour lyser les cellules et libérer l'ADN, ajoutez 10 microlitres de solution de SDS à 5 % et incubez pendant trois à quatre minutes à température ambiante, en mélangeant délicatement à l’aide de la pointe de pipette, en laissant le bord de la goutte sécher. Inclinez la lame de 20 degrés et laissez le liquide s’écouler vers l’extrémité.Les forces hydrodynamiques du liquide en écoulement étireront et allongeront les fibres d'ADN. Laisser sécher la lame à l'air pendant 10 minutes. Plonger la lame dans une solution de méthanol sur acide acétique en rapport de trois pour un et fixer pendant 10 minutes.Ensuite, retirez la lame de la solution de fixation et faites-la sécher à l'air une fois de plus. À ce stade, la lame peut être conservée indéfiniment dans de l'éthanol à 70 % à 20 degrés Celsius. Pour traiter la lame afin de détecter les signaux dig sur les fibres d'ADN par microscopie en fluorescence, retirez la lame portant l'ADN étiré de la solution d'éthanol à 70 % et laissez-la sécher à l'air.Ensuite, dénaturez les fibres d'ADN dans de l'acide chlorhydrique, puis transférez-les dans un récipient contenant du tris chlorhydrique à un pH de huit pour la neutralisation. Lavez ensuite les échantillons dans du PBS. Et enfin, révélez-les avec les anticorps appropriés en suivant une procédure publiée précédemment.La structure du triméthylpsoralène portant une étiquette de dioxigénine est illustrée. Les liaisons covalentes interbrins de l'ADN, ou ICL, peuvent être détectées par immunofluorescence dirigée contre le dig TMP. Cet exemple montre des cellules présentant une accumulation d'un marqueur bien connu de la réponse aux dommages de l'ADN, la γH2AX, visualisée en vert, dans les régions d'intérêt (ROIs) contenant des ICL localisés par laser et visualisés en rouge.Le noyau coloré au DAPI apparaît en bleu. Le champ clair montre une cellule partiellement située sur la marque effectuée par le stylo à pointe de diamant. Remarquez que les régions d’intérêt (ROIs) sont placées à l’extérieur des nucléoles.Pour déterminer la fréquence et l'espacement des adduits, les cellules ont été incubées dans la cinq-chlorodésoxyuridine pendant 24 heures avant l'introduction des ICL. Après la récolte des cellules et l'étirement des fibres d'ADN, les signaux dig ont été détectés à l'aide de points quantiques aminés visualisés en rouge dans la cinq-chlorodésoxyuridine par fluorescence aminée visualisée en vert. L'analyse des signaux dig sur les fibres révèle que les distances inter-ICL varient de moins de 10 kb à plus de 160 kb. Aucune preuve d'adduits groupés n'a été observée.En suivant ces recommandations, il devrait être possible d'étendre cette approche à d'autres adduits de l'ADN, tels que les lésions oxydatives qui peuvent être localisées à l'aide de lasers de longueur d'onde appropriée.

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Selective Area Modification de la Silicon mouillabilité de surface par irradiation laser pulsé UV en milieu liquide

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