Name: Petit ARN primaire dans Transfection Th17 cellules humaines par électroporation Next Generation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Découvrez l'électroporation de nouvelle génération pour transfecter efficacement des cellules T humaines primaires avec de petits ARN. Cette méthode permet d'étudier la différenciation des lymphocytes Th17 et la régulation de l'expression génique.

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Ce travail a été soutenu par les subventions des National Institutes of Health des États-Unis (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), une bourse de la Leukemia & Lymphoma Society (K.M.A.) et le programme de formation des scientifiques médicaux du National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) (Grant #T32GM007618) (M.M.).

Ce protocole est conforme aux directives de l&#39;UCSF pour l&#39;éthique de la recherche humaine. 1. Préparation de T culture cellulaire, l&#39; isolement des cellules T CD4 +, et Th17 Polarisation <ol><li> Le jour 0, le manteau 6 puits des plaques de culture de tissu avec 1,5 ml par puits d&#39;anti-CD3 humain (2 pg / ml) et du CD28 anti-humain (4 pg / mL) dans du PBS avec du calcium et du magnésium pendant au moins 2 h à 37 ° C. <ol><li> En variante, revêtir les plaques pendant une nuit à 4 ° C. Envelopper les plaques dans parafilm. </li></ol></li><li> Préparer les cellules mononucléaires de sang de cordon (CBMCs) par centrifugation à gradient de densité selon les instructions du fabricant. ATTENTION: Travailler avec soin et assurer l&#39;équipement de protection individuelle (EPI) est porté lors de la manipulation du sang humain afin d&#39;éviter tout risque d&#39;exposition à des agents pathogènes transmissibles par le sang. </li><li> Une fois que les cellules mononucléaires ont été isolées et lavées, effectuer CD4 + humaines isolement des cellules T par SELE négativection utilisant un kit commercial CD4 humain + T cellulaire. NOTE: En cas de contamination de globules rouges après l&#39; isolement des cellules mononucléaires, une lyse des globules rouges en option peut être effectuée avant les étapes d&#39;isolement des cellules T CD4 +. Remettre en suspension les cellules mononucléaires dans 1 ml de tampon d&#39;isolement (FBS à 2% dans du PBS). Ajouter 5 ml de solution 1x lyser. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Puis ajouter 5 ml de tampon d&#39;isolement et centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C pour sédimenter les cellules. <ol><li> Remettre en suspension les cellules mononucléaires à une densité de 50 x 10 6 par 500 ul dans le tampon d&#39;isolement dans un nouveau tube de 5 ml. </li><li> Ajouter 100 pl de FBS et 100 ul du mélange d&#39;anticorps par tube puis incuber chaque tube à 4 ° C pendant 20 min sur un agitateur orbital pour bien mélanger. </li><li> Après l&#39;incubation, ajouter 3-4 ml de tampon d&#39;isolement pour se laver les cellules. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 8 min à 4 ° C pour sédimenter les cellules. Aspirer soigneusement le supernatant. </li><li> Au cours de cette rotation, pré-laver les billes magnétiques. Transférer la quantité voulue de billes magnétiques dans un nouveau tube (utilisé à 1: 1 avec les cellules) et ajouter un volume égal de tampon d&#39;isolement pour laver les perles. Bien mélanger à l&#39;aide d&#39;une micropipette de 1 ml, puis placer le tube dans l&#39;aimant pendant au moins 1 min. Aspirer délicatement le surnageant. Remettre en suspension les billes magnétiques dans le même volume initialement transféré avant le lavage. </li><li> Resuspendre les cellules dans chaque tube 500 ul du tampon d&#39;isolement et ajouter 500 ul de billes magnétiques prélavés. </li><li> Incuber les cellules avec les billes magnétiques pendant 15 minutes sur un agitateur orbital à température ambiante (18 ° C à 25 ° C) pour bien mélanger. </li><li> Après l&#39;incubation, pipeter soigneusement les cellules en utilisant une micropipette de 1 ml au moins 10 fois. Puis ajouter 3-4 ml de tampon d&#39;isolement et de placer chaque tube dans l&#39;aimant pendant 2 min. </li><li> Transférer délicatement les cellules T CD4 + négativement sélectionnés qui sontle surnageant dans un nouveau tube. </li></ol></li><li> Une fois CD4 + T isolement cellulaire est terminée, compter les cellules avec un hémocytomètre et maintenir les cellules sur la glace. </li><li> Laver les plaques revêtues d&#39;anticorps deux fois avec du PBS. Puis ajouter 1,5 ml de 2 x mélange de médias Th17-polarisation dans chaque puits: IFNy anti-humain (20 ug / mL), IL-4 (20 ug / mL), le TGFß humain (10 ng / ml), anticorps anti-humain IL-1β (40 ng / mL), IL-23 (40 ng / mL), IL-6 (50 ng / mL) humain tout dilué dans un milieu de base exempt de sérum (supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 humaine U / mL de pénicilline, 100 ug / mL de streptomycine, 10 mM de HEPES, du pyruvate de sodium 1 mM et 100 pM de 2-mercaptoéthanol). REMARQUE: Transfection et l&#39;interférence ARN ne fonctionne dans un milieu contenant du sérum. Le but de l&#39;utilisation des milieux sans sérum avec ce protocole est de parvenir à une meilleure production d&#39;IL-17A. </li><li> Centrifuger les cellules T CD4 + humaines à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C pour les cellules pastille. Aspirer soigneusement le supernatfourmi. Ensuite , remettre en suspension les cellules dans des milieux de base sans sérum et plaquer les cellules à une densité de 3 x 10 6 à 1,5 ml par puits de sorte que le volume final est de 3 mL par puits et cytokines polarisantes sont maintenant à une concentration finale 1x. <ol><li> Placer les plaques dans 5% de CO2, 37 ° C incubateur pendant deux jours. </li></ol></li></ol> 2. électroporation in vitro humaine Th17 cellules polarisants <ol><li> Le jour 2, le manteau 48 puits des plaques de culture tissulaire de 250 ul par puits d&#39;anti-CD3 humain (2 pg / ml) et du CD28 anti-humain (4 pg / mL) dans du PBS avec du calcium et du magnésium pendant au moins 2 h à 37 ° C. <ol><li> En variante, revêtir les plaques pendant une nuit à 4 ° C. Envelopper les plaques dans parafilm. </li></ol></li><li> Préparer les petits ARN pour la transfection. Pour chaque transfection, une aliquote ul d&#39;une solution mère de 5 pM de siRNA dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml. Inclure petit ARN Contr adapté de la chimie appropriéeol. Gardez tous les tubes sur la glace. </li><li> Laver les plaques revêtues d&#39;anticorps deux fois avec du PBS. Ensuite, ajouter 500 ul de milieux 1X Th17 polarisant à chaque puits: IFNy anti-humain (10 ug / mL), IL-4 anti-humain (10 ug / ml), le TGFß humain (5 ng / ml), IL-humain 1β (20 ng / mL), IL-23 (20 ng / mL) humaine, l&#39;IL-6 (25 ng / mL) humain tout dilué dans un milieu de base exempt de sérum (supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / mL de streptomycine, 10 mM de HEPES, du pyruvate de sodium 1 mM et 100 pM de 2-mercaptoéthanol). </li><li> Après que les plaques de culture et les réactifs de transfection sont préparés, remettre en suspension les cellules avec 1 mL d&#39;une micropipette, mais un léger pipetage assurant que toutes les cellules sont détachées du fond des puits. Regrouper les cellules dans un tube conique et centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. NOTE: Pour les périodes de culture plus longues que le protocole de quatre jours présenté ici, les cellules doivent être transfecté environ tous les 3 jours en utilisant ce même protocole. Étape 2.4 devrait être modifié cependant, puisque ne doivent pas être mis en commun les cellules traitées avec différentes petits ARN. Toutes les conditions à l&#39;essai doivent être collectées, comptées, et transfectés séparément. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant, puis remettre les cellules dans au moins 1 ml de PBS à laver. Compter les cellules Th17 vivantes (par exemple , avec un hémocytomètre en utilisant l&#39; exclusion Trypan Bleu pour évaluer la viabilité) et ensuite transférer les cellules à un tube de microcentrifugeuse. </li><li> Centrifuger à 500 g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir un culot des cellules. </li><li> Aspirer soigneusement le surnageant, remettre en suspension et ensuite les cellules en utilisant le tampon de remise en suspension fourni par le système de transfection kit 10 ul à une densité de 2,5-4 x 10 7 cellules par ml. Gardez les cellules à la température ambiante. NOTE: À titre indicatif, essayez de préparer uniquement autant de cellules que peuvent être transfectées dans les 30 minutes. Plusieurs lots peuvent être comparés. </li><li> Ajouter 9 uL de cellules à 1 ul de petits ARN dans chaque MicroCTube entrifuge. Pipeter une fois pour mélanger les cellules et les petits ARN pour la transfection puis charger dans l&#39;embout avec l&#39;électrode de pipette. NOTE: En règle générale, ajouter 9,5 ul de suspension de cellules pour assurer qu&#39;il y a suffisamment du mélange pour éviter la formation de bulles dans la pointe de l&#39;électrode de pipette avant la transfection. </li><li> Remplir la cuvette fournie avec 3 ml de la température ambiante tampon E. Placer Electrolytic la cuvette dans la station de pipette, puis placer la pipette en position à l&#39;intérieur de la cuvette. </li><li> Immédiatement électroporation chaque mélange 10 pl de cellules et de petits ARN en utilisant les paramètres suivants: tension d&#39;impulsion 1,500-1,550 V, largeur d&#39;impulsion de 10 ms, et 3 impulsions du total sur le dispositif de transfection. </li><li> Après l&#39;électroporation est terminée, ajouter directement le mélange de cellules à 500 pi de milieu polarisant Th17 1X dans des puits préparés d&#39;une plaque de culture. Placer les plaques dans 5% de CO 2, incubateur à 37 ° C pendant deux jours. REMARQUE: Lavez la pointe d&#39;électrode de pipette par pipetagede haut en bas dans du PBS entre chaque transfection. </li></ol> 3. Récolte Th17 cellules humaines <ol><li> Resuspendre les cellules dans des milieux de culture avec une micropipette, un léger pipetage, mais faire en sorte que toutes les cellules sont détachées du fond des puits. Préparer les cellules pendant fonctionnels et / ou des essais d&#39;expression génique. NOTE: En routine, on obtient des résultats suffisamment de cellules à partir d&#39;un seul puits de cellules transfectées Th17 à utiliser pour l&#39;analyse cytométrique d&#39;écoulement du marqueur de surface et de cytokine intracellulaire et coloration facteur de transcription ou pour la préparation de l&#39;ARN pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole fournit un procédé amélioré pour la livraison de petits ARN dans des cellules Th17 humains. Bien que les cellules Th17 humains ont été utilisés ici, cette méthode de électroporation avec de petits ARN peut être utilisé avec d&#39;autres sous-ensembles T auxiliaires humain primaire, comme Th1, Th2 et Treg. Il n&#39;a pas bien fonctionné pour naïfs cellules T CD4 + de sorte que les cellules doivent être activées dans la culture avant la transfection. Pour ce protocole, nous avons optimisé le systèm...

Cellules T CD4 + sont orchestrateurs essentiels de la réponse immunitaire adaptative. Naïf cellules T CD4 + sont capables de se développer en plusieurs différentes cellules T effectrices (par exemple , Th1, Th2, Th17, etc.), chacun avec son propre ensemble de cytokines caractéristiques et des facteurs de transcription, en fonction du micro - environnement local 1. Les décisions de la lignée que les cellules T font sont essentielles tant pour l&#39;immunité protectrice et la tolérance à l&#39;auto. Les cellules Th17 sont un sous - ensemble de cellules T connues pour lutter contre les bactéries extracellulaires et les champignons, mais les réponses inappropriées sont également impliqués dans la pathogenèse de multiples maladies auto - immunes et inflammatoires telles que la sclérose en plaques et le psoriasis 2, 3. Th17 cellules humaines peuvent être générées à partir de cellules naïves T CD4 + in vitro en leur fournissant un environnement approprié de polarisation 4. Vario<html> nous combinaisons ont été utilisées des cytokines IL-1β, IL-23, TGFß, et l&#39;IL-6 pour le développement des cellules Th17 humaines. Th17 cellules humaines expriment CCR6, un récepteur de chimiokine qui est couramment utilisé pour identifier cette population de cellules et sont définies par l&#39;expression de leur facteur de transcription principale, RORγt (codée par RORC) 5, 6. les cellules Th17 ont la capacité d&#39;exprimer des cytokines multiples, mais IL-17A est la cytokine effectrice définissant lignée produite par ces cellules. Nous avons examiné l&#39;expression des trois marqueurs associés Th17 (CCR6, RORγt, IL-17A) pour évaluer la solidité de notre essai de différenciation Th17 in vitro humaine. De plus, nous avons cultivé des cellules T CD4 + humains dans des conditions non-polarisation, où aucune des cytokines ou des anticorps bloquants ont été ajoutés aux milieux de culture à utiliser comme contrôle négatif puisque l&#39; expression de ces marqueurs Th17 devrait être très faible ou absente. ve_content &quot;&gt; Une façon d&#39;étudier le développement normal des cellules T humaines et de la biologie est de manipuler l&#39;expression génique au cours de leur développement. ARN court interférent (ARNsi) sont des petites molécules d&#39;ARN synthétiques qui ciblent les ARNm codant pour des protéines et peuvent être utilisés pour réduire l&#39;expression d&#39;un gène spécifique . Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codants endogènes connus pour moduler miARN post-transcriptionnelle l&#39; expression génique. ont été montré à jouer un rôle important dans les deux murin et la biologie des cellules T humaines, y compris dans les cellules Th17 7, 8, 9. Il est essentiel de disposer de méthodes fiables de manipulation petite activité d&#39;ARN dans les cellules T humaines pour étudier leurs effets sur l&#39;expression des gènes et, finalement, sur la biologie des cellules T humaines. ici, nous décrivons un outil facile à utiliser, protocole cohérent et fiable que nous avons développé pour l&#39;introduction les petits ARN et des acides nucléiques verrouillés (LNA synthétiques, des acides nucléiques modifiés chimiquement avec une stabilité accrue)dans les cellules immunitaires, et plus spécifiquement dans les cellules Th17 humaines. Il existe plusieurs méthodes alternatives de l&#39; introduction de petits ARN dans les cellules de mammifères, qui se situent généralement dans des catégories chimiques, biologiques ou physiques 10. Couramment utilisés méthodes chimiques, y compris transfections à base de lipides et transfections calcium-phosphate, reposent sur la création de complexes ADN chimique qui sont plus efficacement absorbé par les cellules. En général, les méthodes chimiques ne sont pas aussi efficaces pour la transfection de cellules T primaires. Le procédé biologique la plus courante consiste à utiliser un vecteur viral (par exemple, retrovirus ou lentivirus), qui insère directement l&#39; ARN étranger dans un hôte en tant que partie de son cycle de replication naturel. transduction virale prend généralement plus de temps, en particulier lorsque l&#39;on tient compte du temps pour le clonage moléculaire des plasmides proviraux. En outre, des vecteurs de transduction viraux peuvent être potentiellement dangereux pour les chercheurs humains. L&#39;électroporation est une physique méthode d&#39;induire la perméabilisation de la membrane en soumettant les cellules à des impulsions à haute tension, ce qui permet d&#39;entrer des acides nucléiques de manière transitoire dans la cellule où ils peuvent agir sur leur cible. Les instruments traditionnels de électroporation ne sont pas efficaces pour transfecter les lymphocytes primaires. Cependant, l&#39;électroporation de la prochaine génération optimisée est avérée être capable de transfecter des cellules T à un rendement très élevé, en particulier lorsque le matériau à transfecter est un petit ARN. Le terme de nouvelle génération est vaguement utilisé pour différencier les deux nouvelles plates - formes (par exemple, Neon, Amaxa) de machines d&#39;électroporation traditionnelles. En outre, cette méthode est facilement extensible pour des écrans de débit modéré avec jusqu&#39;à environ 120 petits ARN en une seule expérience, souvent en utilisant des réactifs de synthèse validés. Il est important, transfections succès peut être atteint en moins de 16 h après l&#39;activation des lymphocytes T. L&#39;inconvénient de cette méthode, cependant, est qu&#39;il ne donne pas lieu à incorporati génomique stablesur, et est donc transitoire. Par conséquent, il vaut l&#39;effort supplémentaire pour créer une construction d&#39;expression stable qui peut être emballé dans un vecteur viral et exprimé avec succès dans les cellules T dans les cas où l&#39;expression à long terme d&#39;un petit ARN est nécessaire. Nous avons utilisé une transfection de prochaine génération (par exemple, le néon) pour délivrer ARN simple brin ou double brin synthétiques ou divers outils oligonucléotides LNA à des fins différentes 11, 12, 13. L&#39;interférence ARN efficace peut être induite chez la souris et les cellules T primaires humains en utilisant l&#39;ARN court interférant double brin (siRNA). Ce protocole décrit les conditions optimales pour l&#39;utilisation de cette technique dans les cellules Th17 humaines. En plus de siARN, imitateurs miARN synthétiques et les inhibiteurs disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour étudier le gain miARN et la perte de la fonction. imite miARN sont des molécules d&#39;ARN double brin très semblables à ARNsi, mais designed avec la séquence de miARN matures endogènes. les inhibiteurs de miARN sont d&#39;ARN modifiés chimiquement et / ou LNA à base d&#39;oligonucléotides simple brin qui se lient aux miRNAs natifs et antagonisent leur fonction. Nous avons constaté que tous ces outils peuvent être utilisés efficacement dans les lymphocytes T primaires en culture, y compris, mais sans s&#39;y limiter, les cellules Th17 humaines.

<table><tbody><tr><td>IL-17A PE</td><td>ebioscience</td><td>12-7179-42&nbsp ;</td><td>Clone : eBio64DEC17</td></tr><tr><td>anti-humain IFNg FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-7319-82</td><td>Clone : 4S. B3</td></tr><tr><td>anti-humain CD4 eVolve605</td><td>ebioscience</td><td>83-0047-42</td><td>Clone : souris SK3</td></tr><tr><td>anti-humain CD196 (CCR6) BV421</td><td>BD biosciences</td><td>562515</td><td>Clone : 11A9</td></tr><tr><td>anti-humain RORgt AF647</td><td>BD biosciences</td><td>563620</td><td>Clone : Q21-559</td></tr><tr><td>anti-humain CD45 eFluor450 ebioscience</td><td></td><td>48-9459-42</td><td>Clone : 2D1</td></tr><tr><td>Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer</td><td>Set ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Pour la coloration par cytométrie en flux du facteur de transcription intracellulaire</td></tr><tr><td>Hu FcR Inhibiteur de liaison Ebioscience purifié</td><td></td><td>14-9161-71</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>10981</td><td>"Serum-Free Base Media"</td></tr><tr><td>MACS CD28 pure functional grade, humain</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-375</td><td>Clone: 15E8</td></tr><tr><td>Noyau d’anticorps monoclonal</td><td>UCSF purifié CD3 Clone</td><td>N/A</td><td>: OKT-3</td></tr><tr><td>LEAF IL-4 IL-4 biolegend purifié</td> Clone <td></td><td>500815 :</td><td>MP4-25D2</td></tr><tr><td>IFNg anti-humain,</td><td>ebioscience</td> purifié de qualité fonctionnelle <td>16-7318-85</td><td>Clone : NIB42</td></tr><tr><td>IL-23 humain recombinant</td><td>Peprotech&nbsp ;</td><td>200-23</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 humaine recombinante ;</td><td>Peprotech&nbsp ;</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&bêta humain recombinant ; 1</td><td>Peprotech&nbsp ;</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 humaine recombinante</td><td>Peprotech&nbsp ;</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Control Pool, non-ciblage #2</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-05</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Humain RORC</td><td>Dharmacon</td><td>M-003442-00</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Humain PTPRC</td><td>Dharmacon</td><td>M-008067-01</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11346D</td><td>Human CD4+ Lymphocytes T Kit d’isolation</td></tr><tr><td>Neon Tranfection System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>Instrument d’électroporation de nouvelle génération</td></tr><tr><td>Neon Tranfection System 10 &mu ; L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de suspension T</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Fourni dans le kit (MPK1096)</td><td>"Tampon de résuspension de transfection"</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07801</td><td>Gradient de densité</td></tr><tr><td>Moyen costar Plaques traitées pour la culture tissulaire à 6 puits</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>Plaques</td></tr> <tr><td>à fond platPlaques traitées pour la culture tissulaire costar 48 puits</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>Plaques à fond plat</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse tampon de lyse, 10x</td><td>BD biosciences</td><td>555899</td><td>Doit préparer 1x solution avec de l’eau distillée avant utilisation</td></tr></tbody></table>

petit arn primaire dans transfection th17 cellules humaines par électroporation next generation

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Les lymphocytes T CD4+ peuvent se différencier en plusieurs sous-ensembles de lymphocytes T auxiliaires effecteurs en fonction du milieu cytokinique environnant. Les lymphocytes Th17 peuvent être générés à partir de lymphocytes T CD4+ naïfs in vitro en les activant en présence des cytokines polarisantes IL-1β, IL-6, IL-23 et TGFβ. Les cellules Th17 orchestrent l’immunité contre les bactéries et les champignons extracellulaires, mais leur activité aberrante a également été associée à plusieurs maladies auto-immunes et inflammatoires. Les cellules Th17 sont identifiées par le récepteur des chimiokines CCR6 et définies par leur facteur de transcription maître, RORγt, et leur cytokine effectrice caractéristique, IL-17A. Les conditions de culture optimisées pour la différenciation des cellules Th17 facilitent les études mécanistes de la biologie des cellules T humaines dans un environnement contrôlé. Ils fournissent également un cadre pour étudier l’importance de gènes spécifiques et de programmes d’expression génique par l’interférence ARN ou l’introduction de micro-ARN (miARN) imitant ou inhibiteurs. Ce protocole fournit une méthode facile à utiliser, reproductible et très efficace pour la transfection transitoire de cellules Th17 humaines primaires différenciées avec de petits ARN à l’aide d’un dispositif d’électroporation de nouvelle génération.

La première étape pour l&#39; élaboration d&#39; un système fiable de électroporation avec succès les cellules Th17 humaines était de générer in vitro robuste différenciées des cultures de cellules Th17 humaines. Les cellules T cultivées dans des conditions de polarisation de Th17 ont exprimé le récepteur de chimiokine CCR6 et le facteur de transcription RORγt (figure 1A, gauche). Ces marqueurs ne sont pas exprimés lorsque les lymphocytes T ont été cultivées dan...

L’électroporation de nouvelle génération est une méthode efficace pour transfecter des cellules Th17 humaines avec de petits ARN afin de modifier l’expression des gènes et le comportement cellulaire.

Petit ARN primaire dans Transfection Th17 cellules humaines par électroporation Next Generation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Le but général de cette procédure est de transfecter efficacement des lymphocytes T humains primaires avec des réactifs d'ARN petits à l'aide d'une électroporation de nouvelle génération. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie des lymphocytes T, telles que la manière dont des produits géniques spécifiques régulent la différenciation des lymphocytes T et la fonction immunitaire. Le principal avantage de cette technique réside dans sa grande efficacité et sa fiabilité pour transfecter des lymphocytes T humains primaires avec des ARNp et d'autres réactifs synthétiques d'ARN petits.Cette méthode peut fournir des informations sur la biologie des cellules Th17 humaines, mais elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme d'autres lymphocytes provenant d'humains ou de souris. Au jour zéro, recouvrez des plaques de culture tissulaire à six puits avec 1,5 millilitre par puits d'anticorps anti-CD3 humain et anti-CD28 humain dans du PBS contenant du calcium et du magnésium pendant au moins deux heures à 37 degrés Celsius. Une fois les cellules mononucléées du sang de cordon, ou CBMC, isolées et lavées, procédez à l'isolement des lymphocytes T CD4 positifs par sélection négative à l'aide d'un kit commercial de cellules T CD4 positives humaines.Ajouter du tampon d'isolement et resuspendre les cellules mononucléées. Transférer les cellules dans un nouveau tube de cinq millilitres, puis ajouter 100 microlitres de sérum bovin fœtal, ou FBS, et 100 microlitres du mélange d'anticorps par tube, puis incuber chaque tube à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes sur un agitateur orbital afin de bien mélanger. Après l'incubation, ajouter trois à quatre millilitres de tampon d'isolement pour laver les cellules.Centrifuger les cellules à 300 fois g pendant huit minutes à quatre degrés Celsius afin de former un culot cellulaire. Aspirer soigneusement le surnageant. Transférer les billes magnétiques dans un nouveau tube et ajouter un volume égal de tampon d'isolement pour laver les billes.Utilisez une micropipette de un millilitre pour bien mélanger les billes, puis placez le tube dans l'aimant pendant au moins une minute. Aspirez soigneusement le surnageant et remettez en suspension les billes magnétiques dans le même volume transféré initialement avant le lavage. Ajoutez 500 microlitres de tampon d'isolement dans chaque tube et remettez les cellules en suspension, puis ajoutez 500 microlitres de billes magnétiques pré-lavées.Incuber les cellules avec les billes magnétiques pendant 15 minutes sur un agitateur orbital à température ambiante afin de bien mélanger. Après l'incubation, à l’aide d’une micropipette de un millilitre, pipeter soigneusement les cellules au moins 10 fois, puis ajouter trois à quatre millilitres de tampon d’isolement et placer chaque tube dans l’aimant pendant deux minutes. Transférer délicatement les lymphocytes T CD4 positifs sélectionnés négativement présents dans le surnageant vers un nouveau tube.Une fois l'isolement des lymphocytes T CD4 positifs terminé, maintenir les cellules sur glace et les compter à l'aide d'un hémocytomètre. Laver les plaques revêtues d'anticorps deux fois avec du PBS, puis ajouter 1,5 millilitre de milieu polarisant Th17 à 2 X dans chaque puits. Ensuite, centrifuger les lymphocytes T CD4 positifs humains pour former un culot cellulaire.Aspirez soigneusement le surnageant et jetez-le, puis resuspendez les cellules dans un milieu de base sans sérum et semez les cellules de manière à obtenir un volume final de trois millilitres par puits, avec une concentration finale de cytokines polarisantes à 1 X. Incubez ensuite les plaques dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant deux jours. Au jour deux, recouvrez des plaques de culture tissulaire à 48 puits avec 250 microlitres par puits d'anticorps anti-CD3 humain et d'anticorps anti-CD28 humain dans du PBS contenant du calcium et du magnésium, pendant au moins deux heures à 37 degrés Celsius. Pour préparer les petites ARN destinées à la transfection, prélevez un microlitre d'une solution mère à cinq micromolaire d'ARNsi dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre pour chaque transfection.Gardez tous les tubes sur de la glace. Ensuite, lavez les plaques recouvertes d'anticorps deux fois avec du PBS, puis ajoutez 500 microlitres de milieu polarisant Th17 à une fois la concentration dans chaque puits. Une fois les plaques de culture et les réactifs de transfection préparés, resuspendez les cellules à l’aide d’une micropipette de un millilitre, en pipetant délicatement mais en veillant à ce que toutes les cellules se détachent bien du fond des puits.Rassembler les cellules dans un tube conique et centrifuger les tubes à 500 × g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Aspirer soigneusement le surnageant, puis resuspendre les cellules dans au moins un millilitre de PBS pour un lavage. Compter les cellules Th17 viables à l’aide d’un hématimètre, en utilisant l’exclusion au bleu de trypan pour évaluer la viabilité, puis former un culot des cellules dans un tube de microcentrifugeuse.Aspirez soigneusement le surnageant et resuspendez les cellules à l’aide du tampon de resuspension fourni dans le kit. Conservez les cellules à température ambiante. Ajoutez neuf microlitres de cellules à un microlitre d’ARN petit dans chaque tube de microcentrifugation.Effectuez un pipetage unique pour mélanger les cellules et les ARN petits pour la transfection, puis chargez les cellules dans la pointe d'électrode de pipette fournie. Pour assurer une transfection optimale, évitez d'introduire des bulles d'air dans la pointe d'électrode de pipette avant la transfection. Nous ajoutons 9,5 microlitres de suspension cellulaire afin de disposer d'une quantité suffisante de mélange pour éviter la formation de bulles dans la pipette d'électroporation.Remplir la cuvette fournie avec trois millilitres de tampon électrolytique à température ambiante. Placer la cuvette dans la station de pipette neon, puis positionner la pipette à l'intérieur de la cuvette. Électroporer immédiatement chaque mélange de 10 microlitres de cellules et d'ARN petit. Une fois l'électroporation terminée, ajoutez directement le mélange cellulaire à 500 microlitres de milieu de polarisation Th17 1X dans les puits préparés d'une plaque de culture. Enfin, placez les plaques dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius pendant deux jours supplémentaires. Travaillez soigneusement mais rapidement pour éviter la mort cellulaire.S'il y a de nombreux échantillons à électroporer, les cellules peuvent être collectées et transfectées par lots. Ce graphique en courbes de niveau montre que les lymphocytes T cultivés dans des conditions de polarisation Th17 exprimaient le récepteur chimiotactique CCR6 et le facteur de transcription ROR gamma T, qui n'étaient pas exprimés lorsque les lymphocytes T étaient cultivés dans des conditions non polarisantes. Les lymphocytes T cultivés dans des conditions de polarisation Th17 produisaient également de l'IL-17A après une re-stimulation, mais pas dans des conditions ThN.La différenciation des Th17 se produit encore après la transfection avec de petits ARN, mais dans certains expériences, on observe une réduction de la fréquence de production d'IL-17A. Cela démontre l'importance d'utiliser un contrôle de petit ARN à chimie appariée pour la comparaison dans chaque expérience. La viabilité est préservée après la transfection avec de petits ARN et est généralement supérieure à 70 %. La transfection de cellules Th17 humaines au deuxième jour avec un pool de siRNA ciblant le gène PTPRC, qui code pour CD45, a fortement réduit l'expression de CD45 par rapport à un siRNA contrôle à chimie appariée.Le décalage unimodal de la population dans l'expression de CD45, observé ici, indique une efficacité de transfection proche de 100 %. La réduction de l'expression de ROR gamma T par ARNi a eu un effet fonctionnel, car ces cellules ont présenté une production diminuée d'IL-17A par rapport aux cellules transfectées avec un ARsi contrôle. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment transfecter des cellules Th17 humaines polarisées in vitro avec de petits ARN en utilisant l'électroporation de nouvelle génération.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette procédure décrit comment établir des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse de souris et est suivie par transfection en utilisant le système d'électroporation Gene Pulser MXCell.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

Nous présentons notre protocole optimisé nucléofection à haut débit comme un moyen efficace de transfection humaines primaires dérivées de monocytes des cellules dendritiques avec soit l'ADN plasmidique ou siRNA sans causer la maturation des cellules. En outre, nous fournir des preuves pour faire taire les siARN réussie de gène ciblé RIG-I à la fois au niveau ARNm et des protéines.

Protocole optimisé pour une transfection efficace des cellules dendritiques, sans maturation cellulaire

Ce protocole présente une méthode efficace et fiable pour la transfection humains THP-1 macrophages avec siRNA ou de l'ADN plasmidique par électroporation à haut rendement de transfection tout en maintenant la vitalité des cellules haute capacité et des macrophages plein de différenciation et polarisation.

La transfection très efficace des droits de THP-1 par les macrophages nucléofection

Utilisant un Cas9 préassemblé complexe ribonucléoprotéique (RNP) est une méthode puissante pour l’édition de génome précis et efficace. Ici, nous mettons en évidence son utilité dans un large éventail de cellules et des organismes, y compris des cellules humaines primaires et les deux classiques et de nouveaux organismes modèles.

Génome améliorée d’édition avec Cas9 ribonucléoprotéique dans diverses cellules et des organismes

Nous avons développé un protocole pour transfecter les cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires par électroporation avec le gène codant pour le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) à l’aide du système de transposon de la Belle au bois dormant (SB). La réussite de la transfection a été démontrée par la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR), l’immunoblot et le dosage immuno-enzymatique (ELISA).

Modification génétique basée sur l’électroporation de cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires à l’aide du système de transposon de la Belle au bois dormant

Nous présentons une méthode de culture et d’édition de gènes de cellules B de macaque rhésus primaire utilisant CRISPR / Cas9 et le virus adéno-associé recombinant sérotype 6 pour l’étude des thérapies cellulaires B.

Édition génique de cellules primaires de macaque rhésus B

Nous présentons un protocole pour la transduction rétrovirale de l’ARN guide dans les lymphocytes T primaires de souris transgéniques Cas9, offrant une alternative efficace pour l’édition de gènes dans l’étude de la différenciation Th17.

Ciblage génique rétroviral médié par CRISPR/Cas9 pour l’étude de la différenciation Th17 in vitro

Ce protocole fournit un flux de travail rationalisé pour générer et tester des cellules T régulatrices du récepteur antigénique chimérique humain (CAR Tregs).

Génération de lymphocytes T régulateurs du récepteur de l’antigène chimérique humain

Un protocole détaillé est fourni pour l’utilisation de la technologie CRISPR/Cas9 afin d’obtenir un knock-in ciblé très efficace de grandes constructions multicistroniques dans les cellules T humaines primaires via la voie de réparation de l’ADN HMEJ (Homology-Mediated End Joindre). Les lymphocytes T conçus avec ce protocole adaptable à la GMPc maintiennent une excellente expansion cellulaire, une cytotoxicité et une production de cytokines.

Ingénierie non virale de lymphocytes T humains primaires via l’intégration ciblée de grandes matrices d’ADN

La délivrance des éditeurs génomiques sous forme d’ARN est un moyen particulièrement puissant de modifier les génomes des cellules et lignées cellulaires primaires de mammifères. L’objectif de ce protocole est de délivrer des éditeurs de génome sous forme d’ARNm dans les cellules et lignées cellulaires primaires de mammifères, suivis d’un séquençage ciblé Illumina et d’une analyse afin de quantifier les résultats d’édition.

Édition génomique dans les cellules primaires de mammifères via électroporation de l’ARN éditeur

Découvrez l'électroporation de nouvelle génération pour transfecter efficacement des cellules T humaines primaires avec de petits ARN. Cette méthode permet d'étudier la différenciation des lymphocytes Th17 et la régulation de l'expression génique.

Petit ARN primaire dans Transfection Th17 cellules humaines par électroporation Next Generation

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