Name: Un In Vitro Ensemble de liaison de caséine qui prédit la pénétration des drogues dans les lésions tuberculeuses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Découvrez la méthode de dialyse à équilibre rapide pour prédire la liaison des médicaments au caséum des lésions tuberculeuses. Cette technique évalue la pénétration antimicrobienne sans modèles animaux coûteux.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous souhaitons remercier Johnson &amp; Johnson, la TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X et Trius Therapeutics pour fournir bedaquiline, PA-824 (prétomanide), AZD5847, radezolid et tedizolid, respectivement. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li et Danielle Weiner ont soutenu l&#39;analyse MALDI, les méthodes bioanalytiques, la préparation du substitut de la casum, la synthèse chimique et l&#39;isolement de la casée de lapin. Ce travail a été mené avec le financement de la Fondation Bill et Melinda Gates, le prix # OPP1044966 et OPP1024050 à V. Dartois, Subvention d&#39;instrumentation partagée NIH S10OD018072, ainsi que le financement conjoint de la Fondation Bill et Melinda Gates et Wellcome Trust pour un Centre d&#39;excellence Pour l&#39;optimisation du plomb pour les maladies du monde en développement à P. Wyatt.

Toutes les études sur les animaux ont été effectuées conformément au Guide pour la prise en charge et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire des Instituts nationaux de santé avec l&#39;approbation du Comité de soins et de soins pour animaux institutionnels du NIAID (NIH), Bethesda, MD. Toutes les études impliquant M. tuberculosis ont été effectuées dans un laboratoire avec un niveau de confinement de biosécurité 3 (BSL-3). 1. Modèle d&#39;infection de lapin et collection Caseum <ol><li> Infecte les lapins blancs de Nouvelle-Zélande avec M. tuberculosis en utilisant un système d&#39;exposition aux aérosols sans nez comme décrit précédemment. 12 , 13 Permettre à l&#39;infection de progresser pendant 12 à 16 semaines. Saisissez les lapins avec 35 mg / kg de kétamine et 5 mg / kg de xylazine par voie intramusculaire, euthanasiez les lapins avec 0,22 ml / kg de pentobarbital de sodium et de phénytoïne sodique par voie intraveineuse et poursuivez les nécropsies. </li><li> À l&#39;aide de pincettes et d&#39;un scalpel, retirez les poumons du coffre caVité. De chaque lobe pulmonaire, disséquer les cavités individuelles et les grands granulomes nécrotiques à l&#39;aide d&#39;un scalpel. Rassurer soigneusement le caséum des parois de la cavité et du granulome. Peser, enregistrer et stocker les échantillons dans des tubes à vis de 2 mL à -20 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient prêts à l&#39;emploi. </li><li> Rayons gamma des échantillons infectieux de caséum à 3 MegaRad sur de la glace carbonique pour les rendre inutilisables et sans danger pour l&#39;utilisation dans un laboratoire BSL-2. </li></ol> 2. Génération in vitro de la substitution de casée à partir de cellules THP-1 <ol><li> Cultiver des monocytes THP-1 dans du milieu RPMI 1640 (L-glutamine 2 mM et 10% de sérum bovin fœtal) dans des flacons de culture cellulaire T175 (80 ml / flacon). Incuber les flacons dans une atmosphère de CO2 à 5% à 37 ° C pendant 3 à 4 jours. </li><li> Centrifuger la culture d&#39;un flacon T175 dans deux tubes coniques de 50 ml à 150 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant et suspendre la pastille dans 10 mL de média RPMI 1640. </li><li> Pipetter 5 μL de cette culture dans un tube de 1,5 mL contenant 45 μL de tRypan bleu. Bien mélanger en pipettant. Transférer 10 μL à un hémocytomètre et compter le nombre de monocytes THP-1 viables (non colorés) à l&#39;aide d&#39;un microscope optique (grossissement 10X). Calculer le nombre de cellules viables par ml de la culture. Diluez-le avec du milieu RPMI jusqu&#39;à la densité finale de 1,25 x 10 6 cellules / mL. </li><li> Chargez 40 mL de la culture sur une grande plaque de culture cellulaire (50 x 10 6 cellules / plaque). Ajouter 40 μL de PMA 100 μM (acétate de 12-myristate-13 de phorbol préparé dans l&#39;éthanol) et permettre aux cellules d&#39;adhérer pendant la nuit dans l&#39;incubateur. NOTE: La concentration finale de PMA est de 100 nM. </li><li> Diluer l&#39;acide oléique pur (OA) (0,89 g / mL) dans de l&#39;éthanol à la concentration de 0,1 M ( c&#39;est-à-dire 31,7 μL d&#39;OA dans 968,3 μl d&#39;éthanol). Diluer cette solution dans des milieux RMPI préchauffés frais à une concentration de 10 mM. Diluer cette suspension OA à 0,4 mM (concentration finale de travail) en milieu RPMI préchauffé à 37 ° C. </li><li> Supprimez les médias existants et non-adhered cellules provenant des plaques de culture de cellules et ajouter doucement 40 ml de 0,4 mM OA pour les macrophages THP-1 (THP-M). Incuber à 37 ° C dans l&#39;incubateur pendant une nuit. </li><li> Utilisez un microscope optique à un grossissement de 40x pour confirmer visuellement la présence de nombreuses inclusions de corps lipidiques dans chaque THP-M. Retirer tout le milieu RPMI à partir des plaques de culture de cellules et laver délicatement les cellules adhérentes deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant une pipette sérologique de 50 ml. REMARQUE: les corps Lipid apparaissent sous la forme de petites structures claires, sphériques dans le cytoplasme de la THP-M. </li><li> Ajouter 40 ml de 5 mM d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans du PBS à chaque plaque. Incuber pendant 15 min à 37 ° C. </li><li> Détacher les macrophages spumeux (FM) en pipetant à plusieurs reprises de haut en bas sur la surface de toute la plaque en utilisant une pipette sérologique de 10 ml. Transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 50 ml et centrifuger à 150 g pendant 5 min. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de PBS (troisième lavage PBS) unEt transfert à un tube conique pré-pesé de 15 ml. Retournez à 150 xg pendant 5 min. Aspirer soigneusement le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette sérologique et jeter. </li><li> Suivez les pastilles de FM à 3 cycles de congélation-décongélation pour lyser les cellules et les incuber à 75 ° C pendant 20-30 minutes pour dénaturer les protéines dans la matrice. Conservez les granulés à -20 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient prêts à l&#39;emploi. </li></ol> 3. Essai de dialyse à équilibrage rapide (ROUGE) <ol><li> Préparer des solutions stock 10 mM de tous les composés d&#39;essai dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Diluer à 500 μM de solutions de travail dans le DMSO avant chaque dosage. </li><li> Pesez le tube contenant la pastille de substitution Caseum. Soustraire le poids du tube vide pour obtenir le poids de la pastille seule. Ajouter 2-3 grains de métal par tube et, en utilisant un homogénéisateur de tissu à 1200 coups / min pendant 1 min, perturber le caséum ou la matrice de substitution dans le PBS (1: 9 w / v) pour obtenir une suspension 10x diluée de chaque matrice. </li><li> Spike 6,5 μL des 500uM solution du composé d&#39;essai dans 643,5 ul de l&#39;homogénat pour obtenir la concentration finale de 5 uM (≤1% de DMSO) et vortex. </li><li> Placez les inserts rouges dans la plaque de base. Ajouter 200 ul de la matrice de médicament-dopés dans la chambre de donneur (anneau rouge) de chaque insert RED et 350 ul de PBS dans chaque chambre de récepteur. Préparer 3 inserts pour chaque composé d&#39;essai (échantillons en triple). plaque d&#39;étanchéité avec un joint d&#39;étanchéité de plaque adhésif et incuber à 37 ° C sur le Thermomixer à 200 tours par minute (1 xg) pendant 4 h. </li><li> Après l&#39;incubation, mélanger doucement le contenu des chambres de donneur et receveur par pipetage vers le haut et vers le bas 2-3 fois. Pipeter 20 uL à des aliquotes d&#39;homogénat à partir des chambres de donneur et ajouter à 20 pl de PBS pur dans un tube de 1,5 ml (1: 1). De même, à partir des chambres de réception et ajouter à 20 pl d&#39;homogénat propre (adaptation de la matrice) sur la pipette des aliquotes de 20 pi d&#39;échantillons de PBS. 8 REMARQUE: la matrice de correspondance élimine le neced 2 courbes d&#39;étalonnage séparées (dans l&#39;homogénat et PBS) à effectuer une analyse quantitative. Contenu de la chambre de donneur peuvent sédimenter au cours du temps. Mélanger délicatement le contenu par pipetage avant de retirer aliquotes. </li></ol> 4. LC-MS Quantification et analyse des données <ol><li> Ajouter 160 ul de 1: 1 methanol: acétonitrile contenant 500 ng / mL de diclofénac ou 10 ng / mL verapamil (étalon interne) à chaque tube et vortexer pour précipiter les protéines. Centrifuger à 10 000 xg pendant 5 minutes pour sédimenter le précipité et on surnageants transfert en plaques de 96 puits à puits profonds pour l&#39;analyse de Chromatographie spectrométrie de masse liquide (LCMS). 7 </li><li> Construire des courbes d&#39;étalonnage à partir de 1-1,000 nM pour chaque composé d&#39;essai tout en maintenant la même composition de matrice que les échantillons ci-dessus. Quantifier la concentration du composé d&#39;essai dans les échantillons provenant des chambres de donneur et receveur au moyen d&#39;un procédé LC-MS. </li><li> Calculer la fraction non liée (f u) oF le médicament dans la matrice diluée en utilisant l&#39;équation 1. Calculer le f u dans la matrice non diluée en utilisant l&#39;équation 2 ( D = facteur de dilution de 10). 14 <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="L&#39;équation 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li> Vérifier la récupération (masse) de chaque composé en utilisant l&#39;équation 3 pour identifier les composés avec des problèmes de stabilité / métabolisme / liaison non spécifique. NOTE: Le recouvrement tombe généralement entre 70% et 130%. 15 <img alt="L&#39;équation 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+versus+bugs%3A+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+dormant+tubercle+bacilli+and+latent+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis.</a> Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).</li>
<li>Aber, V. R., Nunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+chemotherapy+of+tuberculosis.+Factors+affecting+relapse+following+short+term+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Int+Union+Tuberc%22%5BJournal%5D)">Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy.</a> Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).</li>
<li>Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nested+case-control+study+on+treatment-related+risk+factors+for+early+relapse+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).</li>
<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+of+anti-tuberculosis+drugs%3A+from+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li>
<li>Sarathy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+Drug+Penetration+in+Tuberculosis+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions.</a> ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).</li>
<li>Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+rapid+equilibrium+dialysis+approach+for+the+measurement+of+plasma+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding.</a> J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).</li>
<li>Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. <a target="_blank" href="http://jpharmsci.org/article/S0022-3549(16)32735-6/pdf">Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma.</a> J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbound+drug+concentration+in+brain+homogenate+and+cerebral+spinal+fluid+at+steady+state+as+a+surrogate+for+unbound+concentration+in+brain+interstitial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid.</a> Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).</li>
<li>Able, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+localization%2C+native+tissue+binding+and+ex+vivo+occupancy+for+centrally+penetrant+P2X7+antagonists+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat.</a> Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).</li>
<li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits%3A+a+failed+host+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).</li>
<li>Via, L. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2423064/">Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates.</a> Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).</li>
<li>Kalvass, J. C., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+nonspecific+brain+and+plasma+binding+on+CNS+exposure%3A+implications+for+rational+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biopharm+Drug+Dispos%22%5BJournal%5D)">Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery.</a> Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).</li>
<li>Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+recovery+on+fraction+unbound+using+equilibrium+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis.</a> J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).</li>
<li>Lenaerts, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+persisting+mycobacteria+in+a+Guinea+pig+model+of+tuberculosis+revealed+by+r207910%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li>
</ol>

Il n&#39;y a pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

Les lésions et les cavités nécrotiques pulmonaires chez les patients infectés par la tuberculose contiennent des sous-populations de bactéries qui sont récalcitrantes au traitement médicamenteux. Les carottes caséoises de ces structures sont particulièrement responsables d&#39;abriter ces persisters dans un environnement extracellulaire. 16 La répartition favorable des agents anti-bactériens dans ces endroits éloignés est considérée comme un déterminant important de l&#39;efficacité du médicament...

Le traitement de la maladie de la tuberculose pulmonaire exige une distribution efficace des médicaments dans différents types de lésions. des lésions nécrotiques et les cavités contiennent des centres caséeux qui abritent des sous-populations de bactéries tolérantes à la drogue ou « persistant ». 1, 2 La maladie cavitaire est associée à des taux de guérison inférieurs et un mauvais pronostic. 3, 4 études antérieures ont montré, en utilisant des techniques quantitatives et d&#39; imagerie, que la capacité de pénétrer caseum varie considérablement d&#39;une classe de médicaments à l&#39; autre. 5, 6 Ces méthodes nécessitent cependant l&#39;utilisation de modèles d&#39;infection des animaux qui sont lents et fastidieux. Un dosage in vitro qui mesure la liaison au médicament ex vivo caseum a été conçu. Cette liaison a été trouvé en corrélation inverse avec la pénétration des médicaments dans les granulomes caséeux et, par conséquent, estutilisé comme un outil de prédiction. 7 dialyse d&#39;équilibre est considéré comme l&#39;approche standard de l&#39;or à des études de liaison aux protéines plasmatiques. Le dispositif de dialyse d&#39;équilibre rapide (RED) offre un moyen rapide, facile à utiliser et système fiable pour effectuer ces tests. 8 Le dispositif est constitué de deux composants: à usage unique, jetable , comprenant des inserts 2 chambres séparées par un cylindre vertical de la membrane semi-perméable; et les plaques de base réutilisable qui peut contenir jusqu&#39;à 48 inserts à la fois. La membrane de dialyse a un qui est idéal pour des études de liaison à la drogue macromolécule de coupure 8 kDa de poids moléculaire (MWCO). Le rapport des volumes zone superficielle élevée du compartiment de membrane permet une dialyse rapide et équilibration. Les deux inserts et la plaque de base ont été validés pour une liaison non spécifique minimale. La combinaison du dispositif RED avec des techniques bioanalytiques fournit des estimations précises des fractions non liées de médicaments en pLasma. 8, 9 Bien que conçu à l&#39;origine pour mesurer liaison aux protéines plasmatiques, le dispositif RED a été utilisé dans plusieurs études de liaison de tissus en utilisant broyats. 10, 11 Dans ce protocole, on mesure la drogue se liant à caseum, les débris nécrotiques excisée des lésions nécrotiques et des cavités de lapins infectés par la tuberculose. Le acellulaire et la nature non-vasculaire caséeuse le rend facile à homogénéise en une suspension homogène qui est compatible avec le dosage. Étant donné que caseum est fastidieux à produire et difficiles à trouver, le protocole a été validé pour une utilisation avec une matrice de substitution qui est préparé à partir de macrophages spumeux. macrophages dérivés de monocytes THP-1 sont induits par l&#39;acide oléique pour accumuler plusieurs corps lipidiques qui leur donnent leur aspect « mousseuse ». Ces cellules chargées de lipides sont récoltées etTraité pour produire une matrice que nous utilisons comme substitut au caséum. Cette étude a montré que la liaison du médicament à cette matrice de substitution est bien corrélée à la liaison avec le caséum, imitant efficacement le processus in vivo qui entrave la pénétration du médicament dans le noyau caséo de granulomes et de cavités.

<table><tbody><tr><td>Lapins blancs de Nouvelle-Zélande</td> Covance-HN878 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Ressources</td><td>NR-13647&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Cétathésie (kétamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Santé animale</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Santé animale</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodique et phénytoïne sodique) Solution&nbsp ;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 lignée cellulaire monocytaire</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&sup2 ; Fiole traitée TC (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 média sans glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Sérum fœtal bovin, irradié aux rayons gamma.</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamine, 200 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC parabole, 145 mm x 20 mm, ventilée</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Acide oléique&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Plaque de base réutilisable</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Inserts, 50/boîte&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Outil de retrait d’insert Pierce RED&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Joint adhésif</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, 10x 500 mL (Gibco)&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie&nbsp ;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de vérapamil</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Sel de sodium de diclofénac</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan, 0,4 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>Accessoire d’homogénéisateur de broyeur à billes, billes métalliques en vrac</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Cobalt 60 Irradiateur</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&nbsp ; Hémantimètres jetables à puce C</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique droit</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>Système de chromatographie liquide binaire</td><td>Agilent</td><td>1260</td> Spectromètre <td>de masse multi-composants</td></tr><tr><td></td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

un<em&gt; in vitro</em&gt; ensemble de liaison de caséine qui prédit la pénétration des drogues dans les lésions tuberculeuses

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

L&#39;éradication de la maladie de la tuberculose nécessite des schémas thérapeutiques qui peuvent pénétrer dans les couches multiples de lésions pulmonaires complexes. La distribution des médicaments dans les noyaux caséeuses des cavités et des lésions est particulièrement crucial car ils abritent des bactéries sous-populations tolérantes médicaments communément appelés persisters. Les procédés existants pour la mesure de la pénétration du médicament dans les lésions de la tuberculose comportent in vivo coûteuses et longues études pharmacocinétiques couplés à des techniques de bioanalyse ou d&#39; imagerie. A été proposé La mesure in vitro du médicament se liant à des macromolécules caseum comme une alternative à ces techniques étant donné que cette liaison entrave la diffusion passive de molécules de médicament à travers caseum. dialyse d&#39;équilibre rapide est un système rapide et fiable pour effectuer des protéines plasmatiques et des études de liaison de tissus. Dans ce protocole, nous avons utilisé un dispositif de dialyse d&#39;équilibre rapide (RED) pour mesurer la liaison à la drogue broyats de caseum qui est EXCISDes lésions et des caries des lapins infectés par la tuberculose. Le protocole décrit également comment générer une matrice de substitution à partir de macrophages THP-1 chargés de lipides à utiliser à la place du caséum. Cet essai de liaison caseum / substitution est un outil important dans la découverte de médicaments contre la tuberculose et peut être adapté pour aider à étudier la distribution de médicaments dans des lésions ou des abcès causés par d&#39;autres maladies.

À l&#39;aide de ce protocole, nous avons testé des centaines de composés de développement de médicaments contre la tuberculose pour leur efficacité prédite à la casée pénétrante. La figure 1 permet de visualiser les concepts de base du dosage RED. La membrane de dialyse des inserts RED permet aux petites molécules non liées de se diffuser du puits du donneur au bien récepteur, atteignant finalement un équilibre entre les deux compartiments. Les petites molécules liées à ...

Nous décrivons ici une méthode de dialyse à l&#39;équilibre rapide (RED) pour mesurer la liaison du médicament à la caséine à partir de lésions et cavités de la tuberculose pulmonaire. Le protocole est également utilisé avec une matrice dérivée de macrophages en mousse qui est un substitut efficace à la casée.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensemble de liaison de caséine qui prédit la pénétration des drogues dans les lésions tuberculeuses

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

L'objectif général de ce protocole est de prédire la liaison des médicaments au ca sébeux provenant de lésions tuberculeuses. Cette méthode peut aider à déterminer l'efficacité avec laquelle les antimicrobiens pénètrent dans le noyau caséux des lésions nécrotiques, sans recourir à des modèles animaux ni à des techniques d'imagerie coûteuses. Bien que cette méthode puisse fournir des informations utiles pour la découverte directe de traitements contre la tuberculose, elle peut également être appliquée à d'autres maladies caractérisées par la formation de lésions ou d'abcès où la pénétration du médicament est limitée.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la constance dans l'exécution du protocole garantira la reproductibilité des données entre les expériences. Aujourd'hui, je vais démontrer la procédure de culture cellulaire et la préparation de la matrice substitutive. Hsin-pin, un collaborateur scientifique de notre laboratoire, démontrera le bon essai.Faire croître les monocytes THP-1 dans des flacons de culture cellulaire T-175 contenant 80 mL de milieu RPMI 1640, avec 2 millimolaire de L-glutamine et 10 pour cent de sérum de veau fœtal. Incuber les flacons à 37 degrés Celsius avec 5 pour cent de dioxyde de carbone pendant trois à quatre jours. Une fois que les cellules atteignent environ 70 pour cent de confluence, les répartir dans deux tubes coniques de 50 mL et les centrifuger à 150 × g pendant cinq minutes.Après la centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 10 mL de milieu RPMI 1640. Prélever cinq microlitres de cette culture et les ajouter à un tube de 1,5 mL contenant 45 microlitres de bleu de trypan. Mélanger soigneusement par pipetage.Transférez 10 microlitres vers un hémocytomètre. À l’aide d’un microscope optique avec un grossissement de 10x, comptez le nombre de monocytes THP-1 viables. Après avoir déterminé le nombre de cellules viables par millilitre de culture, diluez-les avec du milieu RPMI pour obtenir une densité finale de 1,25 × 10⁶ cellules par millilitre.Ajouter 40 microlitres de PMA à 100 micromolaire dans le tube. Puis transférer la culture dans une plaque de culture cellulaire de 140 fois 20 millimètres. Laisser les cellules s’adhérer toute la nuit dans l’incubateur.Ensuite, diluez l'acide iliaque pur dans de l'éthanol pour obtenir une concentration de 0,1 molaire. Ici, 31,7 microlitres d'acide iliaque sont dissous dans 968,3 microlitres d'éthanol. Diluez la solution dans du milieu RPMI frais, préalablement réchauffé, pour obtenir une concentration de 10 millimolaire.Diluer la suspension d'acide iliaque à une concentration finale de travail de 0,4 millimolaire dans du milieu RPMI préchauffé à 37 degrés Celsius. La dilution de l'acide iliaque dans le milieu RPMI préchauffé est essentielle pour assurer une dissolution suffisante de l'acide gras en solution aqueuse. À l’aide d’une pipette, retirer le milieu existant et les cellules non adhérentes à partir de la plaque de culture cellulaire contenant les macrophages THP-1, puis ajouter délicatement 40 mL d’acide iliaque à 0,1 millimolaire.Incuber à 37 degrés Celsius dans l'incubateur pendant la nuit. Le lendemain, utiliser un microscope optique avec un grossissement de 40x pour confirmer visuellement la présence de nombreuses inclusions lipidiques dans les macrophages THP. Les corps lipidiques apparaissent comme de petites structures sphériques claires dans le cytoplasme.Retirer tout le milieu RPMI de la plaque de culture cellulaire et laver doucement les cellules adhérentes deux fois avec du PBS, en utilisant une pipette sérologique de 50 mL. Ajouter 40 mL de PBS contenant l'EDTA à 5 millimolaire sur la plaque. Incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.Ensuite, pour détacher les macrophages moussants, utilisez une pipette serologique de 10 mL et effectuez plusieurs aspirations et dispensations sur toute la surface de la plaque. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 mL. Et centrifugez-la à 150 ×g pendant cinq minutes.Après la centrifugation, resuspendre le culot cellulaire dans 10 mL de PBS et le transférer dans un tube conique de 15 mL préalablement pesé. Centrifuger à nouveau à 150 ×g pendant cinq minutes. Puis, aspirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette serologique et le jeter.Soumettez les palettes de macrophages mousses à trois cycles de congélation-décongélation. Alternez entre la glace sèche et une incubation à 37 degrés Celsius sur un bloc thermique afin de lyser les cellules. Incubez-les ensuite à 75 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes pour dénaturer les protéines de la matrice.Conserver les plaques à moins 20 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles soient nécessaires. Les dispositifs d'équilibre rapide, ou test RED présentés dans cette section de la vidéo, peuvent être réalisés soit avec la matrice substitutive que nous venons de préparer, soit avec des échantillons provenant de lésions de lapins infectés par la tuberculose. Ici, nous montrerons le test tel qu'il est effectué sur la matrice substitutive.Préparez des solutions mères à 10 millimolaire de tous les composés testés. Ici, la moxifloxacine est préparée dans du DMSO. Diluez à des solutions de travail de 500 micromolaire dans du DMSO avant chaque essai.Placer le tube contenant le caséum excisé ou la matrice substitutive. Soustraire le poids du tube vide afin d'obtenir le poids du caséum ou de la matrice substitutive seul. Ajouter deux à trois billes métalliques par tube, puis ajouter du PBS selon un rapport de un à neuf (poids/volume). À l’aide d’un vortex, homogénéiser le caséum ou la matrice substitutive pendant une minute.Ajouter 6,5 µL du composé test préparé à 643,5 µL de l'homogénat. Pour obtenir une concentration finale de cinq micromolaire, effectuer un vortex. Ensuite, placer les inserts rouges dans la plaque de base.Préparez les inserts pour chaque test, chaque composé en triplicat. Ajoutez 200 microlitres de matrice additionnée du médicament dans la chambre donneur rouge de chaque insert rouge. Ensuite, ajoutez 350 microlitres de PBS dans chaque chambre réceptrice.Placez un scellé adhésif sur la plaque et incubez-la à 37 degrés Celsius dans le mélangeur thermique à 200 tours par minute pendant quatre heures. Après l'incubation, mélangez délicatement le contenu des chambres donneur et récepteur en pipettant de haut en bas deux à trois fois. Transférez 20 microlitres d'homogénat de chacune des chambres donneur dans 20 microlitres de PBS propre dans un tube de 1,5 mL.De même, transférez des aliquotes de 20 microlitres d'échantillons de PBS provenant des chambres réceptrices vers 20 microlitres d'homogénat propre. L'appariement matriciel élimine la nécessité d'établir deux courbes de vision des couleurs distinctes, une pour l'homogénat et une pour le PBS, dans le cadre de l'analyse quantitative. Le contenu des chambres donneuses forme un sédiment au fil du temps.Mélanger délicatement le contenu à l’aide d’une pipette avant de prélever des aliquotes. Ajouter 160 microlitres de mélange équivalent de méthanol à l’acétonitrile, contenant 500 nanogrammes par millilitre de diclofénac ou 10 nanogrammes par millilitre de vérapamil, dans chaque tube comme étalon interne. Vortexer pour précipiter les protéines.Centrifuger à 10 000 x g pendant cinq minutes pour faire sédimenter le précipité, puis transférer les surnageants dans des plaques profondes de 96 puits pour analyse par spectrométrie de masse en chromatographie liquide (LCMS). Élaborer des courbes de calibration allant de un à 1 000 nanomolaires pour chaque composé testé en réalisant des dilutions de la solution mère du composé, tout en conservant la même composition matricielle que celle des échantillons. Quantifier la concentration du composé testé dans les échantillons provenant des compartiments donneur et récepteur à l’aide d’une méthode LCMS.Calculez la fraction non liée, ou fu, du médicament et de la matrice diluée, en utilisant l'équation un présentée ici. Ensuite, calculez la fu dans la matrice non diluée en utilisant l'équation deux, où D est égal à un facteur de dilution de 10. Enfin, vérifiez la récupération ou le bilan de masse de chaque composé à l'aide de l'équation trois présentée ici.Pour identifier les composés présentant des problèmes de stabilité, de métabolisme ou de liaison non spécifique. Notez que le rendement se situe généralement entre 70 pour cent et 130 pour cent. Le protocole décrit dans cette vidéo a été utilisé pour tester des centaines de composés en développement contre la tuberculose afin d'évaluer leur efficacité prévue à pénétrer le caséum.La membrane de dialyse des inserts rouges permet aux petites molécules non liées de diffuser du puits donneur vers le puits récepteur, atteignant ainsi un équilibre entre les deux compartiments. Les petites molécules liées à des macromolécules telles que les protéines ou les lipides restent piégées dans le puits donneur. L'analyse quantitative des échantillons provenant des deux compartiments permet de calculer la fraction non liée, fu, de chaque petite molécule dans le caséum ou dans la matrice substitutive, comme illustré ici.Plus la valeur de fu est élevée, plus le médicament diffuse intensément dans le caséum. L'imagerie par spectrométrie de masse avec désorption/ionisation laser assistée par matrice, ou MALDI, a été réalisée pour six médicaments. Des cartes ioniques de lésions pulmonaires représentatives sont présentées ici, où l'intensité du signal est indiquée par l'échelle à gauche.L'hématoxyline et la coloration ESN ou HNE d'incisions adjacentes sont indiquées ci-dessous. Les lignes de contour en noir et blanc mettent en évidence le centre caséeux de chaque lésion. Ces données sont compatibles avec l'hypothèse selon laquelle les molécules du médicament diffusent vers la couche externe du caséum à partir de son interface avec les couches cellulaires de la lésion.La liaison aux macromolécules caséineuses piège le médicament, l'empêchant de diffuser davantage vers le cœur caséineux. Comme illustré ici, la matrice préparée à partir de macrophages gras dérivés de THP-1 constitue un substitut efficace du caséum réel. La liaison dans les deux matrices est fortement corrélée.Grâce à cette procédure, plusieurs composés peuvent être testés simultanément afin de gagner du temps et des ressources. Nous appelons cela le test en cassette. Depuis son développement, ce test a été utilisé par plusieurs programmes d'optimisation de composés pour la découverte de médicaments contre la tuberculose.N'oubliez pas que le travail avec des microbactéries et des échantillons de tissus infectés par la tuberculose peut être extrêmement dangereux, et qu'un protocole validé de stérilisation des tissus, utilisant un rayonnement gamma, doit être appliqué avant de manipuler des échantillons de gaines infectées dans un laboratoire de niveau de sécurité biologique 2 (BSL2). Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Sarathy, J. P. et al. Un test de liaison in vitro Caseum qui prédit la pénétration du médicament dans les lésions de tuberculose. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo présente un test in vitro permettant de mesurer la liaison d’un médicament au caseum à partir de lésions de tuberculose à l’aide d’une dialyse d’équilibre rapide. Il décrit les étapes de préparation des suspensions de caséum, d’exécution de la dialyse et de calcul de la fraction médicamenteuse non liée pour prédire la...

Mesure de la liaison d’un médicament au caséum à partir de lésions tuberculeuses par la méthode de dialyse à équilibre rapide

Cette vidéo présente un test permettant d’évaluer l’efficacité des médicaments contre l’infection à Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  Un modèle d’infection in vitro contenant des agrégats de Mtb/macrophages est généré qui imite l’infection in vivo. Lors de l’introduction d’antibiotiques appropriés, leur efficacité est testée par dosage de la résuzarine pour surveiller la survie des bactéries avec des concentrations de médicament croissantes.

Un test pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre un modèle d’infection à Mycobacterium tuberculosis

Ici, nous décrivons une analyse phénotypique applicable aux écrans à haut débit/à haute teneur de l’ARN synthétique de petit-interférent (siRNA), du composé chimique, et des bibliothèques mutantes de tuberculose de mycobactérie. Cette méthode repose sur la détection de Mycobacterium tuberculosis marqué par fluorescence dans une cellule hôte marqué par fluorescence à l’aide d’une microscopie confocale automatisée.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Le charcoal agar resazurin assay (CARA) est une méthode semi-quantitative à débit moyen pour évaluer l’activité des agents d’essai contre les mycobactéries qui se répliquent, qui ne se répliquent pas ou qui sont les deux.  Le CARA permet d’évaluer rapidement l’activité dépendante du temps et de la concentration et de déterminer les paramètres à suivre à l’aide d’essais d’unités formant colonies (UFC).

Visualisation de l&#39;Agar Charcoal résazurine Essai pour semi-quantitative, Moyen-débit Enumération des mycobactéries

Nous avons mis au point un système modulaire de criblage à haut débit pour la découverte de nouveaux composés contre la tuberculose Mycobacterium, ciblant les bactéries à croissance intracellulaire et en bouillon ainsi que cytotoxicité contre la cellule hôte mammifère.

Système d&#39;efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

De nouveaux modèles et tests qui amélioreraient le processus de développement précoce des médicaments antituberculeux de nouvelle génération sont hautement souhaitables. Nous décrivons ici un test rapide, peu coûteux et compatible BSL-2 pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre Mycobacterium tuberculosis qui peut être facilement adapté au criblage à haut débit.

Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer l&#39;efficacité des médicaments contre Macrophage repiquées<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Nous décrivons ici un protocole à l’aide de microdissection de saisie de laser couplée à l’analyse de LC/MS dans l’espace-quantifier des distributions de médicaments au sein des granulomes de tuberculose pulmonaire. L’approche a largement applicables à la quantification des concentrations du médicament dans les tissus à haute détails spatiaux.

Quantification spatiale des drogues dans les lésions de la tuberculose pulmonaire par Laser capturer Microdissection liquide chromatographie en spectrométrie de masse (LCM-LC/MS)

Cette étude a mis au point un test de criblage à haut débit contre Mycobacterium abscessus avec une souche à double rapporteur récemment créée, en utilisant la fluorescence et la luminescence pour évaluer rapidement la viabilité bactérienne. Ce protocole sera pertinent pour les chercheurs qui souhaitent cribler de nouveaux médicaments contre cette bactérie résistante aux médicaments.

Développement d’un test pour le criblage de médicaments à haut débit contre les mycobactéries

Ici, nous présentons un protocole permettant d’identifier les candidats potentiels à la tuberculose par dépistage phénotypique, englobant la synthèse chimique d’un composé de 4-aminoquinoline, la détermination de sa concentration inhibitrice minimale contre Mycobacterium tuberculosis, et l’évaluation de sa cytotoxicité dans les lignées cellulaires de mammifères.

Identification des candidats potentiels contre la tuberculose : guide étape par étape pour la synthèse, la détermination de la CMI et l’évaluation de la cytotoxicité chez les cellules de mammifères

Cet article décrit la procédure pour la formation et la visualisation d'un biofilm bactérien grandi au sein d'une chambre de glisser de 8...

Dans la formation de biofilms in vitro dans une diapositive Chambre de 8 puits

Découvrez la méthode de dialyse à équilibre rapide pour prédire la liaison des médicaments au caséum des lésions tuberculeuses. Cette technique évalue la pénétration antimicrobienne sans modèles animaux coûteux.

Un

Explorer plus de vidéos