Name: Nouveau test pour froid dans nociception drosophile larves (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Découvrez un nouvel essai de nociception au froid chez les larves de Drosophila utilisant une sonde Peltier personnalisée. Cette méthode permet une application précise de stimuli froids nocifs et la quantification des réponses comportementales spécifiques.

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Nous remercions Sarah Wu et Camille Graham pour développer les premières phases de l&#39;essai de sonde froide, Stock Center drosophile Bloomington pour les stocks de mouches, et les membres du laboratoire Galko pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le NIH NRSA (NIH F31NS083306) à HNT, et par le NIH R01NS069828, R21NS087360 et Université du Texas MD Anderson Fellowship Clark dans la recherche fondamentale à MJG.

1. Préparation de Larves <ol><li> Soulever des actions ou des croisements génétiques dans un incubateur à 25 ° C. <ol><li> Si la culture d&#39;une croix, utilisez 20-25 femelles vierges et 15-20 mâles par flacon contenant la semoule de maïs régulier mouche médias. Permettre aux femelles de pondre des œufs pendant environ 48 h avant de les transférer dans un nouveau flacon de nourriture. </li></ol></li><li> 4-5 jours après la ponte d&#39;oeufs, de recueillir 3 ème stade larves du génotype désiré en injectant doucement un courant d&#39;eau dans les aliments en bouillie et les larves, et verser le contenu dans une taille moyenne boîte de Pétri propre (60 mm x 15 mm). </li><li> Ensuite, trier doucement larves par taille en utilisant une pince ou d&#39; un pinceau pour empêcher plus grande « errance 3 ème stade larvaire » ou de petites larves maladif d&#39;être testé. Jeter les larves contenant des marqueurs génétiques indésirables ou les équilibreurs. </li><li> Demandez à un laboratoire d&#39;autres plats d&#39;étiquettes ou des conteneurs où les larves triés seront placés de telle sorte que l&#39;expérimentateur peut être « aveugle » à l&#39;exétat Perimental ou génotype des larves le cas échéant. L&#39;expérimentateur peut appliquer des étiquettes décodées aux données recueillies après l&#39;expérience à l&#39;aide d&#39;une clé générée par un membre du laboratoire. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un scoopula, transférer une noisette de produits frais dans une (35 mm x 10 mm ou 60 mm x 15 mm) propre, boîte de Petri marqué à mi-chemin rempli d&#39;eau à température ambiante. </li><li> Déplacez doucement les larves triés sur les aliments (pour éviter la famine ou dessication si le test est prévu de prendre plus de 20 minutes) en utilisant une pince ou d&#39;un pinceau. </li></ol> 2. Essai sonde froide <ol><li> Mettez l&#39;unité de sonde froide permettant quelques minutes pour le refroidir à la température désirée. Si la mise à des températures plus basses, la condensation se forme probablement le long de la sonde. </li><li> Essuyer tout excès d&#39;humidité avec un laboratoire lingette avant l&#39;application de la larve. Lorsqu&#39;ils ne sont pas en cours d&#39;utilisation immédiate, placez le capuchon isolant sur la sonde à la fois isoler et de garder la pointe propre et éviter tout dommage. </li><li> Placer un stade larvaire mi 3 e sur une mince feuille de vinyle mobile foncé (typiquement, en utilisant un petit morceau découpé dans un liant de bloc - notes) sous un microscope à champ clair. Les aides en vinyle noir dans la visualisation de contraste et en déplaçant la larve sans toucher à l&#39;aligner correctement avec la sonde. </li><li> Ajuster le microscope (voir le tableau des matériaux) et l&#39; unité de lumière (voir le tableau des matériaux) de luminosité moyen (50 à 75% de la luminosité maximale) pour fournir un contraste et d&#39; empêcher la larve de sécher trop vite. </li><li> Jeter toutes les larves qui ne présentent pas d&#39;abord la locomotion normale car ils péristaltiques pourraient brouiller les résultats. La larve doit être humide de la boîte de Pétri d&#39;eau sinon la larve collera au vinyle inhibant la locomotion normale. L&#39;eau ne doit pas flaque d&#39;eau autour de la larve. </li><li> Faire avancer la sonde à la main en direction de la chenille à un angle de 90º par rapport à l&#39;axe du corps antéropostérieur, en utilisant le vinyle pour déplacer la chenille en corla position rect (voir figure 1A). </li><li> Orient la pointe de la sonde à jeter doucement sur la surface dorsale du milieu de la chenille avec la sonde à un angle d&#39;environ 45 degrés vers la platine du microscope. </li><li> Au contact de la sonde, commencer une minuterie de laboratoire. Appliquer une pression suffisante vers le bas pour mettre en retrait légèrement la surface de la cuticule des larves tout en permettant le mouvement vers l&#39;avant ou vers l&#39;arrière. </li><li> Maintenir la sonde en place pendant 10 s ou jusqu&#39;à ce qu&#39;une réponse comportementale évoqués froid est observée - selon la première. Retirez ensuite la sonde. </li><li> Notez la réponse comportementale observée et le temps d&#39;attente de réponse. Qui ne répondent larves pas dans les 10 s sont considérés comme « non-répondeurs ». Latence peuvent également être enregistrées pour les intervenants et utilisés pour mesurer les changements dans la robustesse / amplitude de la réponse. </li><li> Jeter la larve et préparer la prochaine. </li><li> Répéter les étapes 2.3 à 2.11 jusqu&#39;à ce que le nombre souhaité de larves d&#39;essai est atteinte (trois ensembles de n = 20-40 larves étaient used ici). </li></ol>

<ol><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).</li>
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<li>Breslow, N. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2334776?seq=1#page_scan_tab_contents">A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship.</a> Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).</li>
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</ol>

Une demande de brevet aux Etats-Unis (CL) est en cours sur la conception de la sonde froide. Des informations supplémentaires sur les détails des numéros de pièces de sonde froide et la construction, ainsi que des conseils supplémentaires sur la conception d&#39;outils seront fournis sur demande.

L&#39;essai décrit ici peut être utilisé pour évaluer qualitativement et quantitativement nociception ou une sensibilisation nociceptive chez les larves de diverses origines génétiques, aux influences environnementales et / ou des conditions de dommages induits. Etant donné que ce dosage permet une application focale d&#39;un stimulus froid, avec cet outil, on peut évaluer la fonction d&#39;un sous-ensemble de neurones sensoriels périphériques spécifiquement pour répondre à des températures froides. Fait intéressant, ce...

Drosophile est avéré être très utile pour l&#39;identification de nouveaux gènes conservés et des circuits neuronaux qui sous - tendent les comportements complexes. Mouche de fournir une boîte à outils génétique sophistiqué et un système nerveux simplifié qui permettent la manipulation génétique et neuronale précise 1, 2, 3, 4 pour disséquer les bases cellulaires et moléculaires de la nociception 5, 6, 7. Les larves sont particulièrement utiles pour ces analyses, étant donné que les tests comportementaux pour toucher doux 8, 9, 10, de la chaleur nocive 11, 12, 13 et de la sensation mécanique de stimuli nocifs 4, </sup&gt; 11 ont déjà été mis en place, et la cuticule des larves transparent permet une imagerie en temps réel ou fixe de l&#39;épiderme et les neurones sensoriels sous - jacents. Récemment, un essai de froid délétère a également été mis au point 7, que nous décrivons plus en détail ici. Utilisation d&#39; une fine sonde froide conique à pointe, nous montrons que les larves de Drosophila présentent un ensemble de comportements réactifs spécifiques à froid, distincte de comportements observés pendant la locomotion normale, après toucher doux, ou après stimuli de température mécanique ou secondaire dure 7, 8, 11 . Les comportements spécifiques à froid comprennent une contraction robuste de tout le corps (CT), une augmentation de 45-90º les segments postérieurs (PR) et une augmentation simultanée de la partie antérieure et postérieure des segments en forme de U (US). La prévalence de ces comportements augmente avec des températures décroissantes mais chacun des pics à slégèrement différentes températures froides. Des travaux récents suggèrent que les réponses CT sont médiées par différents neurones sensoriels périphériques que ceux qui répondent à la chaleur nocive ou stimuli mécaniques sévères 7. Tout comme les nocicepteurs vertébrés, Drosophila dendritique multiple (DM) les neurones sensoriels périphériques ont des structures dendritiques complexes qui arborisent sur l&#39;épiderme 1. md neurones sont présents dans tous les segments du corps de la larve, faisant saillie de leurs axones à la moelle épinière ventrale 14. md neurones sensoriels sont séparés en quatre classes différentes (I-IV) sur la base de la morphologie dendritique et ont différentes fonctions sensorielles 4, 9, 10, 15, 16, 17. Alors que les neurones de classe IV sont nécessaires pour les réponses des rouleaux du corps latéral larvairesà des températures élevées ou à des stimuli mécaniques sévères 4, classe III neurones sont nécessaires pour des réponses tactiles doux 9, 10 et ne sont pas seulement activées par le froid, mais aussi sont nécessaires pour les réactions comportementales évoqués froides 7. Les deux classes III et de classe IV canaux neurones utilisent des récepteurs potentiels discrets transitoire (TRP) pour faciliter les réponses comportementales aux nuisibles 7, 11, 18 et stimuli non nocifs 9, 10, 17, 19. En outre, les larves nociception est sensibilisée après une blessure, au niveau cellulaire 20 et comportementaux 12, 21. L&#39;essai décrit ici permet de quantification soit normal ou potentiellement altéré réponses comportementales à des températures froides allant de froid nocive (≤ 10 ° C), refroidir inoffensif (11-17 ° C), à des températures ambiantes (18 à 22 ºC). Les températures froides utilisées dans ce test sont capables d&#39;activer directement la classe III neurones sensoriels, provoquant une augmentation de calcium solides, reproductibles et les réactions comportementales évoqués à froid, qui peuvent être analysées qualitativement et quantitativement 7. Cet essai peut être appliqué à des larves de pratiquement tous les génotypes, ainsi que pour les larves exposées à diverses conditions environnementales (modifié nutrition, des blessures, des agents pharmacologiques) pour déterminer les deux facteurs génétiques et environnementaux qui ont un impact nociception froid, la sensibilisation nociceptive ou plasticité nociceptive. Étant donné que thermosensation est omniprésente dans de nombreuses espèces, ce test constitue un outil précieux pour l&#39;étude de la nociception et peut découvrir des gènes cibles nouvelles ou des interactions neuronales qui améliorerontnotre compréhension de nociception vertébrés. La sonde froide intégré personnalisé (voir sonde froide, Table des matières) utilise un dispositif à effet Peltier température en boucle fermée contrôlé, qui refroidit l&#39;arbre d&#39;aluminium et pointe conique par conduction thermique. Une thermistance est noyée à l&#39;intérieur de la pointe conique d&#39;aluminium rapports de la température en temps réel sur l&#39;unité de commande. Un dissipateur de chaleur et le ventilateur sont fixés sur le module thermoélectrique pour réguler la charge thermique de l&#39; effet Peltier (Qc) de sorte que la plage de température désirée de (22-0 ° C) peut être obtenue (voir Unité de contrôle thermique, Table des Matières). Le stimulus nocif à froid de la pointe de sonde froide est appliquée à la main à la ligne médiane dorsale, à segment (s) à égale distance des extrémités antérieure et postérieure ( à peu près le segment A4, voir la figure 1A) de la larve. En réponse à des stimuli froids, les larves produisent généralement l&#39;un des trois comportements évoqués à froid à l&#39;intérieur de la coupure d&#39;un 10: un corps pleincontraction (CT), une augmentation de 45-90º segments antérieur et postérieur en forme de U (US), ou une augmentation des segments postérieurs (PR) (décrits dans les résultats). Aucun de ces comportements sont effectués lors de la locomotion normale ou péristaltiques comportement alimentaire. Ces comportements se distinguent également des réponses tactiles douces et la réponse au roulement aversif à des températures élevées ou des stimuli mécaniques nocifs.

<table><tbody><tr><td>Sonde froide</td><td>Pro-Dev Engineering</td><td>Sur mesure Sur demande Les</td><td>numéros de pièces et les détails de construction peuvent être fournis sur demande</td></tr><tr><td>Unité de contrôle thermique</td><td>TE Technology</td><td>Boîtier sur mesure</td> Les <td>numéros de pièces et les détails de construction peuvent être fournis sur demande</td></tr><tr><td>Microscope Zeiss Stemi 2000</td><td>Zeiss</td><td>NT55-605</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite MI-150 Illuminateur</td> <td>haute intensitéDolan-Jenner Industries.</td><td>A20500</td><td></td></tr><tr><td>Schott Dual Gooseneck 23 pouces Guide de lumière à fibre optique</td><td>Schott North America, Inc.</td><td>Schott A08575</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>FST</td><td>FS-1670</td><td>Utilisée pour trier et manipuler les larves. Assurez-vous de lisser et d’émousser légèrement les pointes des pinces pour réduire le risque de perforer ou de blesser accidentellement les larves</td></tr><tr><td>Pinceau</td><td>Dick Blick Art Materials</td><td>06762-1002</td><td>Utilisé pour trier et manipuler les larves. Il est utile si le pinceau est humide pendant l’utilisation.</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en polystyrène de 35 mm x 10 mm</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en polystyrène de 60 mm x 10 mm</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Morceau de vinyle noir (au moins 2 pouces x 2 pouces)</td><td></td><td></td><td>Utilisé pour fournir un contraste et orienter les larves à la sonde froide</td></tr><tr><td>Fisherbrand Spatule Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td>Utilisé pour déplacer les aliments</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Utilisé pour sécher les larves et sonder à froid s’il y a un excès d’humidité</td></tr></tbody></table>

nouveau test pour froid dans nociception<em&gt; drosophile</em&gt; larves

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Comment les organismes réagissent sens et à des températures nocives est encore mal comprise. En outre, les mécanismes sous-jacents sensibilisation des mécanismes sensoriels, comme chez les patients présentant une neuropathie périphérique ou la sensibilisation induite par blessure, ne sont pas bien caractérisées. Le modèle de Drosophila génétiquement traitable a été utilisé pour étudier les cellules et les gènes requis pour la détection de la chaleur nocive, qui a donné plusieurs gènes conservés d&#39;intérêt. On sait peu cependant sur les cellules et les récepteurs importants pour la détection du froid délétère. Bien que, la drosophile ne survit pas à une exposition prolongée à des températures froides (≤10 ºC), et évitera frais, préférant des températures plus chaudes dans des essais de préférence du comportement, la façon dont ils détectent et peut - être éviter les stimuli nocifs froid n&#39;a été étudié récemment. Ici, nous décrivons et caractérisons le premier froid délétère (≤10 ºC) test de comportement enDrosophile. En utilisant cet outil et analyse, nous montrons un enquêteur comment évaluer qualitativement et quantitativement les comportements nociceptifs froids. Cela peut se faire dans des conditions normales de culture / santé, ou probablement dans le contexte de la maladie, d&#39;une blessure ou d&#39;une sensibilisation. De plus, ce dosage peut être appliqué à des larves sélectionnés pour les génotypes souhaités, ce qui pourrait avoir un impact sur thermosensation, la douleur, ou la sensibilisation nociceptive. Étant donné que la douleur est un processus hautement conservée, en utilisant cet essai pour étudier plus nociception thermique glanera probablement importante compréhension des processus de la douleur dans d&#39;autres espèces, y compris les vertébrés.

Les larves de Drosophila se déplacent avec un mouvement péristaltique qui comprend des pauses occasionnelles, tour à tour de tête, et des changements de direction 22. En réponse à l&#39;application focale d&#39;un stimulus froid délétère cependant, les larves présentent un ensemble de comportements uniques, contrairement au rouleau latéral aversif à la chaleur nocive et des stimuli mécaniques. Ces comportements sont également différents de réponses au tou...

Ici , nous démontrons un essai de roman pour étudier nociception froid chez les larves de drosophile. Ce test utilise une sonde à effet Peltier sur mesure intégrée capable d&#39;appliquer un stimulus froid délétère focale et se traduit par des comportements quantifiables à froid spécifiques. Cette technique permettra en outre la dissection moléculaire et cellulaire de nociception froid.

Nouveau test pour froid dans nociception<em&gt; drosophile</em&gt; larves

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

L'objectif général de ce test au froid nociceptif est de pouvoir quantifier et évaluer les modifications dans la détection du froid passant du non nocif au nocif. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la nociception, notamment en facilitant l'identification de gènes novateurs et conservés impliqués dans la nociception au froid ainsi que de modulateurs des réponses douloureuses dans les maladies ou après une lésion. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à permettre une manipulation précise du stimulus de froid nociceptif et la quantification des réponses induites par le froid dans divers contextes environnementaux et génétiques.En général, les personnes novices avec cette méthode devront s'exercer à appliquer de manière constante la sonde avant de commencer une expérience. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons constaté que les larves de drosophile réagissent à la chaleur nocive, et nous nous sommes demandé si elles réagissaient de la même manière au froid nocif. Élever des souches ou des croisements génétiques de drosophile dans un incubateur à 25 degrés Celsius.Remarque : si vous cultivez un croisement, utilisez 20 à 25 femelles vierges et 15 à 20 mâles par flacon contenant du milieu ordinaire à base de farine de maïs pour drosophiles, et faites-les se reproduire pendant environ 48 heures avant de transférer les mouches dans un nouveau flacon contenant du milieu alimentaire. Cinq jours après le début de la culture, récupérez les larves de troisième stade du génotype souhaité en projetant doucement un filet d'eau dans le milieu mou et les larves. Versez ensuite le contenu dans une boîte de Pétri propre de taille moyenne.Ensuite, trier délicatement les larves selon leur taille, en utilisant une pince pour écarter les larves de troisième stade plus grandes et errantes, ou les larves petites et faibles. Éliminer les larves portant des marqueurs génétiques indésirables ou des chromosomes équilibreurs. Faire étiqueter par un autre membre du laboratoire les récipients dans lesquels seront placées les larves triées, afin que l'expérimentateur reste aveugle quant à la condition expérimentale ou au génotype des larves.Utilisez une spatule pour transférer une petite quantité d'aliment frais dans une boîte de Pétri propre et étiquetée, remplie à moitié d'eau à température ambiante. Enfin, utilisez une pince pour déplacer délicatement les larves triées sur la nourriture afin d'éviter la famine ou la dessiccation, si le test doit durer plus de 20 minutes. Commencez par allumer l'unité de sonde froide et laissez-la refroidir quelques minutes jusqu'à la température souhaitée.Essuyez tout excès d'humidité sur la sonde avec un chiffon de laboratoire. Lorsqu'elle n'est pas utilisée immédiatement, placez un capuchon isolant sur la sonde afin de l'isoler, de maintenir la pointe propre et d'éviter tout dommage. Ensuite, placez une larve de troisième stade au tiers médian sur un mince morceau de vinyle sombre mobile pour faciliter la visualisation du contraste et l'alignement de la sonde.Ensuite, placez ce morceau de vinyle avec la larve sous un microscope en champ clair. Réglez le microscope et l'unité d'éclairage sur une luminosité moyenne afin d'obtenir un contraste adéquat et d'éviter que la larve ne s'assèche trop rapidement. À l'aide d'un pinceau humide, assurez-vous que la larve est humidifiée avec l'eau de la boîte de Pétri pour qu'elle n'adhère pas au vinyle, puis retirez l'eau excédentaire à l'aide d'un KimWipe.Faites avancer manuellement la sonde vers la larve selon un angle de 90 degrés par rapport à l'axe antéropostérieur du corps, en utilisant le vinyle pour positionner correctement la larve. Orientez ensuite la pointe de la sonde de manière à ce qu'elle repose délicatement sur la face médio-dorsale de la larve, la sonde formant un angle d'environ 45 degrés avec le plateau du microscope. Dès le contact de la sonde, déclenchez un chronomètre.Appliquer une pression vers le bas suffisante pour légèrement enfoncer la surface de la cuticule larvaire, tout en permettant encore un mouvement vers l'avant ou vers l'arrière. Ensuite, maintenir la sonde en place pendant jusqu'à 10 secondes ou jusqu'à l'observation d'une réponse comportementale induite par le froid, selon la première éventualité. Puis, retirer la sonde.Enregistrez la réponse comportementale observée et la latence de la réponse. Notez tout non-répondeur ou larve qui ne répond pas dans les 10 secondes. Enfin, éliminez la larve et préparez la suivante.Répétez la procédure jusqu'à ce que le nombre souhaité de larves de test soit atteint. Après contact avec la sonde froide, les résultats de cette expérience indiquent que les larves réagissent par les comportements induits par le froid suivants : contraction des segments antérieurs et postérieurs vers le centre du corps, CT ; élévation des segments antérieurs et postérieurs dans l'air pour former une forme en U, US ; élévation uniquement des segments postérieurs dans l'air, PR. De plus, différents comportements présentent des pics dans des plages de températures froides variables, de sorte que PR et US atteignent leur maximum entre trois et huit degrés Celsius, tandis que CT atteint son pic autour de neuf à 14 degrés Celsius. Enfin, lors de la comparaison des latences des différents comportements au froid, ces données montrent que les réponses CT étaient significativement différentes de PR et US à trois degrés Celsius et à 10 degrés Celsius, et de US à 20 degrés Celsius.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 30 à 40 minutes pour un ensemble de 30 larves. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de prêter attention à une locomotion anormale, au niveau d'humidité de la larve, ainsi qu'à la pression et au positionnement de la sonde froide sur la larve. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car une application incorrecte de la sonde froide pourrait entraîner des courbes de réponse à la dose différentes ou l'absence de comportement de réponse au froid.Après cette procédure, d'autres méthodes peuvent être utilisées, telles que l'imagerie en lumière fluorescente, l'analyse de l'expression génique et les tests comportementaux. Toutes permettront de déterminer comment l'exposition au froid affecte l'activité cellulaire, la morphologie, l'expression génique ou d'autres comportements. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la nociception au froid pour étudier les effets génétiques, environnementaux et liés aux maladies chez la drosophile.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser l'outil et le test de la sonde froide pour analyser les réponses induites par le froid et comprendre les mécanismes cellulaires et génétiques de la nociception au froid.

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