Basées sur la fluorescence neuraminidase Essai d'inhibition pour évaluer la sensibilité des virus de la grippe à la neuraminidase Inhibiteur Classe de Antiviraux

Nous décrivons l'utilisation d'un test d'inhibition de la neuraminidase par fluorescence phénotypiques pour évaluer la sensibilité des virus grippaux A et B à la classe des inhibiteurs de la neuraminidase de Antiviraux.

L’objectif général de cette méthodologie est d’évaluer la sensibilité des virus grippaux A et B aux inhibiteurs de la neuraminidase à l’aide d’un test basé sur la fluorescence. Cette méthode peut aider à déterminer si un virus de la grippe est résistant ou sensible à la classe des inhibiteurs de la neuraminidase. Le principe principal du test est de voir si l’inhibiteur antiviral de la neuraminidase bloque l’action de l’activité de l’enzyme neuraminidase.

Avant le test de sensibilité antivirale, le virus doit être cultivé jusqu’à un titre viral élevé en passant soit dans des cultures cellulaires telles que les cellules MDCK, soit dans des œufs de poule embryonnés. Dans cette démonstration, j’utiliserai des virus vivants de la grippe A des sous-types H1N1 et H3N2. En commençant par une plaque inférieure en U de 96 puits, distribuez 120 microlitres par puits de virus grippaux cultivés non dilués dans la première colonne.

Et 60 microlitres de tampon de dosage unique contenant 0,1 % de NP40 dans les 11 colonnes restantes. À l’aide d’une pipette multicanaux, effectuez en série deux dilutions complètes sur la plaque, en laissant la colonne 12 comme une ébauche contenant une seule fois le tampon de dosage. Transférez 50 microlitres de chacun des puits dans une plaque à fond plat transparent de 96 puits.

Ajouter 50 microlitres de 300 micromolaires MUNANA par puits. Et tapotez doucement l’assiette pour mélanger. Utilisez ensuite une scelleuse de plaque pour couvrir la plaque afin d’éviter l’évaporation.

Et incubez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ajouter 100 microlitres de solution d’arrêt par puits pour terminer la réaction. Et tapotez doucement l’assiette pour mélanger.

Utilisez un fluorimètre pour lire la plaque. Ensuite, après avoir tracé un graphique de la RFU par rapport aux dilutions virales selon le protocole de texte, déterminez la concentration appropriée de virus pour évaluer la sensibilité virale aux inhibiteurs de NA en utilisant le signal cible optimal comme point de référence, pour sélectionner le point médian de la section linéaire des courbes d’activité NA du virus. Pour préparer 300 micromolaires dans de l’amivir, dissolvez cinq milligrammes de zanamivir dans 50 millilitres de tampon deux fois plus dosé.

Préparez 300 micromolaires de carboxylate d’oseltamivir en dissolvant 5,8 milligrammes de carboxylate d’oseltamivir dans 50 millilitres de tampon de dosage deux fois. Dissoudre 5,7 milligrammes de peramivir trihydraté dans 50 millilitres deux fois le tampon de dosage pour une concentration de stock de 300 micromolaires. Préparez ensuite 300 micromolaires de laninamivir en dissolvant 5,2 milligrammes dans 50 millilitres deux fois le tampon de dosage.

À partir des stocks maîtres, préparer des stocks de travail de dix dilutions des inhibiteurs de NA dans des tubes à centrifuger de 50 millilitres avec les concentrations suivantes. Une attention particulière doit être accordée lors de la préparation de la série de concentrations d’inhibiteurs de NA. Toute irrégularité dans les concentrations d’inhibiteurs de NA sera évidente dans les courbes d’inhibition.

À l’aide de dilutions virales basées sur l’activité NA déterminée précédemment dans cette vidéo, préparez deux millilitres de dilutions virales dans un tampon de dosage unique contenant 0,1 % de tensioactif NP40 dans un bloc de puits de 96 profondeurs. Lorsque vous diluez le virus, assurez-vous qu’il est ajouté directement dans le tampon de dosage unique. Ceci est crucial, en particulier lorsque le volume de virus est très faible.

Distribuer le volume requis d’inhibiteurs de NA dans un réservoir de huit puits de profondeur. Distribuez ensuite 50 microlitres d’inhibiteurs de NA à des dilutions allant de zéro à 30 000 nanomolaires. Ajouter 50 microlitres de virus d’essai dilués par puits dans les colonnes un à 11.

Et 50 microlitres par puits de tampon d’analyse unique à la colonne 12. Tapotez doucement la plaque pour mélanger et couvrez-la pour éviter l’évaporation. Incuber ensuite la plaque à température ambiante pendant 45 minutes.

Après l’incubation, ajoutez 50 microlitres de 300 micromolaires de MUNANA dans chaque puits. Tapotez ensuite doucement la plaque pour mélanger et la couvrir. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Ajouter 100 microlitres de solution d’arrêt dans chaque puits. Et tapotez doucement l’assiette pour la mélanger. Utilisez ensuite un fluorimètre pour lire la plaque.

Pour calculer les valeurs de CI50, copiez et collez les données brutes produites par le fluorimètre dans une feuille de calcul au format de plaque à 12 colonnes commençant par la cellule A1. Ouvrez le logiciel d’ajustement et cliquez sur l’onglet expérience. Choisissez Échantillons alternatifs de 2 médicaments Fluoro 11. Cliquez sur l’onglet options et cochez Générer des graphiques.

Cliquez à nouveau sur les options et sélectionnez l’onglet Nouvelle clé. Enregistrez ensuite le fichier SEV de la clé d’inhibition dans le même dossier que le fichier de tableur de données brutes. Dans le fichier inhibition_key, énumérez tous les noms d’échantillons sous l’identifiant.Si quatre inhibiteurs de NA ont été testés, insérez des espaces pour deux rangées supplémentaires sous l’oseltamivir et tapez peramivir et laninamivir.

Enregistrez les modifications apportées au fichier inhibition_key. Revenez à la fenêtre d’ajustement de la courbe d’inhibition jasprv1.2 et sélectionnez le fichier de données brutes comme fichier d’expérience. Et le inhibition_key comme fichier clé.

Exécutez l’analyse. Ensuite, enregistrez les résultats aux formats CSV et PDF. Inspectez les valeurs IS50 et les formes de courbes générées par le logiciel.

Tous les points de données doivent se situer sur la courbe ou à proximité de celle-ci. Si ce n’est pas le cas, répétez le test d’inhibition de NA. Comme le montre cette courbe d’inhibition, la fluorescence en fonction de la concentration croissante d’inhibiteur de NA est tracée pour un virus A(H1N1)pdn09, A/Perth/82/2015.

L’IC50 est indiqué ici. Un résultat d’inhibition normale, d’inhibition réduite ou d’inhibition fortement réduite est attribué aux virus testés en comparant la CI50 avec la médiane. Les valeurs médianes de CI50 doivent être calculées dans chaque laboratoire à l’aide des données générées par l’analyse de virus à inhibition normale.

Et exemple des valeurs médianes de la CI50 déterminées au Centre collaborateur de l’OMS pour la grippe à Melbourne pour les types et sous-types respectifs. Pour les virus de la grippe A, les virus à inhibition normale sont ceux dont les valeurs de CI50 sont inférieures à 10 fois par rapport à la CI50 médiane de référence pour leur sous-type respectif. Les virus à inhibition réduite sont ceux dont les valeurs de CI50 sont comprises entre 10 et 100 fois supérieures à la CI50 médiane de référence pour leurs sous-types respectifs.

Alors que les virus à inhibition très réduite ont des valeurs de CI50 de 100 fois supérieures à la CI50 médiane de référence. Pour la grippe B, les virus à inhibition normale ont des valeurs de CI50 inférieures à cinq fois par rapport à la CI50 médiane de référence. Les virus à inhibition réduite sont multipliés par cinq et 50, et les virus HRI ont des valeurs 50 fois supérieures à la CI50 médiane de référence.

Ce tableau présente une liste des substitutions d’acides aminés NA qui ont été détectées au cours des cinq dernières années et qui confèrent une inhibition réduite aux inhibiteurs de la neuraminidase. Le test d’inhibition NA basé sur la fluorescence présenté dans cette vidéo est un test très robuste et reproductible. Après avoir regardé cette vidéo et lu le protocole, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer la sensibilité des virus de la grippe à la classe des inhibiteurs de la neuraminidase.