Expression de protéines recombinantes, cristallisation et études biophysiques d'une

L'objectif général de cette procédure est de préparer une protéine recombinante à partir de bactéries non pathogènes afin de faciliter des études chimiques et biophysiques, telles que la cristallographie aux rayons X des protéines ou la cinétique enzymatique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles concernant la préparation de la protéine recombinante d'intérêt à l'aide de bactéries non pathogènes pour une caractérisation biophysique préliminaire. Le principal avantage de cette technique est que la caractérisation biophysique de la protéine d'intérêt peut être réalisée dans tout laboratoire équipé d'instruments courants, tels que des incubateurs de culture cellulaire et des spectrophotomètres.

Pour commencer cette procédure, préparez la réaction de ligation comme décrit dans le protocole écrit. Pipetez trois microlitres de la réaction de ligation préparée dans un tube contenant 50 microlitres de cellules chimiquement compétentes d’E.coli DH5 alpha. À l’aide d’une pipette, mélangez délicatement la solution.

Refroidir la solution sur glace pendant 30 minutes. Ensuite, effectuer un choc thermique de 45 secondes à 42 degrés Celsius. Après cela, ajouter un millilitre de milieu LB et faire croître les cellules en agitant vigoureusement à 250 tours par minute, à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes.

Étaler 100 microlitres de cellules transformées sur une boîte de gélose LB additionnée de 100 microgrammes par millilitre de kanamycine. Incuber pendant 18 heures à 37 degrés Celsius. À l’aide d’une pointe stérile, prélever des colonies à partir de la boîte.

Faire croître les cellules dans trois millilitres de milieu LB supplémenté avec agitation vigoureuse à 250 tours par minute à 18 degrés Celsius pendant 18 heures. Ensuite, préparer l'ADN plasmidique et confirmer la séquence de nucléotides comme décrit dans le protocole écrit. Après avoir rétransformé la souche E.coli BL21, sélectionner une colonie à l’aide d’un embout stérile et ensemencer 10 millilitres de milieu LB contenant 150 microgrammes par millilitre de kanamycine.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 18 heures avec agitation vigoureuse à 250 tours par minute. Ensuite, transférer les 10 millilitres de culture de nuit dans un litre de milieu LB contenant du kanamycine. Faire croître à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 0,7.

Ensuite, plonger la culture dans de l'eau glacée pendant 15 minutes. Ajouter du IPTG à la culture de manière à obtenir une concentration finale de un millimolaire. Incuber à 18 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures supplémentaires.

Après cela, centrifuger à 5 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Retirer soigneusement le surnageant. Resuspendre les cellules dans 50 microlitres de PBS contenant 10 millimolaire d’imidazole.

Ensuite, lysez les cellules deux fois sur de la glace comme décrit dans le protocole écrit. Effectuez une centrifugation à 25 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pour clarifier le lysat cellulaire. Puis, mélangez trois millilitres de billes de nickel et 47 millilitres de PBS contenant 10 millimolaire d’imidazole dans un tube conique de 50 millilitres.

Faites passer par gravité le tampon excédentaire afin de tasser les billes équilibrées dans une colonne de chromatographie en verre de 2,5 sur 10 centimètres. À l’aide d’une pipette, transférez le surnageant dans la colonne. Incubez à quatre degrés Celsius pendant deux heures sur une roue tournante à 20 tours par minute.

Après cela, laissez s'écouler le surnageant par gravité. Lavez les billes de nickel trois fois en utilisant 100 millilitres de PBS contenant 10 millimolaire d'imidazole pour chaque lavage. Ensuite, appliquez cinq millilitres de PBS contenant 250 millimolaire d'imidazole pour éluer la protéine RBC 1531.

Analyser 15 microlitres de l'élution par électrophorèse SDS-PAGE selon le protocole décrit dans le texte. Prélever les fractions recueillies à l’aide d’une pipette et les introduire dans un tube de dialyse. Placer le tube dans un bécher contenant quatre litres de tampon compatible avec la coupure par la thrombine, à quatre degrés Celsius, pendant toute la nuit.

Le lendemain, utilisez une pipette pour transférer les fractions dans un tube conique de 15 millilitres. Mesurez l'absorbance à 280 nanomètres pour estimer la concentration en protéines, comme indiqué dans le protocole écrit. Ensuite, transférez 50 microlitres de la protéine RBC 1531 dans plusieurs tubes.

Ajouter une quantité différente de thrombine à chaque tube et incuber à 20 degrés Celsius pendant trois heures. Après avoir déterminé la plus faible quantité de thrombine nécessaire, ajouter 10 milligrammes de protéine et 60 unités de thrombine à un tube de 15 millilitres. Incuber à 20 degrés Celsius pendant trois heures.

Ensuite, transférez la protéine digérée par la thrombine dans un tube filtrant centrifuge. Faites centrifuger à 3 000 ×g à quatre degrés Celsius afin de réduire le volume à moins de cinq millilitres. Après cela, appliquez la protéine concentrée sur une colonne de chromatographie d'exclusion par taille préparée.

Collectez 60 fractions d'élution avec 0,5 millilitre par tube. Déposez 15 microlitres de chaque fraction sur un gel SDS-PAGE 15 %, comme décrit dans le protocole du texte. Ensuite, combinez les fractions contenant la protéine RBC 1531.

Pour commencer, transférez les fractions combinées dans un tube de filtration centrifuge. Effectuez une centrifugation à 3 000 × g à quatre degrés Celsius afin de concentrer la protéine à environ 18,5 milligrammes par millilitre. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de chaque solution de criblage de cristallisation dans les puits d'une plaque de cristallisation en goutte suspendue de 96 puits.

Ajouter 0,5 microlitre de la solution protéique concentrée sur un lit assis. Mélanger séparément la solution protéique avec 0,5 microlitre de la solution du puits. Recouvrir la plaque d'un film adhésif transparent.

Incuber à 18 degrés Celsius et laisser diffuser la vapeur. À l’aide d’un microscope optique, examiner les gouttes avec un grossissement de 20 à 40 fois pour surveiller quotidiennement la formation de cristaux pendant deux à trois semaines. Après avoir préparé les substrats de NTP, ajouter chacun dans une plaque de 96 puits.

Ajouter 20 microgrammes de la protéine RBC 1531 dans chaque puits à l’aide d’une pipette pour mélanger. Couvrir la plaque avec son couvercle et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, transférer la plaque dans un bain-marie à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes pour arrêter les réactions catalytiques médiées par RBC 1531.

Ensuite, ajoutez un microlitre d'inorganic pyrophosphatase de S.cerevisiae dans chaque puits. Incubez à 20 degrés Celsius pendant 30 minutes. Puis ajoutez 16 microlitres de solution acide de molybdate dans la plaque de réaction pour développer la couleur.

Après 15 minutes, lire la densité optique à 690 nanomètres. Dans cette étude, le produit protéique du gène B serious BC1531 est caractérisé au niveau moléculaire. Après purification par chromatographie d'affinité au nickel, un essai de digestion par la thrombine est réalisé.

0,3 unité de thrombine est considérée comme la quantité minimale nécessaire pour retirer complètement la marque d'affinité de l'ERY 1531. Après digestion, la protéine dépourvue de marque est purifiée jusqu'à une pureté d'environ 99 % par chromatographie d'exclusion stérique. Ensuite, l'état oligomérique est estimé par chromatographie d'exclusion stérique.

Étant donné que RBC 1531 est élué à environ 84 millilitres, sa masse moléculaire est estimée à 55 kilodaltons. La masse moléculaire calculée du monomère est d'environ 13 kilodaltons. Par conséquent, RBC 1531 s'assemble sous forme de tétramère.

Un criblage de cristallisation est ensuite réalisé en utilisant une méthode de diffusion de vapeur en goutte suspendue. Des cristaux apparaissent après deux jours en présence de citrate de sodium à une molaire et de 20 % de polyéthylène glycol 3 000, ainsi qu’en présence de cacodylate de sodium à 0,1 molaire et de citrate de sodium à une molaire. Après cela, l’activité NTPase est déterminée.

Aucun changement de couleur visible n'est observé après l'ajout de molybdate à la réaction d'hydrolyse médiée par les GR 1531. Toutefois, lorsque la pyrophosphatase est ajoutée, on observe un changement de couleur en bleu foncé. La densité optique à 690 nanomètres et la concentration en NTP sont ensuite analysées à l'aide d'une régression non linéaire.

On détermine que l'enzyme RBC 1531 présente une vitesse maximale de 0,75 et une constante de Michaelis de 10 micromolaire. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de préparer les échantillons protéiques sans délai et de rejeter les fractions contenant des impuretés susceptibles de gêner la cristallisation des protéines ou d'introduire des erreurs dans les dosages enzymatiques. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en enzymologie et dans d'autres domaines des sciences des protéines pour caractériser les protéines d'intérêt à l'aide de spectrophotomètres présents dans la plupart des laboratoires.

Bien que cette méthode puisse fournir des indications sur les concepts généraux de préparation de protéines recombinantes, de criblage de cristallisation et de cinétique enzymatique, elle peut également être appliquée à l'analyse chimique biophysique d'autres protéines qui nous intéressent. N'oubliez pas de faire preuve de prudence lorsque vous manipulez des protéines, car elles peuvent être extrêmement instables. Des précautions telles que le maintien des échantillons sur de la glace et leur réfrigération à 80 degrés pour un stockage à long terme seront souhaitables.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation de protéines recombinantes à partir de bactéries non pathogènes afin d'obtenir des cristaux de protéines pour la détermination de leur structure par cristallographie aux rayons X, ainsi que de la caractérisation de l'activité enzymatique à l'aide d'une méthode colorimétrique.