Expression de protéines recombinantes, cristallisation et études biophysiques d'une Bacillus Pyrophosphorylase nucléotidique conservée, BcMazG

L’objectif global de cette procédure est de préparer des protéines recombinantes à partir de bactéries non pathogènes pour faciliter les études biophysico-chimiques telles que la cristallographie aux rayons X des protéines ou la cinétique enzymatique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon de préparer une protéine recombinante d’intérêt à l’aide de bactéries non pathogènes pour la caractérisation biophysique préliminaire. Le principal avantage de cette technique est que la caractérisation biophysique des protéines d’intérêt peut être effectuée dans n’importe quel laboratoire équipé d’instruments courants tels que des incubateurs de culture cellulaire et des spectrophotomètres.

Pour commencer cette procédure, préparez la réaction de ligature comme indiqué dans le protocole de texte. Pipeter trois microlitres de la réaction de ligature préparée dans un tube contenant 50 microlitres de cellules alpha E.coli DH5 chimiquement compétentes. À l’aide d’une pipette, mélangez délicatement la solution.

Glacez la solution pendant 30 minutes. Ensuite, un choc thermique de 45 secondes à 42 degrés Celsius. Après cela, ajoutez un millilitre de milieu LB et faites croître les cellules en secouant vigoureusement à 250 rotations par minute, à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes.

Étalez 100 microlitres de cellules transformées sur une plaque de tarière LB complétée par 100 microgrammes par millilitre de kanamycine. Incuber pendant 18 heures à 37 degrés Celsius. À l’aide d’une pointe stérile, prélevez les colonies dans la plaque.

Cultivez les cellules dans trois millilitres de milieu LB supplémenté avec des secousses vigoureuses à 250 rotations par minute à 18 degrés Celsius pendant 18 heures. Ensuite, préparez l’ADN plasmatique et confirmez la séquence nucléotidique comme indiqué dans le protocole textuel. Après avoir retransformé la souche E.coli BL21, sélectionnez une colonie à l’aide d’une pointe stérile et inoculez 10 millilitres de milieu LB contenant 150 microgrammes par millilitre de kanamycine.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 18 heures avec des secousses vigoureuses à 250 rotations par minute. Ensuite, transférez les 10 millilitres de culture de nuit dans un litre de milieu LB et kanamycin. Croître à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 0,7.

Ensuite, plongez la culture dans de l’eau glacée pendant 15 minutes. Ajouter l’IPTG à la culture, de sorte que la concentration finale soit d’un millimolaire. Incuber à 18 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures supplémentaires.

Après cela, centrifugez à 5 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez délicatement le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans 50 microlitres de PBS contenant 10 millimolaires d’imidazole.

Ensuite, lysez les cellules deux fois sur de la glace comme détaillé dans le protocole de texte. Centrifuger à 25 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer le lysat cellulaire. Ensuite, mélangez trois millilitres de billes de nickel et 47 millilitres de PBS contenant 10 millimolaires d’imidazole dans un tube conique de 50 millilitres.

Écoulement par gravité du tampon supplémentaire pour déposer les billes équilibrées dans une colonne de chromatographie en verre de 2,5 x 10 centimètres. À l’aide d’une pipette, transférez le surnageant dans la colonne. Incuber à quatre degrés Celsius pendant deux heures sur un rouet à 20 rotations par minute.

Après cela, laissez le surnageant s’écouler par gravité. Lavez les billes de nickel trois fois avec 100 millilitres de PBS contenant 10 millimolaires d’imidazole pour chaque lavage. Ensuite, appliquez cinq millilitres de PBS contenant 250 millimolaires d’imidazole pour éluer la protéine GR 1531.

Analysez 15 microlitres de l’élution via la page SDS comme indiqué dans le protocole texte. Pipeter les fractions collectées dans un tube de dialyse. Placez le tube dans un bécher contenant quatre litres de tampon compatible avec le clivage de la thrombine à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, à l’aide d’une pipette, transférez les fractions dans un tube conique de 15 millilitres. Mesurez l’absorbance à 280 nanomètres pour estimer la concentration en protéines comme indiqué dans le protocole de texte. Ensuite, transférez 50 microlitres de protéine RBC 1531 dans plusieurs tubes.

Ajoutez une quantité différente de thrombine dans chaque tube et incubez à 20 degrés Celsius pendant trois heures. Après avoir déterminé la quantité minimale de thrombine nécessaire, ajoutez 10 milligrammes de protéines et 60 unités de thrombine dans un tube de 15 millilitres. Incuber à 20 degrés Celsius pendant trois heures.

Ensuite, transférez la protéine digérée par la thrombine dans un tube filtrant centrifuge. Centrifuger à 3 000 fois G à quatre degrés Celsius pour réduire le volume à moins de cinq millilitres. Après cela, appliquez la protéine concentrée dans une colonne de chromatographie d’exclusion stérique préparée.

Collectez 60 fractions d’élution avec 0,5 millilitre par tube. Exécutez 15 microlitres de chaque fraction sur un gel de page SDS à 15 %, comme indiqué dans le protocole de texte. Combinez ensuite les fractions contenant la protéine RBC 1531.

Pour commencer, transférez les fractions combinées dans un tube filtrant centrifuge. Centrifuger à 3 000 fois G à quatre degrés Celsius pour concentrer la protéine à environ 18,5 milligrammes par millilitre. Ajoutez ensuite 50 microlitres de chaque solution de criblage de cristallisation dans les puits d’une plaque de cristallisation à 96 puits.

Ajoutez 0,5 microlitre de la solution protéique concentrée sur un lit assis. Mélangez séparément la solution protéique avec 0,5 microlitre de la solution de puits. Recouvrez la plaque d’un film adhésif transparent.

Incuber à 18 degrés Celsius et permettre la diffusion de la vapeur. À l’aide d’un microscope optique, balayez les gouttes à un grossissement de 20 à 40 fois pour surveiller la formation des cristaux quotidiennement pendant deux à trois semaines. Après avoir préparé les substrats NTP, ajoutez-les chacun à une plaque de 96 puits.

Ajoutez 20 microgrammes de protéines RBC 1531 dans chaque puits à l’aide d’une pipette. Couvrez l’assiette avec son couvercle et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après cela, transférez la plaque dans un bain-marie à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes pour arrêter les réactions catalytiques médiées par RBC 1531.

Ensuite, ajoutez un microlitre de pyrophosphatase inorganique S.cerevisiae dans chaque puits. Incuber à 20 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite 16 microlitres de solution d’acide de molybdate dans la plaque de réaction pour développer la couleur.

Après 15 minutes, lisez la densité optique à 690 nanomètres. Dans cette étude, le produit protéique du gène B grave BC1531 est caractérisé au niveau moléculaire. Après purification par chromatographie d’affinité au nickel, une traînée de digestion de la thrombine est effectuée.

0,3 unité de thrombine est considérée comme la quantité la plus faible requise pour supprimer complètement l’étiquette d’affinité de RBC 1531. Après la digestion, la protéine sans marqueur est purifiée à environ 99 % de pureté, à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique. Ensuite, l’état oligomérique est estimé par chromatographie d’exclusion stérique.

Comme le globule rouge 1531 est élué à environ 84 millilitres, sa masse moléculaire est estimée à 55 kilodaltons. Le poids moléculaire calculé du monomère est d’environ 13 kilodaltonnes. Par conséquent, RBC 1531 s’assemble comme un tétramère.

Le criblage de cristallisation est ensuite effectué à l’aide d’une méthode de diffusion de vapeur à goutte assise. Les cristaux sont visibles après deux jours avec une molaire de citrate de sodium et 20 % de polyéthylène glycol 3 000, et avec 0,1 molaire de cacodylate de sodium et une molaire de citrate de sodium. Après cela, l’activité de la NTPase est déterminée.

Aucun changement de couleur visible n’est observé après l’ajout de molybdate à la réaction d’hydrolyse médiée par le RBC 1531. Cependant, lorsque la pyrophosphatase est ajoutée, on voit la couleur passer au bleu profond. La densité optique à 690 nanomètres et la concentration NTP sont ensuite analysées à l’aide d’une régression non linéaire.

On détermine que l’enzyme RBC 1531 a une vitesse maximale de 0,75 et une constante de Michaelis de 10 micromolaires. Lors de cette procédure, il est important de préparer des échantillons de protéines sans délai et d’éliminer les fractions contenant des impuretés qui entravent la cristallisation des protéines ou introduisent des erreurs dans les tests enzymatiques. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’enzymologie et d’autres sciences des protéines pour caractériser les protéines d’intérêt avec des spectrophotomètres décorés dans la plupart des laboratoires.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des idées générales de la préparation des protéines recombinantes, des écrans de cristallisation et de la cinétique enzymatique, elle peut également être appliquée à l’analyse chimique biophysique pour d’autres protéines qui nous intéressent. N’oubliez pas d’être prudent lorsque vous travaillez avec des protéines car elles peuvent être extrêmement instables. Des précautions telles que laisser les échantillons sur la glace et les réfrigérer à 80 degrés pour un stockage à long terme seront souhaitables.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des protéines recombinantes à partir de bactéries non pathogènes pour obtenir des cristaux de protéines pour une détermination de structure par cristallographie aux rayons X et comment caractériser l’activité enzymatique à l’aide d’une méthode colorimétrique.