Création d'un biorepository basé sur une clinique

L’objectif global de ce protocole est de permettre au personnel de soutien clinique d’un cabinet de dermatologie de traiter et de stocker efficacement des échantillons de tumeurs cutanées pour des applications de laboratoire en aval, sans interférer avec les opérations cliniques de routine. Ce protocole a été conçu pour permettre aux assistants médicaux et aux histotechniciens de Mohs de collecter et de stocker des échantillons de tumeurs cutanées pour de futurs projets de recherche biomédicale, dans le cadre de leurs opérations cliniques quotidiennes. Le principal avantage de ce protocole est que les tissus excisés qui sont normalement jetés et détruits sont collectés et conservés pour la recherche, en utilisant des procédures qui ont un impact minimal sur les opérations cliniques de routine.

La variété des échantillons collectés permet d’établir des corrélations entre les biomarqueurs de protéines et d’ARN dans les échantillons de tissus et de plasma avec les données sur les résultats des patients. En principe, ce protocole, une fois légèrement modifié, est applicable à toute pratique chirurgicale qui jette systématiquement des échantillons de patients, collectés au cours du traitement des patients. Stefani Fawks, histotechnicienne de Mohs, et le Dr Mitchell Manway, chercheur dans notre cabinet, feront la démonstration de la procédure.

Pour commencer, utilisez le tissu reçu du chirurgien de Mohs et, à l’aide d’un scalpel, excisez un échantillon de 10 à 50 milligrammes du centre de la face apicale du tissu. À l’aide d’une pince à épiler, transférez le tissu viable dans un tube de 1,5 millilitre étiqueté, prérempli de milieu de culture. Assurez-vous que le tissu est entièrement immergé dans le milieu.

Placez l’échantillon dans un réfrigérateur et conservez-le à quatre degrés Celsius, pendant au plus 24 heures, avant de poursuivre le traitement. Prélevez au moins un fragment de tissu de 10 millimètres cubes du côté apical du tissu excisé, lorsque l’échantillon de tumeur est suffisamment grand, et un tel retrait n’interférera pas avec le traitement de routine de Mohs. Ensuite, placez l’échantillon de tumeur non traité restant sur un support de tissu cryostat.

Incorporez le tissu dans un composé à température de coupe optimale et congelez-le dans le support pour préparer des lames histologiques. À l’aide d’un cryostat, coupez le tissu en sections de sept microns d’épaisseur et superposez jusqu’à trois sections sur une lame. Après la section, fixez le tissu en immergeant les lames dans de l’acétone pendant une à deux secondes.

Ensuite, laissez les lames sécher à l’air libre. En conservant l’échantillon restant dans une chambre de cryostat, faites levier sur le tissu du milieu d’enrobage cryogénique et transférez-le dans un tube cryogénique marqué. Transférez immédiatement le flacon étiqueté dans de l’azote liquide.

Le transfert du tissu dans un flacon cryogénique après le traitement de Mohs doit être effectué dans la chambre du cryostat à moins 20 degrés Celsius. Si elle est effectuée correctement et que le tissu est conservé congelé, cette étape permettra d’extraire avec succès l’ARN d’échantillons de tissus post-Mohs. Ensuite, obtenez du tissu normal adjacent auprès du chirurgien de Mohs.

Exciser un échantillon de la face apicale du tissu normal adjacent. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, transférez l’échantillon excisé dans un tube étiqueté de 1,5 millilitre rempli de milieu de culture. Immergez le tissu dans le même milieu de culture.

Placez-le dans un sac d’échantillonnage approprié et conservez-le à quatre degrés Celsius, jusqu’au traitement ultérieur. Prélever environ 10 millilitres de sang veineux dans des tubes de prélèvement recouverts d’EDTA. Combinez les échantillons de sang dans un tube à centrifuger stérile de 15 millilitres.

Ensuite, transférez environ un millilitre de l’échantillon de sang dans un tube cryogénique de 1,5 millilitre, en évitant les bulles. Conservez cet échantillon de sang entier à moins 80 degrés Celsius, jusqu’au génotypage et à la correspondance tissulaire ultérieurs. Ensuite, centrifugez l’échantillon de sang restant à 1000 fois G pendant 30 minutes pour obtenir du plasma sanguin.

Après l’essorage, prélevez et divisez le plasma jusqu’à ce qu’un millilitre aliquote dans des tubes cryogéniques de 1,5 millilitre. Et stockez les échantillons à moins 80 degrés Celsius pour les utiliser lors de futures analyses de biopsie liquide. Entrez les données de la liste de contrôle des échantillons de patients, ainsi que les informations et le diagnostic du patient, soustraits du dossier du patient dans la base de données de la biobanque.

Enfin, consignez la localisation des échantillons anonymisés dans la base de données de la biobanque et transférez les échantillons au laboratoire de recherche. Immédiatement après, transférez les échantillons de tissus dans des tubes de 1,5 millilitre, préremplis de solutions d’extraction appropriées, en vous assurant que le tissu est complètement immergé. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient traités.

Voici les images de Western blots représentatifs de marqueurs de carcinome épidermoïde connus, de la mucine un, du FHL-one et du p40, obtenues pour le tissu normal adjacent et un échantillon de tumeur. La qualité de l’ARN isolé à partir d’échantillons de Mohs a d’abord été évaluée à l’aide d’une électrophorèse sur gel, suivie d’une analyse de l’intégrité de l’ARN. Les valeurs du nombre d’intégrité de l’ARN obtenues pour les échantillons normaux et tumoraux indiquent qu’un ARN intact et de haute qualité a été obtenu.

Les profils cytométriques des bandes ont été tracés en unités de fluorescence en fonction du nombre de nucléotides pour des échantillons d’ARN représentatifs de la tumeur et des tissus normaux du patient. Un explant de tissu de carcinome épidermoïde a été imagé à l’aide de la microscopie à contraste de phase et s’est avéré être une culture mixte de kératinocytes et de fibroblastes, qui pourrait être sous-cultivée ou utilisée pour le développement futur de lignées cellulaires. Enfin, dans les coupes de tissu du carcinome épidermoïde, une coloration positive pour le marqueur de transition épithéliale à mésenchymateuse a été mise en évidence.

Une fois maîtrisé, ce protocole étendra le flux de travail standard du personnel de la clinique à moins de 30 minutes, s’il est exécuté correctement. La majorité des étapes sont effectuées par le personnel clinique en place une fois les soins aux patients terminés. Lors de la mise en œuvre de ce protocole, il est important de tenir des registres précis, en reliant les échantillons aux antécédents et au diagnostic du patient.

Comme ces informations sont souvent nécessaires pour les applications en aval. Cette technique permettra aux chercheurs du domaine de la dermatologie de développer des biopsies liquides et des biomarqueurs dans les carcinomes épidermoïdes et les mélanomes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la mise en œuvre d’une biobanque clinique pour les échantillons de cancer cutané, générée dans le cadre de la pratique quotidienne.