Préparation et caractérisation de nouvelles nanoparticules imitant HDL pour l'encapsulation du facteur de croissance nerveuse

L'objectif général de cet article est de présenter les méthodes de préparation et de caractérisation de nanoparticules imitant les lipoprotéines de haute densité chargées de facteur de croissance nerveux. Une homogénéisation simple a été utilisée pour préparer des nanoparticules normales imitant les lipoprotéines de haute densité. Le protocole est simple et facilement reproductible à plus grande échelle.

En outre, la nanoparticule a grandement amélioré l'efficacité d'encapsulation, ainsi que la NGF et l'APOA1 dans les nanoparticules. Diverses difficultés liées à la caractérisation d'une nanoparticule ont été surmontées, notamment la séparation de la NGF non encapsulée des nanoparticules de NGF, la réalisation d'études fiables du rayon in vitro, et la biodisponibilité des nanoparticules de NGF. Pour commencer, mélanger 10 microlitres de NGF avec 10 microlitres de protamine USP dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et laisser reposer pendant 10 minutes à température ambiante afin de former le complexe.

Ensuite, ajoutez 59 microlitres de phosphatidylcholine et 11 microlitres de sphingomyéline dans un flacon en verre. Ajoutez également 4 microlitres de phosphatidylsérine, 15 microlitres d'oléate de cholestéryle et 45 microlitres de succinate de tocophéryle polyéthylène glycol. Mélangez et faites évaporer l'éthanol sous un léger courant d'azote pendant environ cinq minutes.

Tous les excipients doivent former un film mince huileux au fond du flacon en verre. Ajouter un millilitre d'eau ultrapure dans le flacon et homogénéiser à 9 500 tr/min pendant cinq minutes à température ambiante pour former les nanoparticules prototypes, ou NP. Ensuite, ajouter le complexe préparé aux NP prototypes.

Incuber la suspension à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes sous agitation, en utilisant un petit barreau d'agitation dans le flacon en verre. Refroidir les nanoparticules en agitant à température ambiante pendant 30 minutes supplémentaires. Après refroidissement, ajouter 106 microlitres d'apolipoprotéine A-1 et agiter à température ambiante toute la nuit pour former les nanoparticules finales de HDL imitant le NGF.

Mesurez la taille des particules et le potentiel zêta à l’aide d’un analyseur de particules, conformément aux instructions du fabricant. Une colonne de chromatographie de filtration sur gel réticulée est utilisée pour séparer le NGF non encapsulé des nanoparticules imitant les HDL contenant le NGF, et déterminer l’efficacité d’encapsulation du NGF. Pour la préparation de la colonne, transférez 15 millilitres de suspension de sépharose 4B CL dans un bécher de 50 millilitres.

Agiter la suspension de billes et en verser une partie dans une colonne. Tapoter doucement la colonne pour éliminer les bulles. Laisser s'écouler le solvant et laisser les billes se tasser pendant quelques minutes.

Continuer d'ajouter la suspension restante. Rincer la paroi interne de la colonne pour nettoyer les billes. Éliminer le solvant jusqu'à ce que le niveau de celui-ci soit légèrement au-dessus du haut de la phase stationnaire.

Ensuite, lavez et équilibrez la colonne avec 20 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate 1X. Pour mesurer l'efficacité d'encapsulation du NGF, appliquez 200 microlitres de NPs mimétiques des HDL chargées en NGF sur la colonne et éluisez avec du PBS 1X. Comme précédemment, réunissez un total de 12 fractions d'un millilitre chacune.

Prétraitez huit tubes de dialyse en suivant les instructions du fabricant. Ajoutez 30 millilitres de milieu de libération dans un tube centrifuge de 50 millilitres. Ensuite, chauffez-le à 37 degrés Celsius dans un agitateur réglé à une vitesse d'agitation de 135 tr/min.

Fermez le tube de dialyse et placez-le dans le milieu de libération. Prélevez rapidement 100 microlitres du milieu de libération à l'extérieur du tube de dialyse comme échantillon pour le temps zéro. Placez immédiatement l'échantillon à moins 20 degrés Celsius pour une analyse ultérieure.

Ajouter 100 microlitres de milieu de relâchement frais dans le tube de centrifugation pour remplacer l'échantillon prélevé. Ensuite, déclencher le chronomètre. Aux moments de 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 et 72 heures, prélever 100 microlitres de milieu de relâchement et les remplacer par 100 microlitres de milieu frais.

Placer immédiatement les échantillons prélevés à moins 20 degrés Celsius pour une analyse ultérieure. Après une homogénéisation de trois minutes, des tailles de particules uniformes ont été obtenues pour les nanoparticules prototypes. Les nanoparticules de NGF finales présentaient une taille de particule de 170 nanomètres avec une distribution étroite et monodispersée.

Les nanoparticules sans NGF et les nanoparticules ont été complètement séparées sur la colonne de filtration sur gel. Les nanoparticules ont été éluées dans les fractions deux à quatre. La mesure par ELISA a indiqué que le NGF libre a été élué de la fraction 7 à la fraction 10.

L'efficacité d'encapsulation calculée du NGF était d'environ 66 %. La libération in vitro des nanoparticules de NGF est présentée ici. En ajoutant du PBS et de l'albumine sérique bovine (BSA) au milieu de libération, le NGF libre a traversé la membrane de dialyse avec un rendement supérieur à 85 %. En revanche, les nanoparticules de NGF ont montré un profil de libération lente, environ 10 % du NGF étant libéré à partir des nanoparticules sur une période de 72 heures. Les nanoparticules de NGF ont stimulé la croissance des neurites dans les cellules PC12 dans une mesure similaire à celle du NGF libre.

Une croissance nette des neurites a été clairement observée au microscope pour les deux groupes traités à raison de 50 nanogrammes par millilitre. Les nanoparticules de NGF ont considérablement augmenté la concentration plasmatique et réduit l'absorption du NGF dans le foie, les reins et la rate des souris. Les nanoparticules imitant les HDL ont assisté le NGF, permettant une demi-vie prolongée lors de la stabilité in vivo.

Une fois maîtrisée, la préparation de nanoparticules monodispersées peut être réalisée en trois minutes à l’aide d’une méthode d’homogénéisation, à condition qu’elle soit correctement effectuée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser un courant doux d’azote pour évaporer le solvant et de s’assurer qu’aucun résidu lipidique ne reste collé sur les parois du récipient après l’homogénéisation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment fabriquer des nanoparticules imitant les HDL à l’aide d’une méthode d’homogénéisation, ainsi que comment caractériser des nanoparticules chargées en NGF.