Isolation Lipid Droplet pour l'analyse quantitative de spectrométrie de masse

L’objectif global de l’isolement des gouttelettes lipidiques pour la spectrométrie de masse quantitative est de comprendre la fonction de ces organites, par exemple, dans la réplication d’agents pathogènes tels que le virus de l’hépatite C. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine des maladies infectieuses, telles que pourquoi les agents pathogènes se lient aux gouttelettes pour se répliquer. L’isolement des gouttelettes lipidiques peut se faire en six à sept heures.

Et pendant cette procédure, il est important d’éviter la contamination de la kératine. Pour commencer, retirez 50 millilitres de chaque bouteille de milieu DMEM et ajoutez 50 millilitres de sérum de veau fœtal dialysé. Ensuite, dissolvez 50 milligrammes de lysine marquée au carbone 13 et 50 milligrammes d’arginine marquée au carbone 13 dans un millilitre de milieu.

Mélangez bien et ajoutez les acides aminés au milieu DMEM plus FCS. Ajoutez ensuite le PenStrep et le substitut de glutamine. Filtrez stérilement le milieu à l’aide d’un filtre de 0,45 micron et étiquetez la bouteille comme étant un milieu SILAC lourd.

Pour préparer le milieu léger, répétez ces étapes en utilisant 50 milligrammes d’arginine et 50 milligrammes de lysine. Étiquetez la bouteille en tant que support SILAC léger. Trypsinisez les cellules et divisez-les en deux puits d’une plaque de culture à six puits.

Un puits doit contenir deux millilitres de milieu SILAC lourd, et l’autre, deux millilitres de milieu SILAC léger. Cultivez les cellules pendant au moins six passages. Après six passages, l’incorporation des acides aminés lourds devrait être supérieure à 95 %Récoltez un million de cellules des populations de cellules marquées lourdes et légères pour analyser l’efficacité de l’incorporation.

Après le lavage des cellules dans 1X PBS, granulez-les par centrifugation pendant cinq minutes à 160 fois g et quatre degrés Celsius. Remettez en suspension les pastilles de cellules dans 150 microlitres de tampon MS. Ensuite, incubez les cellules sur de la glace pendant 30 minutes.

Ensuite, lyser les cellules par sonication à quatre degrés Celsius. Retirez les débris de la cellule par centrifugation pendant 10 minutes à 11 000 fois g et quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant dans un nouveau tube et déterminez la concentration en protéines à l’aide d’un dosage des protéines compatible avec les détergents.

Ensuite, mélangez 75 microgrammes de protéines avec six tampons d’échantillon. Après ébullition à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, séparez les protéines par SDS-PAGE dans un tampon SDS à 180 boulons pendant environ une heure. Après la coloration de Coomassie, exciser la même bande protéique et analyser l’efficacité de l’incorporation par analyse MS.

Infectez la population légère de cellules avec le virus rapporteur de l’hépatite C en les incubant avec des stocks fibreux pendant quatre heures à 37 degrés Celsius. Développez les cellules légères infectées par le VHC et les cellules lourdes non infectées comme décrit dans le protocole textuel. Si vous utilisez une souche du VHC porteuse d’un gène de résistance à la blasticidine, ajoutez 10 microgrammes par millilitre de blasticidine S au milieu léger pour sélectionner les cellules positives pour le VHC.

Un jour avant l’isolement des gouttelettes lipidiques, lavez les cellules avec du PBS, essayez de les faire pivoter et suspendez-les à nouveau dans le milieu léger ou lourd correspondant. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Neubauer. Ensuite, ensemencez sept millions de cellules de chaque population dans une boîte de culture cellulaire de 150 centimètres carrés.

Préparez au moins cinq plats par population cellulaire légère et lourde. Cultivez les cellules dans 30 millilitres de milieu par plat pendant la nuit. Le lendemain, retirez le milieu et lavez les cellules dans 1X PBS.

Détachez les cellules dans 1X PBS à l’aide d’un grattoir de cellules. Après avoir compté les deux populations cellulaires comme précédemment, tirez des nombres de cellules égaux dans des tubes à centrifuger de 50 millilitres. Granulez les cellules par centrifugation pendant cinq minutes à 160 fois g et quatre degrés Celsius.

Retirez le PBS et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de tampon de saccharose. Transférez la suspension cellulaire dans un homogénéisateur d’onces bien ajusté avant de lyser les cellules avec 200 coups sur de la glace. Ensuite, transférez le lysat dans un tube microfuge de 1,5 millilitre et faites tourner les noyaux et les débris cellulaires pendant 10 minutes à 1 000 fois g et quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, stocker une aliquote de 25 microlitres de fraction postnucléaire, ou PNS, à moins 20 degrés Celsius comme contrôle d’entrée. Placez le reste de la fraction PNS au fond du tube à centrifuger et recouvrez d’environ trois millilitres de tampon de lavage des gouttelettes de lipides. Centrifuger pendant deux heures à 100 000 fois g et quatre degrés Celsius.

Après la centrifugation, récoltez la fraction de gouttelettes lipidiques flottantes sur le dessus du tube à l’aide d’une canule émoussée courbée. Ensuite, placez la fraction de gouttelettes lipidiques dans un tube à centrifuger, superposez-la avec un tampon de lavage de gouttelettes lipidiques et répétez l’étape de centrifugation. La récolte des gouttelettes lipidiques au sommet du gradient nécessite de l’expérience.

Et c’est plus facile plus la fraction est grande. Vous pouvez utiliser les cellules graisseuses pour vous entraîner. Ou vous pouvez nourrir vos cellules avec de l’oléate pour augmenter la quantité de gouttelettes de lipides.

Encore une fois, récoltez la fraction de gouttelettes lipidiques flottantes à l’aide d’une canule émoussée courbée située dans le haut du tube. Transférez les gouttelettes lipidiques dans un nouveau tube de microfuge de 1,5 millilitre et ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage des gouttelettes de lipides. Ensuite, faites tourner l’échantillon pendant 20 minutes à 21 000 fois g et quatre degrés Celsius.

Retirez le tampon de lavage sous-jacent à l’aide d’une pointe de pipette de chargement de gel et répétez l’étape de lavage trois fois. Après l’élimination finale du tampon de lavage, mélangez cinq microlitres de fractions de gouttelettes lipidiques avec 10 microlitres de tampon de lyse NP 40 pour déterminer la teneur en protéines. Incuber l’échantillon sur de la glace pendant une heure pour inactiver le virus si vous travaillez avec des matières infectieuses.

À ce stade, les fractions de gouttelettes lipidiques peuvent être stockées à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, mélangez le volume qui correspond à au moins 35 microgrammes de protéines avec un colorant de charge 4x. Incuber le mélange sur de la glace pendant une heure pour inactiver le virus si vous travaillez avec des matières infectieuses.

Faites bouillir l’échantillon à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, effectuez une coloration SDS-PAGE suivie d’une coloration Coomassie pour préparer l’échantillon pour le couple de chromatogrophylie liquide à la spectronomie de masse en tandem, comme décrit dans le protocole textuel. Pour analyser la pureté des gouttelettes lipidiques, diluez des aliquotes de fractions de gouttelettes lipidiques, une à deux, avec un tampon de lyse NP 40.

Diluez les fractions de contrôle d’entrée de un à dix avec le même tampon. Incuber les échantillons sur de la glace pendant une heure pour inactiver le virus si vous travaillez avec des matières infectieuses. Ensuite, déterminez le niveau de protéines à l’aide d’un test de protéines compatible avec les détergents.

Ensuite, mélangez une quantité égale de protéines avec un tampon d’échantillon 6x, et incubez les échantillons sur de la glace pendant une heure pour inactiver le virus si vous travaillez avec des matières infectieuses. Enfin, procédez avec SDS-PAGE et transférez les protéines sur une membrane de nitrocellulose par transfert de réservoir à 80 volts pendant 90 minutes. Voici une analyse par transfert de Western représentative des fractions de gouttelettes postnucléaires et lipidiques.

Le western blot montre clairement un enrichissement que le marqueur des gouttelettes lipidiques protécute la périlipine deux et la périlipine trois dans les fractions de gouttelettes lipidiques, et l’épuisement des marqueurs d’autres compartiments cellulaires. Les fractions post-nucléaires et lipidiques des gouttelettes peuvent être analysées en outre par coloration au bleu et à l’argent de Coomassie. Cette carte thermique illustre le nombre de peptides et le pourcentage de couverture protéique des protéines identifiées dans les fractions de gouttelettes lipidiques des cellules analysées.

La carte thermique finale montre comment l’infection par le VHC modifie l’indemnité journalière de gouttelettes de lipides. Les protéines enrichies associées aux gouttelettes lipidiques sont indiquées en rouge, et les protéines associées aux gouttelettes lipidiques appauvries sont indiquées en bleu. Le principal avantage de cette méthode est que nous mélangeons les cellules avant l’isolement et l’isolement préalable des gouttelettes lipidiques, ce qui nous permet de minimiser les erreurs qui peuvent se produire pendant la lyse cellulaire et pendant les étapes d’isolement.