Isolation Lipid Droplet pour l'analyse quantitative de spectrométrie de masse

L'objectif général de l'isolement des gouttelettes lipidiques pour la spectrométrie de masse quantitative est de comprendre la fonction de ces organites, par exemple lors de la réplication de pathogènes tels que le virus de l'hépatite C. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine des maladies infectieuses, comme la raison pour laquelle les pathogènes s'associent aux gouttelettes pour se répliquer. L'isolement des gouttelettes lipidiques peut être réalisé en six à sept heures.

Et pendant cette procédure, il est important d'éviter la contamination par la kératine. Commencez par prélever 50 millilitres de chaque flacon de milieu DMEM et ajoutez 50 millilitres de sérum de veau fœtal dialysé. Ensuite, dissolvez 50 milligrammes de lysine marquée au carbone 13 et 50 milligrammes d'arginine marquée au carbone 13 dans un millilitre de milieu.

Mélanger soigneusement, puis ajouter les acides aminés au milieu DMEM supplémenté de FCS. Ajouter ensuite le PenStrep et le substitut de glutamine. Filtrer stérilement le milieu à l’aide d’un filtre de 0,45 micron et étiqueter le flacon comme milieu SILAC lourd.

Pour préparer le milieu léger, répétez ces étapes en utilisant 50 milligrammes d'arginine et 50 milligrammes de lysine. Étiquetez le flacon comme milieu SILAC léger. Faites une trypsination des cellules et répartissez-les dans deux puits d'une plaque de culture à six puits.

Un puits doit contenir deux millilitres de milieu SILAC lourd, et l'autre, deux millilitres de milieu SILAC léger. Cultivez les cellules pendant au moins six passages. Après six passages, l'incorporation des acides aminés lourds devrait être supérieure à 95 %. Récoltez un million de cellules provenant des populations cellulaires marquées lourdes et légères afin d'analyser l'efficacité d'incorporation.

Après avoir lavé les cellules dans du PBS 1X, les centrifuger pendant cinq minutes à 160 ×g et à 4 °C. Résuspendre les culots cellulaires dans 150 µL de tampon MS. Ensuite, incuber les cellules sur de la glace pendant 30 minutes.

Ensuite, lyser les cellules par sonication à quatre degrés Celsius. Éliminer les débris cellulaires par centrifugation pendant 10 minutes à 11 000 ×g et à quatre degrés Celsius. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et déterminer la concentration en protéines à l'aide d'un dosage de protéines compatible avec les détergents.

Ensuite, mélanger 75 microgrammes de protéine avec un tampon d'échantillonnage 6 x. Après avoir porté à ébullition à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, séparer les protéines par électrophorèse SDS-PAGE dans un tampon de migration SDS à 180 volts pendant environ une heure. Après coloration au Coomassie, exciser la même bande protéique et analyser l'efficacité d'incorporation par analyse MS.

Infecter la population légère de cellules avec le virus rapporteur de l'hépatite C en les incubant avec des stocks fibreux pendant quatre heures à 37 degrés Celsius. Étendre les cellules légères infectées par le VHC et les cellules lourdes non infectées comme décrit dans le protocole textuel. Si l'on utilise une souche de VHC portant un gène de résistance à la blasticidine, ajouter 10 microgrammes par millilitre de blasticidine S au milieu léger afin de sélectionner les cellules positives au VHC.

Un jour avant l'isolement des gouttelettes lipidiques, laver les cellules avec du PBS, les trypsiner et les resuspendre dans le milieu correspondant, léger ou lourd. Compter les cellules à l'aide d'une chambre de comptage de Neubauer. Ensuite, ensemencer sept millions de cellules de chaque population dans une boîte de culture cellulaire de 150 centimètres carrés.

Préparez au moins cinq boîtes par population cellulaire légère et lourde. Incubez les cellules dans 30 millilitres de milieu par boîte pendant la nuit. Le jour suivant, retirez le milieu et lavez les cellules avec du PBS 1X.

Détacher les cellules dans du PBS 1X à l'aide d'un grattoir à cellules. Après avoir dénombré les deux populations cellulaires comme précédemment, prélever des nombres égaux de cellules dans des tubes de centrifugation de 50 millilitres. Récupérer les cellules sous forme de culot par centrifugation pendant cinq minutes à 160 ×g et à 4 °C.

Éliminer le PBS et resuspendre le culot cellulaire dans un millilitre de tampon au saccharose. Transférer la suspension cellulaire dans un homogénéisateur Ounce à ajustement étroit, puis lyser les cellules par 200 mouvements sur glace. Ensuite, transférer le lysat dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et centrifuger les noyaux et les débris cellulaires pendant 10 minutes à 1 000 ×g et à 4 °C.

Après centrifugation, conserver un aliquot de 25 microlitres de la fraction post-nucléaire, ou PNS, à moins 20 degrés Celsius comme témoin d'entrée. Placer le reste de la fraction PNS au fond du tube de centrifugation, puis recouvrir d'environ trois millilitres de tampon de lavage des gouttelettes lipidiques. Centrifuger pendant deux heures à 100 000 ×g et à 4 degrés Celsius.

Après la centrifugation, récoltez la fraction de gouttelettes lipidiques flottantes au sommet du tube à l’aide d’une canule droite émoussée. Ensuite, placez la fraction de gouttelettes lipidiques dans un tube de centrifugation, recouvrez-la de tampon de lavage des gouttelettes lipidiques, puis répétez l’étape de centrifugation. La récolte des gouttelettes lipidiques à partir du sommet du gradient nécessite de l’expérience.

Et est plus facile lorsque la fraction est plus grande. Vous pouvez utiliser des cellules adipeuses pour vous entraîner. Ou vous pouvez nourrir vos cellules avec de l'oléate afin d'augmenter la quantité de gouttelettes lipidiques.

Une fois de plus, récupérez la fraction de gouttelettes lipidiques flottantes à l’aide d’une canule courbée et contondante depuis le sommet du tube. Transférez les gouttelettes lipidiques dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage des gouttelettes lipidiques. Ensuite, centrifugez l’échantillon pendant 20 minutes à 21 000 ×g et à 4 degrés Celsius.

Éliminer le tampon de lavage sous-jacent à l’aide d’une pipette munie d’une pointe de chargement de gel et répéter l’étape de lavage trois fois. Après le dernier retrait du tampon de lavage, mélanger cinq microlitres de fractions de gouttelettes lipidiques avec 10 microlitres de tampon de lyse NP-40 pour la détermination de la teneur en protéines. Incuber l’échantillon sur de la glace pendant une heure afin d’inactiver le virus si l’on travaille avec des matériaux infectieux.

À ce stade, les fractions de gouttelettes lipidiques peuvent être conservées à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, mélanger le volume correspondant à au moins 35 microgrammes de protéine avec du colorant de charge 4x. Incuber le mélange sur de la glace pendant une heure pour inactiver le virus si l'on travaille avec un matériau infectieux.

Faites bouillir l'échantillon à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, réalisez une électrophorèse SDS-PAGE suivie d'une coloration de Coomassie afin de préparer l'échantillon pour une chromatographie liquide couplée à une spectrométrie de masse en tandem, comme décrit dans le protocole écrit. Pour analyser la pureté des gouttelettes lipidiques, diluez des aliquotes des fractions de gouttelettes lipidiques, une à deux, avec du tampon de lyse NP-40.

Effectuez une dilution du fraction témoin d'entrée d'un à dix dans le même tampon. Incubez les échantillons sur de la glace pendant une heure pour inactiver le virus si vous travaillez avec un matériau infectieux. Ensuite, déterminez le taux de protéines à l'aide d'un dosage de protéines compatible avec les détergents.

Ensuite, mélanger des quantités égales de protéine avec du tampon d'échantillonnage 6x et incuber les échantillons sur de la glace pendant une heure afin d'inactiver le virus si l'on travaille avec des matériaux infectieux. Enfin, réaliser une électrophorèse SDS-PAGE et transférer les protéines sur une membrane de nitrocellulose par transfert en cuve à 80 volts pendant 90 minutes. On observe ici une analyse représentative par immunotransfert (western blot) des fractions post-nucléaires et des gouttelettes lipidiques.

Le western blot montre clairement un enrichissement des protéines marqueuses des gouttelettes lipidiques, perilipine 2 et perilipine 3, dans les fractions de gouttelettes lipidiques, ainsi qu’un appauvrissement des marqueurs des autres compartiments cellulaires. Les fractions post-nucléaires et celles des gouttelettes lipidiques peuvent être analysées supplémentairement par coloration au bleu de Coomassie et par coloration argent. Cette carte thermique illustre le nombre de peptides et le pourcentage de couverture des protéines identifiées dans les fractions de gouttelettes lipidiques des cellules analysées.

La carte thermique finale illustre la manière dont l'infection par le VHC modifie les gouttelettes lipidiques au jour le jour. Les protéines associées aux gouttelettes lipidiques enrichies sont indiquées en rouge, et les protéines associées aux gouttelettes lipidiques appauvries sont indiquées en bleu. Le principal avantage de cette méthode est que nous mélangeons les cellules avant l'isolement et avant l'isolement des gouttelettes lipidiques, ce qui nous permet de minimiser les erreurs pouvant survenir lors de la lyse cellulaire et lors des étapes d'isolement.