Name: Lutilisation dun PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Apprenez le génotypage haut débit des mutants CRISPR/Cas9 par PCR fluorescente et électrophorèse capillaire. Cette méthode flexible et économique permet d'analyser rapidement les knockouts géniques dans diverses lignées cellulaires.

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Les auteurs tiennent à remercier Mme Tan Shi Min, Mme Helen Ong, et le Dr Zhao Yi pour aider avec les expériences d&#39;électrophorèse sur gel capillaire. Ce travail a été soutenu par NMRC / IRG accorder NMRC / 1314/2011 et MOE ACRF Niveau 2 subvention du Fonds MOE2011-T2-1-051.

<ol><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2Fcas9%2C+a+novel+genomic+tool+to+knock+down+microRNA+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo.</a> Sci. Rep. 6, 22312(2016).</li>
<li>O'Connell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+recognition+and+cleavage+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9.</a> Nature. 516, 263-266 (2014).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154, 1380-1389 (2013).</li>
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<li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).</li>
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<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+CRISPR%2FCas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509, 487-491 (2014).</li>
<li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).</li>
<li>Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+cells+with+zinc+finger+nucleases+constructed+via+modular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly.</a> Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).</li>
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<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350, 1096-1101 (2015).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).</li>
<li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).</li>
<li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8, e1002861(2012).</li>
<li>Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genome+editing+and+phenotyping+facilitated+by+high+resolution+melting+curve+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis.</a> PLoS One. 9, 114632(2014).</li>
<li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat. Commun. 5, 3157(2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

Le assommant d&#39;un gène spécifique dans une lignée cellulaire modèle de choix est devenu habituel pour élucider le rôle que le gène joue dans ce contexte cellulaire particulier. En fait, plusieurs écrans à l&#39; échelle du génome sont actuellement disponibles qui utilisent le système de CRISPR / cas9 pour cibler des gènes humains pratiquement tous connus dans le génome 14, 15, 16. Avec ces écrans à grande échelle (ou même à...

approches de génétique inverse ont permis aux scientifiques d&#39;élucider les effets des altérations spécifiques dans le génome de la cellule ou organisme entier. Par exemple, l&#39;expression d&#39;un gène particulier peut être atténué par le gène knock - down 1, 2 (réduction partielle) ou knock - out de gène 3, 4 (ablation complète) afin de déterminer l&#39;effet que cela a sur la fonction de la cellule ou sur la développement de l&#39;organisme. expériences de knock-out de gène sont devenues plus faciles depuis l&#39;introduction des nucleases spécifiques de séquences programmables, tels que des nucléases doigt de zinc (ZFN) et la transcription des nucléases effectrices de type activateur (TALENS). Cependant, la caractérisation relativement récente du CLUSTERED régulièrement entrecoupés de courte répétition palindromique (CRISPR) / système cas9 a rendu extrêmement facile pour tout laboratoire dans le monde entier pour effectuer genexpériences e knock-out. En substance, le CRISPR / système cas9 se compose de deux composants essentiels d&#39;un ARN de guidage unique (ARN sg), qui reconnaît et se lie par l&#39;intermédiaire d&#39;une complémentarité de base à une séquence spécifique dans le génome, et une endonucléase appelé cas9. Le lendemain de la liaison spécifique et de l&#39;action du complexe ARN sg-cas9 sur l&#39;ADN génomique est le clivage double brin de l&#39;ADN. Ceci, à son tour, déclenche le mécanisme de réponse aux dommages de l&#39;ADN dans la cellule, qui est ensuite réparé par l&#39;intermédiaire des voies d&#39;extrémité d&#39;assemblage non homologues (NHEJ) ou la recombinaison homologue (RH). Le mécanisme de réparation NHEJ (mais pas le mécanisme des ressources humaines) se traduit souvent par l&#39;insertion aléatoire ou la suppression des nucléotides sur le site de réparation, ce qui entraîne des mutations d&#39;insertion / délétion (indels), il peut provoquer le cadre de lecture d&#39;un exon à passer. Cela peut alors entraîner le knock - out du gène en raison de la fin prématurée de la traduction et la carie médiation non - sens 5, 6,7. En dépit de la mise en pratique offerte par l&#39;introduction du CRISPR / système cas9 en assommant un gène, le génotypage des clones de cellules cibles reste un goulot d&#39; étranglement, en particulier dans un haut débit 8, 9. Les techniques existantes, soit souffrent de graves limitations inhérentes ou sont financièrement coûteuses. Par exemple, le géomètre ou un dosage T7E1, qui est un essai enzymatique qui détecte des mésappariements de l&#39;ADN duplex 10, ne sont pas en mesure de distinguer entre les clones de type sauvage et des mutants homozygotes (clones dont les allèles sont mutés de manière identique), étant donné que ces clones ont des alleles identiques et donc ne présentent pas de mésappariements dans leur séquence d&#39;ADN 11. De plus, l&#39;utilisation du séquençage Sanger, qui est considéré comme l&#39;étalon-or dans le génotypage des clones mutants, dans une configuration à haut débit est indésirable en raison de son coût élevé. Nous présentons ici un detailed protocole de la technique d&#39;électrophorèse sur gel capillaire PCR-fluorescent, qui peut contourner les limitations des autres techniques de génotypage existantes et est particulièrement utile pour effectuer un criblage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Cette méthode est techniquement simple à réaliser et de gagner du temps et de coût.

<table><tbody><tr><td>Cellules HEPG2</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9(BB)-2A-GFP Plasmide</td><td>Addgene</td><td>PX458</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>11668027</tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,5 %), sans rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Water, Biologie moléculaire Grade</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30538,02</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucléotide d’insertion d’ARNsg CRISPR (sens)</td><td>AITbiotech</td><td>Aucun</td><td>Séquence : 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'Oligonucléotide</td></tr> <tr><td>d’insertion d’ARNsg CRISPR (anti-sens)</td><td>AITbiotech</td><td>Aucun</td><td>Séquence : 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'Amorce directe d’amplification</td></tr> <tr><td>PCR non marquée</td><td>AITbiotech</td><td>Aucun</td><td>Séquence : 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' ; cette amorce est également utilisée pour séquencer les allèles amplifiés par PCR</td></tr><tr><td>6-FAM Amorce directe PCR fluorescente marquée</td><td>AITbiotech</td><td>Aucun</td><td>Séquence : 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'HEX-labellisée</td></tr> <tr><td>PCR fluorescente amorce directe</td><td>AITbiotech</td><td>Aucun</td><td>Séquence : 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'Amorce</td></tr> <tr><td>inverse PCR non étiquetée</td><td>AITbiotech</td><td>Aucun</td><td>Séquence : 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'Taq</td></tr> <tr><td>PCR Core Kit</td><td>QIAGEN</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di Formamide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>GeneScan 500 LIZ Taille de colorant Standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4322682</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3500xL Genetic Analyseur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4405633</td><td></td></tr><tr><td>3500 Series 2 Programme</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4476988</td><td></td></tr><tr><td>Gene Mapper 5 Programme</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475073</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Cell Kit</td><td>QIAGEN</td><td>1045696</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel et PCR Système de nettoyage</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>NAP1L1 Anticorps ( N-term)</td><td>Abgent</td><td>AP1920b</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Matrix Protein p84 anticorps [5E10]</td><td>GeneTex</td><td>GTX70220</td><td></td></tr><tr><td>Peroxydase AffiniPure Chèvre Anti-Lapin IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>Peroxydase AffiniPure Mouton Anti-Souris</td><td>IgG Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation d&#39;un pcr-capillaire fluorescent gel electrophoresis technique pour génotype crispr / cas9 médiation knockout mutants dans un format à haut débit

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Le développement d&#39;outils d&#39;édition programmables génome a facilité l&#39;utilisation de la génétique inverse pour comprendre les rôles des séquences génomiques spécifiques jouent dans le fonctionnement des cellules et des organismes entiers. Cette cause a été aidé énormément par l&#39;introduction récente du système un CRISPR / cas9 outil polyvalent qui permet aux chercheurs de manipuler le génome et du transcriptome afin, entre autres, assomment, abattre ou frapper dans les gènes dans une cible manière. Dans le but de frapper sur un gène, CRISPR / cas9 médiée cassures double brin recrutent la voie de réparation de l&#39;ADN d&#39;assemblage terminal non homologue pour introduire l&#39;insertion du cadre de lecture à l&#39;origine ou la suppression de nucleotides au niveau du site de coupure. Cependant, un ARN de guidage individuel peut entraîner des effets indésirables hors cible, et pour écarter ces derniers dehors, l&#39;utilisation des ARN guides multiples est nécessaire. Cette multiplicité des cibles signifie également qu&#39;un criblage à haut volume de clones est nécessaire, ce qui soulève l&#39;utilisation d&#39;un efFicient technique à haut débit pour le génotype des clones knock-out. techniques de génotypage actuelles soit souffrent de limitations inhérentes ou entraînent des coûts élevés, les rendant donc impropre à des fins à haut débit. Ici, nous détaillons le protocole pour l&#39;utilisation de la PCR fluorescente qui utilise l&#39;ADN génomique à partir d&#39;un lysat cellulaire brut sous forme d&#39;un gabarit, puis la résolution des fragments de PCR par électrophorèse sur gel capillaire. Cette technique est suffisamment précis pour différencier une différence de paire de bases entre les fragments et est donc suffisante pour indiquer la présence ou l&#39;absence d&#39;un cadre de lecture dans la séquence codante du gène ciblé. Cette connaissance précise empêche effectivement la nécessité d&#39;une étape de séquençage de confirmation et permet aux utilisateurs de gagner du temps et des coûts dans le processus. De plus, cette technique est avérée être polyvalent dans génotypage diverses cellules de mammifères de diverses origines de tissus ciblés par les ARN de guidage contre de nombreux gènes, comme le montre ici et ailleurs.

La technique d&#39;électrophorèse sur gel capillaire PCR fluorescent décrit ici est prévu pour être applicable à une région pouvant être ciblé dans le génome de pratiquement toutes les lignées cellulaires qui se prête à la livraison d&#39;ADN étranger. Nous avons déjà démontré son application en ciblant trois gènes dans une lignée cellulaire de cancer colorectal 12. Ici, nous montrons son efficacité dans génotypage d&#39;une lignée de cellules de carcinome hépatoc...

La technique de génotypage décrit ici, qui couple de réaction en chaîne par polymérase fluorescente (PCR) à une électrophorèse sur gel capillaire, permet de génotypage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Il évite les limitations rencontrées par d&#39;autres techniques de génotypage et est plus rentable que les méthodes de séquençage.

L&#39;utilisation d&#39;un PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

L'objectif général de cette technique est de génotyper de manière haut débit des clones mutants présentant des insertions ou des délétions induites par CRISPR/Cas9. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génétique, telles que l'effet phénotypique de l'invalidation d'un gène particulier dans un modèle SAIL choisi. Le principal avantage de cette technique réside dans son criblage pouvant aller du faible au haut débit, qui est multiflexible.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la génétique du cancer humain, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les cellules humaines, souches ou primaires, ou les cellules d'origine non humaine. Nous avons eu l'idée de cette méthode lors de la réalisation de tests de typage par répétitions tandem courtes ou STR. Pour commencer la procédure, transfectez les cellules choisies avec un plasmide, coexprimant une étiquette fluorescente cas9 et l'ARN guide simple.Trypsiniser les cellules et sélectionner environ 3 500 clones marqués de façon fluorescente. Ensemencer les clones par portions de 500, 1 000 et 2 000 cellules dans des boîtes de 10 centimètres contenant huit millilitres de milieu de croissance supplémenté en pénicilline-streptomycine. Incuber les cellules dans une atmosphère à 5 % CO₂ à 37 degrés Celsius, en renouvelant le milieu tous les cinq jours jusqu’à ce que des colonies monocellulaires soient visibles à l’œil nu.Ensuite, aspirez individuellement les colonies dans une pipette de 200 microlitres avec environ cinq microlitres de milieu de croissance. Transférez chaque colonie dans un puits distinct contenant 200 microlitres de milieu de croissance. Pipetez répétitivement chaque mélange de haut en bas pour resuspendre les cellules.Incuber les cellules dans les conditions précédemment décrites jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 50 à 90 %. Retirer le milieu de culture en excès des puits et ajouter 25 microlitres de trypsine-EDTA 0,05 % sans rouge de phénol dans chaque puit. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 7 minutes.Ensuite, aspirer et rejeter répétitivement les mélanges afin de resuspendre les cellules traitées à la trypsine. Examiner les puits au microscope pour vérifier que les cellules se sont détachées des parois des puits. Pour préparer des répliques des clones individuels, transférer cinq microlitres de chaque suspension cellulaire dans une plaque de culture 96 puits vide.Ajouter 200 microlitres de milieu de croissance dans chaque puits. Ensuite, charger les puits d'une plaque PCR 96 puits vide avec 10 microlitres de tampon de lyse. Transférer cinq microlitres supplémentaires de chaque suspension cellulaire dans cette plaque 96 puits.Centrifuger brièvement la plaque jusqu'à ce que le liquide se dépose au fond des puits. Ajouter 200 microlitres de milieu de croissance aux 15 microlitres restants de chaque suspension cellulaire. Conserver la suspension d'origine et les répliques dans les conditions d'incubation pour une vérification ultérieure du statut de knockout des clones.Ensuite, utiliser un cyclage thermique pour lyser complètement les cellules dans le tampon de lyse. Faire une courte centrifugation des lysats. Diluer les lysats avec 40 microlitres d'eau sans nucléase.Vortexer et centrifuger brièvement les lysats dilués. Avant d'effectuer la PCR fluorescente, concevoir et tester la spécificité de plusieurs paires d'amorces non marquées sur des cellules sauvages lysées. Identifier la paire d'amorces optimale et obtenir les amorces sens marquées au fluorophore ainsi que l'amorce antisens non marquée.Veillez à tester la spécificité des amorces en utilisant des cellules vortexées, puis lysées avec le tampon de lyse maison, car les résultats peuvent varier par rapport à l'utilisation d'ADN génomique purifié. À l'aide des amorces marquées, réalisez des réactions de PCR fluorescente de 20 microlitres en utilisant trois microlitres des lysats dilués afin d'amplifier les régions cibles. Évaluez la taille et les quantités relatives des amplicons PCR en séparant cinq microlitres des amplicons sur un gel d'agarose à 1 %.Pour commencer la préparation de l'échantillon, utilisez de l'eau sans nucléase pour diluer les amplicons d'ADN de type sauvage et ciblé par CRISPR/Cas9 jusqu'à une concentration approximative de 2,5 nanogrammes par microlitre. Mélangez des volumes égaux des échantillons d'ADN de type sauvage et ciblé dilués. Remplissez les puits d'une plaque PCR à 96 puits avec neuf microlitres d'un mélange de formamide désionisé et d'un étalon de taille marqué par colorant dans un rapport de 29 à 1, ainsi qu'un microlitre du mélange d'amplicons.Fermez hermétiquement la plaque et chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant trois minutes à l’aide d’un thermocycleur PCR. Refroidissez immédiatement la plaque sur de la glace pendant trois minutes. Réalisez une électrophorèse capillaire sur gel à l’aide d’un analyseur génétique.Une fois l'électrophorèse terminée, importez les données dans un logiciel d'analyse et tracez les données. Vérifiez la qualité de l'étalon de taille en examinant les données dans le canal de colorant approprié. Ensuite, exportez les valeurs du canal de colorant pour les contrôles sauvages non ciblés et les clones ciblés au format txt.À partir de ce fichier, importer les identités des colorants, les noms des fichiers d'échantillons, les tailles des fragments et les valeurs de hauteur des pics dans un logiciel de tableur. Calculer la différence de taille des fragments entre le clone ciblé et le témoin de type sauvage non ciblé pour chaque échantillon. Identifier les clones portant des mutations d'insertion-suppression qui ne sont pas des multiples de trois paires de bases.Étendez sérialement les clones sélectionnés à partir des répliques conservées. Effectuez un séquençage de Sanger et une analyse western blot pour déterminer les génotypes des clones et confirmer l'état de knockout des clones. La lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire HEPG2 a été ciblée à l'aide d'une construction CRISPR/Cas9 dirigée contre le gène Nap1L1.Les allèles sauvages non ciblés et les allèles ciblés par CRISPR/Cas9 ont été amplifiés par PCR à l'aide d'amorces marquées respectivement par des fluorophores verts et bleus. En utilisant un protocole de PCR fluorescent spécifiquement optimisé, les amplicons des clones ciblés ont été obtenus avec un bon rendement. Aucune interférence n'a été observée entre les colorants fluorescents vert et bleu au sein des échantillons de clones individuels.L’analyse des tailles des fragments, déterminées par électrophorèse capillaire sur gel, a révélé une délétion d’une paire de bases et de dix paires de bases respectivement dans les deux clones présentés ici. Les résultats du séquençage de Sanger étaient cohérents avec l’analyse par électrophorèse capillaire sur gel. L’analyse sanguine a confirmé que les clones sélectionnés n’exprimaient pas NAP1L1.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien étiqueter vos échantillons, car un grand nombre d'échantillons sont impliqués, et également de minimiser le temps d'exposition de l'amplicon marqué avec le fluorophore, car ceux-ci sont sensibles à la lumière. Après cette procédure, d'autres méthodes comme la RT-PCR quantitative, l'analyse western du sang et le séquençage de Sanger peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : quels sont les gènes d'intérêt ? Sont-ils complètement inactivés ? Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de génotyper de manière haut débit des clones mutés induits par CRISPR/Cas9 en utilisant une PCR fluorescente couplée à une électrophorèse sur gel capillaire.

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Les progrès récents dans la capacité de manipuler génétiquement les lignées cellulaires somatiques offrent un grand potentiel pour la recherche fondamentale et appliquée. Ici, nous présentons deux approches pour la production et le dépistage de knock-out créés par CRISPR / Cas9 dans des lignées cellulaires de mammifères, avec et sans utilisation de marqueurs sélectionnables.

Génération indépendante et dépendante de la sélection de CRISPR / Cas9-Meded Knockouts dans les cellules de mammifères

Édition de génome ciblé dans le système de modèle Danio rerio (poisson-zèbre) a été grandement facilitée par l’émergence des approches axées sur les CRISPR. Ici, nous décrivons un protocole simplifié et robuste pour la génération et l’identification d’allèles de dérivés CRISPR non-sens qui intègre l’analyse de mobilité hétéroduplex et l’identification des mutations à l’aide de séquençage de prochaine génération.

Une Production efficace et généré par l’Identification de CRISPR/Cas9 les débouchures de gène dans le modèle système Danio rerio

Un protocole pour rapide CRISPR/Cas9-mediated disruption de génique chez la souris et des cellules hématopoïétiques humaines primaires est décrit dans cet article. Ribonucléoprotéines Cas9-sgRNA sont introduits par électroporation avec sgRNAs des vicitimes in vitro de transcription et commerciale Cas9. Édition de hautes efficacités sont réalisées avec peu de temps et de coût financier.

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Nous présentons ici une méthode pour l’ingénieur le génome de c. elegans en utilisant CRISPR-Cas9 ribonucléoprotéines et modèles de réparation dépendant d’homologie.

Un rapide et Facile de Pipeline pour générer des Mutants de Point génomique dans c. elegans en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines

La technologie CRISPR-Cas9 fournit une méthode efficace pour modifier précisément le génome des mammifères dans n'importe quel type de cellule et représente un nouveau moyen d'effectuer des écrans génétiques à l'échelle du génome. Un protocole détaillé discutant des étapes requises pour la réussite des écrans CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome sont fournis ici.

Écrans génétiques crispR-basés en commun dans les cellules de mammifères

La livraison directe des complexes préassemblés de ribonucleoprotein d'ARN de Cas9/guide est un moyen rapide et efficace pour l'édition de génome dans les cellules hématopoïétiques. Ici, nous utilisons cette approche pour supprimer un silencieux intronique RUNX1 et examiner les réponses transcriptionnelles dans les cellules leucémiques OCI-AML3.

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer par CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Ce manuscrit décrit une approche de dépistage à l’échelle du génome basée sur les cellules pour identifier les interactions extracellulaires de récepteur-ligand.

Identification des récepteurs de surface cellulaire à l’aide d’écrans génétiques CRISPR/Cas9 à l’échelle du génome

Ce protocole décrit un flux de travail d’édition de gènes CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats) à haut débit pour l’analyse de réseaux de microARN qui permet la génération rapide d’un panel de lignées cellulaires génétiquement modifiées portant des combinaisons uniques de délétion de membres de clusters de miARN allant jusqu’à 35 kb dans une seule expérience.

Outil d’édition de gènes CRISPR pour l’analyse de réseaux de microARN

Les technologies CRISPR-Cas ont révolutionné le domaine de l’édition du génome. Cependant, trouver et isoler la modification souhaitée de la lignée germinale reste un goulot d’étranglement majeur. Par conséquent, ce protocole décrit une méthode robuste pour dépister rapidement les spermatozoïdes de poisson-zèbre injectés par F0 CRISPR pour les modifications de la lignée germinale en utilisant des techniques standard de PCR, de digestion de restriction et d’électrophorèse sur gel.

Dépistage des spermatozoïdes pour l’isolement rapide des modifications de la lignée germinale chez le poisson zèbre

Ici, nous décrivons un protocole de génération de mutant maternel qui couple une ligne d’entraînement stable zpc :cas9 avec l’administration médiée par Tol2 de cassettes d’expression d’ARNsg.

Génération de mutants maternels à l’aide du poisson-zèbre knock-in zpc :cas9

Apprenez le génotypage haut débit des mutants CRISPR/Cas9 par PCR fluorescente et électrophorèse capillaire. Cette méthode flexible et économique permet d'analyser rapidement les knockouts géniques dans diverses lignées cellulaires.

Lutilisation dun PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit (Vidéo) | JoVE Journal

L'utilisation d'un PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit

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