Name: Lutilisation dun PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Apprenez le génotypage haut débit des mutants CRISPR/Cas9 par PCR fluorescente et électrophorèse capillaire. Cette méthode flexible et économique permet d'analyser rapidement les knockouts géniques dans diverses lignées cellulaires.

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Les auteurs tiennent à remercier Mme Tan Shi Min, Mme Helen Ong, et le Dr Zhao Yi pour aider avec les expériences d&#39;électrophorèse sur gel capillaire. Ce travail a été soutenu par NMRC / IRG accorder NMRC / 1314/2011 et MOE ACRF Niveau 2 subvention du Fonds MOE2011-T2-1-051.

<ol><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2Fcas9%2C+a+novel+genomic+tool+to+knock+down+microRNA+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo.</a> Sci. Rep. 6, 22312(2016).</li>
<li>O'Connell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+recognition+and+cleavage+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9.</a> Nature. 516, 263-266 (2014).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154, 1380-1389 (2013).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24157548">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Perez, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+HIV-1+resistance+in+CD4%2B+T+cells+by+genome+editing+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).</li>
<li>Santiago, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li>
<li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343, 84-87 (2014).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+CRISPR%2FCas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509, 487-491 (2014).</li>
<li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).</li>
<li>Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+cells+with+zinc+finger+nucleases+constructed+via+modular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly.</a> Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).</li>
<li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genotyping+of+CRISPR%2FCas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci. Rep. 5, 15587(2015).</li>
<li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Responses+of+Stem+Cells+to+Telomere+Uncapping-A+Potential+Strategy+to+Improve+the+Safety+of+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy.</a> Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350, 1096-1101 (2015).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).</li>
<li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).</li>
<li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8, e1002861(2012).</li>
<li>Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genome+editing+and+phenotyping+facilitated+by+high+resolution+melting+curve+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis.</a> PLoS One. 9, 114632(2014).</li>
<li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat. Commun. 5, 3157(2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

Le assommant d&#39;un gène spécifique dans une lignée cellulaire modèle de choix est devenu habituel pour élucider le rôle que le gène joue dans ce contexte cellulaire particulier. En fait, plusieurs écrans à l&#39; échelle du génome sont actuellement disponibles qui utilisent le système de CRISPR / cas9 pour cibler des gènes humains pratiquement tous connus dans le génome 14, 15, 16. Avec ces écrans à grande échelle (ou même à...

approches de génétique inverse ont permis aux scientifiques d&#39;élucider les effets des altérations spécifiques dans le génome de la cellule ou organisme entier. Par exemple, l&#39;expression d&#39;un gène particulier peut être atténué par le gène knock - down 1, 2 (réduction partielle) ou knock - out de gène 3, 4 (ablation complète) afin de déterminer l&#39;effet que cela a sur la fonction de la cellule ou sur la développement de l&#39;organisme. expériences de knock-out de gène sont devenues plus faciles depuis l&#39;introduction des nucleases spécifiques de séquences programmables, tels que des nucléases doigt de zinc (ZFN) et la transcription des nucléases effectrices de type activateur (TALENS). Cependant, la caractérisation relativement récente du CLUSTERED régulièrement entrecoupés de courte répétition palindromique (CRISPR) / système cas9 a rendu extrêmement facile pour tout laboratoire dans le monde entier pour effectuer genexpériences e knock-out. En substance, le CRISPR / système cas9 se compose de deux composants essentiels d&#39;un ARN de guidage unique (ARN sg), qui reconnaît et se lie par l&#39;intermédiaire d&#39;une complémentarité de base à une séquence spécifique dans le génome, et une endonucléase appelé cas9. Le lendemain de la liaison spécifique et de l&#39;action du complexe ARN sg-cas9 sur l&#39;ADN génomique est le clivage double brin de l&#39;ADN. Ceci, à son tour, déclenche le mécanisme de réponse aux dommages de l&#39;ADN dans la cellule, qui est ensuite réparé par l&#39;intermédiaire des voies d&#39;extrémité d&#39;assemblage non homologues (NHEJ) ou la recombinaison homologue (RH). Le mécanisme de réparation NHEJ (mais pas le mécanisme des ressources humaines) se traduit souvent par l&#39;insertion aléatoire ou la suppression des nucléotides sur le site de réparation, ce qui entraîne des mutations d&#39;insertion / délétion (indels), il peut provoquer le cadre de lecture d&#39;un exon à passer. Cela peut alors entraîner le knock - out du gène en raison de la fin prématurée de la traduction et la carie médiation non - sens 5, 6,7. En dépit de la mise en pratique offerte par l&#39;introduction du CRISPR / système cas9 en assommant un gène, le génotypage des clones de cellules cibles reste un goulot d&#39; étranglement, en particulier dans un haut débit 8, 9. Les techniques existantes, soit souffrent de graves limitations inhérentes ou sont financièrement coûteuses. Par exemple, le géomètre ou un dosage T7E1, qui est un essai enzymatique qui détecte des mésappariements de l&#39;ADN duplex 10, ne sont pas en mesure de distinguer entre les clones de type sauvage et des mutants homozygotes (clones dont les allèles sont mutés de manière identique), étant donné que ces clones ont des alleles identiques et donc ne présentent pas de mésappariements dans leur séquence d&#39;ADN 11. De plus, l&#39;utilisation du séquençage Sanger, qui est considéré comme l&#39;étalon-or dans le génotypage des clones mutants, dans une configuration à haut débit est indésirable en raison de son coût élevé. Nous présentons ici un detailed protocole de la technique d&#39;électrophorèse sur gel capillaire PCR-fluorescent, qui peut contourner les limitations des autres techniques de génotypage existantes et est particulièrement utile pour effectuer un criblage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Cette méthode est techniquement simple à réaliser et de gagner du temps et de coût.

<table><tbody><tr><td>Cellules HEPG2</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9(BB)-2A-GFP Plasmide</td><td>Addgene</td><td>PX458</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>11668027</tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,5 %), sans rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Water, Biologie moléculaire Grade</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30538,02</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucléotide d’insertion d’ARNsg CRISPR (sens)</td><td>AITbiotech</td><td>Aucun</td><td>Séquence : 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'Oligonucléotide</td></tr> <tr><td>d’insertion d’ARNsg CRISPR (anti-sens)</td><td>AITbiotech</td><td>Aucun</td><td>Séquence : 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'Amorce directe d’amplification</td></tr> <tr><td>PCR non marquée</td><td>AITbiotech</td><td>Aucun</td><td>Séquence : 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' ; cette amorce est également utilisée pour séquencer les allèles amplifiés par PCR</td></tr><tr><td>6-FAM Amorce directe PCR fluorescente marquée</td><td>AITbiotech</td><td>Aucun</td><td>Séquence : 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'HEX-labellisée</td></tr> <tr><td>PCR fluorescente amorce directe</td><td>AITbiotech</td><td>Aucun</td><td>Séquence : 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'Amorce</td></tr> <tr><td>inverse PCR non étiquetée</td><td>AITbiotech</td><td>Aucun</td><td>Séquence : 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'Taq</td></tr> <tr><td>PCR Core Kit</td><td>QIAGEN</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di Formamide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>GeneScan 500 LIZ Taille de colorant Standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4322682</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3500xL Genetic Analyseur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4405633</td><td></td></tr><tr><td>3500 Series 2 Programme</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4476988</td><td></td></tr><tr><td>Gene Mapper 5 Programme</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475073</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Cell Kit</td><td>QIAGEN</td><td>1045696</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel et PCR Système de nettoyage</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>NAP1L1 Anticorps ( N-term)</td><td>Abgent</td><td>AP1920b</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Matrix Protein p84 anticorps [5E10]</td><td>GeneTex</td><td>GTX70220</td><td></td></tr><tr><td>Peroxydase AffiniPure Chèvre Anti-Lapin IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>Peroxydase AffiniPure Mouton Anti-Souris</td><td>IgG Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation d&#39;un pcr-capillaire fluorescent gel electrophoresis technique pour génotype crispr / cas9 médiation knockout mutants dans un format à haut débit

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Le développement d&#39;outils d&#39;édition programmables génome a facilité l&#39;utilisation de la génétique inverse pour comprendre les rôles des séquences génomiques spécifiques jouent dans le fonctionnement des cellules et des organismes entiers. Cette cause a été aidé énormément par l&#39;introduction récente du système un CRISPR / cas9 outil polyvalent qui permet aux chercheurs de manipuler le génome et du transcriptome afin, entre autres, assomment, abattre ou frapper dans les gènes dans une cible manière. Dans le but de frapper sur un gène, CRISPR / cas9 médiée cassures double brin recrutent la voie de réparation de l&#39;ADN d&#39;assemblage terminal non homologue pour introduire l&#39;insertion du cadre de lecture à l&#39;origine ou la suppression de nucleotides au niveau du site de coupure. Cependant, un ARN de guidage individuel peut entraîner des effets indésirables hors cible, et pour écarter ces derniers dehors, l&#39;utilisation des ARN guides multiples est nécessaire. Cette multiplicité des cibles signifie également qu&#39;un criblage à haut volume de clones est nécessaire, ce qui soulève l&#39;utilisation d&#39;un efFicient technique à haut débit pour le génotype des clones knock-out. techniques de génotypage actuelles soit souffrent de limitations inhérentes ou entraînent des coûts élevés, les rendant donc impropre à des fins à haut débit. Ici, nous détaillons le protocole pour l&#39;utilisation de la PCR fluorescente qui utilise l&#39;ADN génomique à partir d&#39;un lysat cellulaire brut sous forme d&#39;un gabarit, puis la résolution des fragments de PCR par électrophorèse sur gel capillaire. Cette technique est suffisamment précis pour différencier une différence de paire de bases entre les fragments et est donc suffisante pour indiquer la présence ou l&#39;absence d&#39;un cadre de lecture dans la séquence codante du gène ciblé. Cette connaissance précise empêche effectivement la nécessité d&#39;une étape de séquençage de confirmation et permet aux utilisateurs de gagner du temps et des coûts dans le processus. De plus, cette technique est avérée être polyvalent dans génotypage diverses cellules de mammifères de diverses origines de tissus ciblés par les ARN de guidage contre de nombreux gènes, comme le montre ici et ailleurs.

La technique d&#39;électrophorèse sur gel capillaire PCR fluorescent décrit ici est prévu pour être applicable à une région pouvant être ciblé dans le génome de pratiquement toutes les lignées cellulaires qui se prête à la livraison d&#39;ADN étranger. Nous avons déjà démontré son application en ciblant trois gènes dans une lignée cellulaire de cancer colorectal 12. Ici, nous montrons son efficacité dans génotypage d&#39;une lignée de cellules de carcinome hépatoc...

La technique de génotypage décrit ici, qui couple de réaction en chaîne par polymérase fluorescente (PCR) à une électrophorèse sur gel capillaire, permet de génotypage à haut débit des clones knock-out à médiation par nuclease. Il évite les limitations rencontrées par d&#39;autres techniques de génotypage et est plus rentable que les méthodes de séquençage.

L&#39;utilisation d&#39;un PCR-capillaire fluorescent Gel Electrophoresis Technique pour Génotype CRISPR / cas9 médiation Knockout Mutants dans un format à haut débit

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

L'objectif général de cette technique est de génotyper de manière haut débit des clones mutants présentant des insertions ou des délétions induites par CRISPR/Cas9. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la génétique, telles que l'effet phénotypique de l'invalidation d'un gène particulier dans un modèle SAIL choisi. Le principal avantage de cette technique réside dans son criblage pouvant aller du faible au haut débit, qui est multiflexible.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la génétique du cancer humain, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les cellules humaines, souches ou primaires, ou les cellules d'origine non humaine. Nous avons eu l'idée de cette méthode lors de la réalisation de tests de typage par répétitions tandem courtes ou STR. Pour commencer la procédure, transfectez les cellules choisies avec un plasmide, coexprimant une étiquette fluorescente cas9 et l'ARN guide simple.Trypsiniser les cellules et sélectionner environ 3 500 clones marqués de façon fluorescente. Ensemencer les clones par portions de 500, 1 000 et 2 000 cellules dans des boîtes de 10 centimètres contenant huit mill

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