Analyse électrophysiologique des cardiomyocytes à base de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC-CM) utilisant des matrices multi-électrodes (MEA)

L’objectif global de cette procédure est de dissocier les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines et de les plaquer sur des réseaux multi-électrodes pour mesurer et quantifier la durée et la fréquence de leur signal électrique typique, également appelé potentiel de champ. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le terrain, telles que les différences électrophysiologiques entre les cardiomyocytes porteurs de mutations et les témoins. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet le criblage de médicaments sur des cardiomyocytes humains dérivés de cellules de patients.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Comme les étapes de dissociation et de placage sont essentielles pour un enregistrement réussi du signal électrique. Généralement, les individus novices dans cette méthode auront du mal car l’identification de signaux électriques de bonne ou de mauvaise qualité n’est pas triviale et l’analyse du potentiel libre nécessite de l’expérience.

Pour commencer cette procédure, placez les copeaux propres dans une boîte de Pétri stérile en plastique standard de 10 centimètres de diamètre. Ensuite, ajoutez huit millilitres d’eau distillée stérile dans la boîte de Pétri pour former une chambre humidifiée qui empêchera le petit volume de milieu de culture sur la puce de s’aspirer lorsqu’elle est placée dans l’incubateur. Ensuite, utilisez des anneaux en polytétrafluoroéthylène fabriqués sur mesure pour assurer le placage des cardiomyocytes au centre de la puce où se trouve le réseau d’électrodes.

Dans la hotte de culture, retirez les anneaux de l’éthanol. Placez-les dans une boîte de Pétri stérile sans couvercle et laissez sécher les anneaux dans la hotte. Placez ensuite un anneau sec à l’intérieur d’une puce MEA à l’aide d’une pince à épiler stérilisée à la flamme.

Enduisez les électrodes en ajoutant 50 microlitres de fibronectine de 40 microgrammes par millilitre à l’intérieur de l’anneau. Après cela, couvrez la boîte de Pétri avec le couvercle et transférez soigneusement la boîte contenant la puce MEA dans un incubateur. Ensuite, transférez la parabole contenant la puce MEA dans la hotte de culture cellulaire.

Avant d’utiliser la puce MEA, aspirez 50 microlitres de fibronectine à l’aide d’une pipette P200 ou d’un système de vide dans le capot sans déplacer l’anneau en PTFE. Assurez-vous qu’aucun objet solide ne touche les électrodes en gardant la pointe inclinée. Ajoutez ensuite délicatement 950 microlitres de milieu LI-BPEL en veillant à ce qu’il soit uniformément réparti et que l’anneau ne flotte pas.

Remettez ensuite le plat dans l’incubateur. Il s’agit de la culture initiale des cardiomyocytes battants. Dans une hotte de culture tissulaire, aspirez bien le milieu de culture des hPSC-CMs.

Ajoutez un à deux millilitres de PBS sans calcium ni magnésium dans chaque puits pour laver la culture et aspirer le PBS. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de l’enzyme de dissociation dans chaque puits. Incuber l’échantillon pendant 5 minutes à 37 degrés Celsius.

Après cinq minutes, ajoutez un millilitre de LI-BPEL dans chaque puits pour diluer l’enzyme. Détachez la monocouche des hPSC-CM en les grattant doucement à l’aide d’une pipette P1000. Récupérez ensuite la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres.

Ensuite, rincez le puits avec un millilitre de LI-BPEL pour recueillir toutes les cellules et amas de cellules restants. Ajoutez encore deux à trois millilitres de LI-BPEL pour atteindre un volume final d’environ cinq à six millimètres et pipetez doucement de haut en bas trois à cinq fois avec une pipette de cinq millilitres pour dissocier les amas de cellules. Ensuite, centrifugez les cellules à température ambiante pendant trois minutes à 300 fois g.

Après cela, retirez le surnageant sans déloger la pastille cellulaire. Ensuite, mettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire dans 250 microlitres de LI-BPEL. Par la suite, distribuez 50 microlitres de suspension de cellules par MEA en pipetant la suspension de cellules directement au centre de l’anneau en PTFE au-dessus du réseau d’électrodes.

Transférez soigneusement les MEA dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et laissez les cellules se fixer pendant la nuit. Un jour après le placage, retirez soigneusement l’anneau dans un environnement stérile à l’aide d’une pince à épiler stérile. Rincez l’anneau avec de l’éthanol à 80 %.

Et stockez-le dans un tube de 50 millilitres contenant 80 % d’éthanol frais. Ensuite, retirez délicatement 500 microlitres de fluide de la puce MEA. Et ajoutez-y 500 microlitres de LI-BPEL frais.

Ce sont les cardiomyocytes battants après le retrait de l’anneau. Ensuite, transférez les AEM dans l’incubateur à 37 degrés Celsius. Mesurez ensuite l’activité électrique des hPSC-CM sur les MEA à partir d’un jour après le retrait de l’anneau et jusqu’à une semaine.

Lancez maintenant la suite logicielle liée à la configuration MEA. Ensuite, réglez la température à 37 degrés Celsius dans TCX-Control pour enregistrer les mesures. Après cela, retirez le plat contenant la puce MEA de l’incubateur.

Sortez la puce MEA du plat et placez-la sur un mouchoir en papier pour absorber l’eau résiduelle. Essuyez soigneusement le contexte externe de la plaque avec un mouchoir en papier et nettoyez-la à l’aide d’un coton-tige imbibé d’éthanol à 100 % pour éliminer toute eau résiduelle ou débris qui pourraient causer du bruit de signal. Transférez ensuite la plaque MEA sur un étage d’enregistrement à 37 degrés Celsius pour détecter l’activité spontanée.

Ouvrez MC Rack et cliquez sur Modifier pour charger le matériel MEA. Pour créer un nouveau protocole, utilisez le menu déroulant Modifier pour ajouter différents enregistreurs et fenêtres d’affichage au protocole. Démarrez ensuite le protocole en mode lecture en cliquant sur le bouton de lecture.

Si les signaux présentent clairement des pics R et des pics T visibles, attendez 10 à 15 minutes pour conclure la phase d’adaptation. Pour démarrer l’expérience, cliquez sur enregistrer, puis lisez et acquérez des données pendant 10 minutes dans les conditions de référence pour déterminer l’état stable. Annotez les électrodes qui ont eu le meilleur signal afin qu’elles puissent être facilement identifiées et exportées ultérieurement pour analyse.

Pour une évaluation de la réponse médicamenteuse, ajoutez des concentrations croissantes de médicament toutes les 10 minutes. Cliquez sur arrêter pour terminer l’enregistrement à la fin du protocole. Voici les traces représentatives enregistrées avec un MEA montrant une trace de bonne qualité avec des pics RQ et T clairement visibles avec un rapport signal/bruit élevé.

Une trace de mauvaise qualité sans pics RQ et T clairement visibles Et une trace bruyante avec des pics RQ et T clairement visibles mais avec un faible rapport signal/bruit. Et voici les exemples représentatifs de traces de potentiel de champ de bonne qualité avec différentes morphologies qui peuvent être enregistrées lors d’expériences MEA à l’aide de hPSC-CM. La zone ombrée représente l’intervalle QT mesuré pendant l’analyse.

Comme le potentiel de champ à l’AEM ressemble à la dérivée première du potentiel d’action, l’intégrale des traces de potentiel de champ a été calculée comme des démonstrations théoriques des ondes T qui sont proches des repolarisations complètes du potentiel d’action. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’opter pour le plus grand nombre d’électrodes pour garantir des signaux fiables et cohérents. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la PCR en temps quanimal tibial ou la pince patch unicellulaire peuvent être utilisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’expression génique spécifique liée au phénotype électrique ou aux densités spécifiques de courant ionique.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des cellules souches, pour explorer les arythmies cardiaques et la pharmacologie in vitro en utilisant des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de dissocier et de plaquer les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines sur les MEA pour les mesures électrophysiologiques et le dépistage de drogues. N’oubliez pas que travailler avec des médicaments peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que les BPL standard doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.