Name: Une manière non invasive disoler et de phénotype des cellules de la conjonctivite (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Découvrez la cytologie d'impression pour isoler et immunophénotyper les cellules de la surface oculaire. Cette méthode non invasive permet d'analyser les populations de cellules immunitaires par cytométrie en flux.

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Les auteurs souhaitent remercier Nandini Nallappan et Sharon Yeo d&#39;avoir aidé aux étapes techniques. L&#39;étude a été financée par une Subvention de démarrage à KGC de l&#39;École de médecine Lee Kong Chian, de l&#39;Université technologique de Nanyang et d&#39;un Prix principal des scientifiques cliniciens du Conseil national de recherches médicales (NMRC) du Ministère de la Santé de Singapour à LT (NMRC / CSA / 045/2012) et par une subvention du NMRC et administrée par le Centre national d&#39;innovation en santé à KGC et LT (NHIC-12D-1409007).

Tous les échantillons oculaires utilisés dans cette étude ont été recueillis dans la Clinique des yeux secs du Centre national des yeux de Singapour, approuvé par SingHealth Central Centralized Institutional Review Board et le Nanyang Technological University Institutional Review Board, à Singapour. NOTE: Les sujets ont subi des tests cliniques pour évaluer l&#39;étendue de l&#39;inflammation et la gravité du dysfonctionnement de la larme avant l&#39;IC. Les tests cliniques comprenaient le temps de rupture non invasif des larves (NI-TBUT) 14 et la rougeur conjonctivale (hyperémie) 15 , 16 évaluées avec un instrument de diagnostic, le test de Schirmer 17 , le questionnaire standard de l&#39;évaluation du patient sur la sécheresse des yeux (SPEED) 18 et la cornée Coloration 19 . 1. Collecte d&#39;échantillons oculaires par IC <ol><li> Après détermination de l&#39;état clinique, anesthésierLes yeux du participant en appliquant 1 à 2 gouttes d&#39;anesthésie topique, chlorhydrate de proparacaïne, à la conjonctive bulbaire supérieure et au fornix inférieur. Attendez pendant 4 à 5 minutes pour que la sensation de pointe de l&#39;anesthésie soit éteinte. </li><li> Recueillir des échantillons de la conjonctive bulbaire nasale et temporelle avec deux dispositifs de cytologie d&#39;impression. REMARQUE: Un appareil est utilisé pour la collecte de deux échantillons d&#39;impression. Ici, deux dispositifs ont été utilisés pour la collecte de quatre membranes d&#39;impression. <ol><li> Positionnez le dispositif de cytologie d&#39;impression tangentiellement sur la conjonctive. Appuyez doucement sur le bouton-poussoir et maintenez-le enfoncé pendant 2 à 3 s. REMARQUE: L&#39;appareil est livré avec la membrane. La pression est relâchée automatiquement après avoir poussé le bouton. Il ne faut que quelques secondes pour libérer la pression et retirer l&#39;appareil. </li></ol></li><li> Libérer la membrane dans un tube de microcentrifugeuse contenant 1 mL de milieu de culture (milieu de l&#39;Institut Memorial Roswell Park (RPMI) + 10% de sérum bovin fœtal(FBS) + 1% de pénicilline-streptomycine (Pen Strep)) par un scalpel. </li><li> Isoler les cellules de la membrane de l&#39;appareil par un raclage continu pendant environ 1 min avec une pointe de pipette de 10 μL. REMARQUE: Le raclage est terminé lorsque la surface de la membrane devient inégale. Les nombres de cellules de chaque membrane sont variables (100 à 500 cellules / membrane). Traiter les échantillons dans les 2 à 3 heures de la collecte. </li></ol> 2. Immunophénotypes cellulaires par cytométrie de flux <ol><li> Centrifuger les cellules à 400 xg pendant 5 min à température ambiante pour enlever le support. Remettre en suspension le culot cellulaire avec 50 μL de tampon de coloration par cytométrie en flux (solution salée tamponnée au phosphate (PBS) + 0,05% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA)). </li><li> Tachez les cellules avec un panneau d&#39;anticorps ( p . Ex. , CD3 brillant violet (BV) 510 (UCHT1), CD4 allophycocyanine-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 phycoérythrine (PE) -A, CD45RO PE-cyanine 7 (PE- Cy7) -A, et la marque live / dead cell 7-ADD) à température ambiante pendant 20 à 30 minutes dans lefoncé. Utiliser des anticorps directement à partir du stock selon le protocole du fabricant. NOTE: Pour la concentration d&#39;anticorps, utilisez 2,5 μL de CD3-BV510, 1,25 μL de CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD et 10 μL de CCR7-PE. Utiliser des cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) pour titrer les différentes concentrations d&#39;anticorps. Pour le titrage, prenez la concentration d&#39;anticorps mentionnée dans le protocole du fabricant et utilisez la moitié et le quart de la concentration recommandée. Utilisez la concentration minimale d&#39;anticorps pour éviter les retombées sur d&#39;autres canaux de fluorochrome. Des signaux clairs ont été observés avec les concentrations d&#39;anticorps mentionnées. La compensation a été effectuée en testant les PBMC initialement selon le protocole mentionné dans Williams et al . 20 Pour les tests, les PBMC ont été incubées avec le même ensemble d&#39;anticorps utilisés ici et compensées par la comparaison de taches d&#39;anticorps simples et multiples. </li><li> Après la période d&#39;incubationOd, ajouter 1 mL de tampon de coloration au tube, bien mélanger et centrifuger à 450 xg pendant 5 minutes à température ambiante. Remettre en suspension les cellules dans 200 μl de tampon de coloration. </li><li> Exécutez des échantillons sur une machine de cytométrie en flux. <ol><li> Avant d&#39;acquérir les données, calibrez les tensions du canal de cytomètre de flux avec des perles de configuration et de suivi du cytomètre (CS &amp; T) pour normaliser l&#39;acquisition de données à différents jours selon les instructions du fabricant. <ol><li> Ouvrez le logiciel de collecte de données de cytométrie de flux, cliquez sur le bouton &quot;Configurer et QC&quot;, choisissez le numéro de lot CSA et CS, chargez les perles, puis cliquez sur le bouton &quot;Démarrer&quot;. </li></ol></li><li> Remise en suspension des cellules en tapotant doucement le tube avant de charger les échantillons sur la machine. Ouvrez le logiciel de collecte de données et cliquez sur &quot;Aperçu&quot;. Lorsque le taux de seuil est stable, cliquez sur &quot;Acquérir&quot;. Surveillez le niveau de l&#39;échantillon et cliquez sur «Arrêter» lorsque les échantillons sont épuisés. REMARQUE: Acquérir 10 000 événements par échantillon. </lI&gt; <li> Après avoir acheté 10 000 événements, générez un tracé de points SSC-A et FSC-A dans la feuille de calcul. <ol><li> Cliquez sur le bouton &quot;Polygon Gate&quot; et tracez une porte (c&#39;est P1) sur tous les événements avec une valeur FSC-A&gt; 5 x 10 4 pour exclure les débris. Cliquez sur le bouton &quot;Créer un tracé de points&quot; pour générer un nouveau tracé de points, cliquez avec le bouton droit de la souris sur le point, choisissez &quot;Propriétés&quot; pour ouvrir la fenêtre &quot;Éditeur de tableaux&quot;, puis choisissez &quot;P1&quot;. Cliquez sur le FSC-A sur l&#39;axe des x du tracé de points P1, modifiez-le sur CD3-BV510. Dessinez une &#39;&#39; Porte Polygone &#39;&#39; pour choisir la population CD3 + et nommez-la &#39;&#39; P2 &#39;&#39;. </li><li> Cliquez sur le bouton &quot;Créer un tracé de points&quot; pour générer un nouveau tracé de points, cliquez avec le bouton droit de la souris, choisissez &quot;Propriétés&quot; pour ouvrir la fenêtre &quot;Éditeur de plots&quot;. Cliquez sur le FSC-A sur l&#39;axe des x du diagramme de points P2 et changez-le en 7-AAD. Dessinez un &#39;&#39; Polygon Gate &#39;&#39; pour 7-AAD - population et choisissez &#39;&#39; P3 &#39;&#39;. P3 est ici CD3 +Cellules vivantes. </li><li> Cliquez sur le bouton &quot;Créer un tracé de points&quot; pour générer un nouveau tracé de points, cliquez avec le bouton droit de la souris, choisissez &quot;Propriétés&quot; pour ouvrir la fenêtre &quot;Éditeur de plots&quot;. Cliquez sur le CD3-BV510 sur l&#39;axe des x et CD4-APCH7 sur l&#39;axe des y de la trame de points P3. Dessinez des rectangles Gates sur les côtés supérieur et inférieur du quadrant et choisissez &#39;&#39; P4 &#39;&#39; et &#39;&#39; P5 &#39;&#39;, respectivement. P4 est en direct CD3 + CD4 + et P5 est en direct CD3 + CD4 - cellules T. </li><li> Cliquez sur le bouton &quot;Créer un tracé de points&quot; pour générer un nouveau tracé de points, cliquez avec le bouton droit de la souris, choisissez &quot;Propriétés&quot; pour ouvrir la fenêtre &quot;Éditeur de plots&quot;. Cliquez sur le CD45RO PE-Cy7 sur l&#39;axe des abscisses et CCR7-PE sur l&#39;axe y des parcelles P4 et P5. Dessinez &#39;&#39; Quad Gate &#39;&#39; sur ce tracé de points. REMARQUE: le côté gauche supérieur, le côté droit supérieur, le côté inférieur droit et le côté gauche inférieur sont ici naïfs, mémoire centrale (T CM ), eLes cellules T de mémoire ffectorale (T EM ), à mémoire différentielle différenciée (T EMRA ), respectivement. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent une absence d&#39;intérêts financiers en compétition.

Il s&#39;agit d&#39;une technique facile, rapide et moins invasive qui peut être utilisée dans les cliniques ambulatoires pour un profil immunitaire relativement rapide contrairement aux techniques classiques comme le grattage, le tampon, le pipetage ou le papier filtre absorbant 1 , 2 . Une variante de cette technique est déjà utilisée dans les paramètres de recherche 22 . L&#39;application future de la méthodologie proposée est la stratification des patients dans les essais cliniques avec des maladies oculaires, en particulier ceux nécessitant un immunophénotypage. Un défi majeur avec cette technique est le nombre relativement peu de cellules immunitaires récupérées après la collecte et le raclage des empreintes. Le nombre total de lymphocytes T CD3 + récupérés à partir de quatre impressions par individu variait de ~ 500 à 1000 cellules. Les échantillons oculaires ont été lavés avant l&#39;analyse de cytométrie en flux pendant un nombre minimal de fois pour éviter une perte supplémentaire de cellulesS. Les étapes et les défis critiques qui subsistent dans le protocole sont la collecte efficace d&#39;échantillons oculaires et le raclage correct de la membrane pour atteindre un nombre de cellules plus élevé. Néanmoins, il est peu probable que cette limitation entraîne un biais vers un phénotype immunitaire spécifique. Le dépannage effectué ici pour maximiser le rendement des cellules était de réduire le nombre d&#39;étapes de lavage après et avant l&#39;incubation des anticorps. Il existe d&#39;autres limitations à l&#39;utilisation de l&#39;IC. Chez les patients atteints de surface oculaire gravement kératinisée ou fibrosée, comme dans le syndrome de Steven Johnson, le rendement cellulaire peut être encore inférieur à celui de cette étude. La proportion de cellules immunitaires peut changer si les échantillons sont stockés au lieu d&#39;analyser le même jour. Il est difficile de prédire si certains types de cellules sont plus résistants au stockage que d&#39;autres. Des études antérieures ont rapporté des niveaux élevés d&#39;expression de HLA-DR dans les cellules épithéliales conjonctivales 23 , donc ce serait interAfin d&#39;évaluer la corrélation entre HLA-DR et les niveaux de cellules immunitaires spécifiques. Les cellules immunitaires peuvent également être associées au niveau d&#39;expression des chimiokines. Ces questions devraient être abordées dans les études futures.

La cytologie d&#39;impression (IC) a d&#39;abord été réalisée en 1977 par Thatcher et al . 1 . Ils ont utilisé un disque d&#39;impression plastique pour collecter les cellules conjonctivales des patients au lieu d&#39;autres techniques disponibles à ce moment-là, telles que le raclage, le tamponnage ou le pipetage 1 . La technique actuelle de l&#39;IC utilise un papier filtre absorbant 2 pour imprimer la conjonctive bulbeuse et palpebrale et collecter la couche la plus superficielle des cellules conjonctivales. Ces cellules, ayant atteint leur stade final de différenciation, se répandent continuellement dans les larmes 3 . Trois cellules majeures de cellules se trouvent dans les spécimens de CI: cellules épithéliales 4 , cellules caliciformes 3 , 5 et tissu lymphoïde associé aux muqueuses, à savoir des cellules T effectrices associées à l&#39; épithélium ou des cellules dendritiques 6 . Cellules de surface oculaire dans IC samLes analyses peuvent être analysées par microscopie, immunotransbrantation et réaction en chaîne par polymérase en transcriptase inverse (RT-PCR) 7 . La cytométrie de flux a récemment été utilisée pour analyser les cellules immunitaires collectées en grattant la membrane IC 8 . Fait intéressant, IC 6 , 9 a été utilisé pour évaluer de nombreuses maladies de la surface oculaire, y compris la keratoconjonctivite sicca, la carence en vitamine A, la pemphigoïde cicatricielle, la maladie atopique, la kératoconjonctivite limbique supérieure, la kératoconjonctivite vernal et la métaplasie squameuse épithéliale. IC a également été utilisé pour évaluer l&#39;impact du port de lentilles de contact, détecter les microbes de surface oculaire et tester l&#39;efficacité thérapeutique et la tolérance des interventions thérapeutiques dans les études longitudinales 10 , 11 , 12 . Le dispositif médical (EyePrim) est pris en charge par un type de polyLa membrane d&#39;éthersulfone (PES) de 0,2 μm, validée pour la technique de la cytologie d&#39;empreinte oculaire avec cytométrie de flux (OSIC-flow) et ouvre des possibilités d&#39;échantillonnage longitudinal pour surveiller la progression de la maladie et la réponse au traitement ( p . Ex . Analyse des leucocytes intra-épithéliaux définis comme des marqueurs putatifs de la maladie pour une fibrose conjonctivale progressive dans la pemphigoïde des muqueuses) 13 . Les premiers chercheurs ont utilisé des filtres PES autoclavés qui nécessitaient une impression manuelle. En conséquence, le rendement était variable et dépendait de l&#39;utilisateur. L&#39;avantage de ce dispositif médical est la facilité d&#39;utilisation, la pression standardisée (Pa ou N / m 2 ), et permet la répétabilité, la reproductibilité et la récupération cellulaire cohérente. Cette technique est utile dans une clinique ambulatoire car elle n&#39;est pas chirurgicale, facile à réaliser et rapide. Il s&#39;agit d&#39;un dispositif médical de classe I (stérile) selon la directive 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Cela nécessite seulementS anesthésie topique pendant la procédure, ce qui assure le maintien de l&#39;intégrité de la surface oculaire. Après IC, les cellules peuvent être traitées immédiatement pour la cytométrie en flux. En outre, il est possible pour les techniciens non-ophtalmologiques et les infirmières d&#39;être formés pour échantillonner la surface oculaire. Malgré l&#39;amélioration de l&#39;IC sur d&#39;autres techniques, plusieurs défis demeurent. Par exemple, il peut y avoir des variations en raison de la zone de l&#39;échantillonnage et des différences régionales dans la conjonctive bulbaire en fonction de la position de l&#39;IC. Une autre source de variation est due à l&#39;application de différentes quantités de pression pendant l&#39;IC. D&#39;autres problèmes méthodologiques impliquent la normalisation du traitement cellulaire: ceux-ci impliquent une durée et une méthode de fixation, ainsi que les conditions de stockage possible, ce qui peut avoir une incidence sur la stabilité du matériau échantillonné. L&#39;objectif global de cette technique est de développer une méthode d&#39;isolement des échantillons d&#39;empreintes oculaires thaT est facile à utiliser, non invasif et peut être appliqué à la caractérisation immunologique des échantillons cliniques.

<table><tbody><tr><td><Réactifs > forts</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-humains CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>563109</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain CD4 APCH7</td><td>BD Biosciences</td><td>641398</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain CD45RO PECy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337168</td><td></td></tr><tr><td>solution 7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>555816</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain CCR7 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552176</td><td></td></tr><tr><td>Pippetes</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Anesthésie locale</td><td>Alcaine</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescéine solution sodique</td><td>Bausch & Lomb U.K Limited</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nom</td><td>Société</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratograph 5M</td><td>Oculus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lampe à fente BioMicroscope</td><td>Haag Streit</td><td>BM900</td><td></td></tr><tr><td>EyePrim</td><td>Opia Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACS Verse</td><td>BD BioSciences</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 6.0</td><td>Prism</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse logiciel d’analyse</td><td>BD</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

une manière non invasive d&#39;isoler et de phénotype des cellules de la conjonctivite

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionnellement, la cytologie de surface oculaire est étudiée avec des techniques telles que la technologie des spatules et la technologie de la brosse. Le problème avec ces techniques est qu&#39;elles peuvent induire des lésions traumatiques à la surface de l&#39;œil, qui peuvent progresser vers les cicatrices, la déformation des paupières, la carence en cellules souches limbales et, dans certains cas, causer un grand inconfort au sujet. Pour éviter ces problèmes cliniques, la cytologie d&#39;impression (IC) a été développée pour diagnostiquer une maladie des yeux secs et plus tard une néoplasie, une maladie atopique, une kératoconjonctivite verte et une kératoconjonctivite sicca. Généralement, les cliniciens coupent manuellement les papiers filtrants dans les formes requises et les appliquent à la surface oculaire. Ici, nous décrivons comment effectuer l&#39;IC à l&#39;aide d&#39;un dispositif médical disponible dans le commerce. Cette technique est expliquée ici, suivie d&#39;un immunophénotypage par cytométrie de flux. Cette technique nécessite moins de manutention manuelle et cause moins de blessures à la surface oculaire.

IC par ce dispositif clinique nous a permis d&#39;isoler les cellules immunitaires de surface oculaire tout en conservant la surface oculaire intacte. La figure 1 décrit comment l&#39;IC a été effectuée. Les différents sites de l&#39;oeil d&#39;où ont été recueillis les échantillons sont marqués. La figure 2 montre le résultat représentatif de la cytométrie de flux recueillie à partir de 10 témoins sains. Pour le gating, utilisez SSC et 7-AAD pour distinguer entre les cellules vivantes et les cellules mortes. Les cellules 7-AAD sont identifiées comme des cellules vivantes. Ces cellules vivantes sont encore caractérisées par des marqueurs CD3 + et CD4 + . En outre, les populations CD4 + et CD4 se caractérisent chacune par Naïve, T EM , T CM et T EMRA avec les marqueurs CCR7 et CD45RO. Parmi les cellules T CD3 +, les cellules T de mémoire effectorale prédominent dans la surface oculaire humaine. Dans l&#39;ancien eXperiments, il a également été montré que les cellules de mémoire CD8 + sont les populations principales dans les cellules T épithéliales conjonctivales chez les personnes en bonne santé 20 . La figure 3 montre que les cellules T de mémoire effectorale CD4 + et CD8 + (T EM et T EMRA ) sont le sous-ensemble majeur de la surface oculaire humaine dans 10 contrôles sains étudiés. Chaque population mentionnée dans la figure est notifiée avec son marqueur phénotype et noms (Naïve, T CM , T EM , T EMRA ). Les nombres en rouge indiquent le pourcentage de la population. Les données de cette figure sont représentées par la moyenne ± SEM <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" /> Figure 1: Collecte d&#39;échantillons IC à partir de la surface oculaire par le dispositif de cytologie d&#39;impression. Les échantillons ont été prélevés à partir de l&#39;ampoule temporelleAr région comme indiqué. <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" /> Figure 2: Dot Plot Graph utilisant la cytométrie de flux. Les cellules Live 7-AAD ont été sélectionnées. Les cellules CD3 + ont d&#39;abord été fermées, puis cette population a été classée dans les sous - groupes CD4 + et CD4. Les proportions des sous-ensembles naïfs (CCR7 + CD45RO - ), mémoire centrale (CCR7 + CD45RO + ) et effecteur (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO - ) ont été déterminées à l&#39;aide des marqueurs CCR7 et CD45RO. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" /> FFigure 3: Sous-types de cellules immunitaires dans les cellules T CD4 + et CD8 + de surface oculaire humaine saine. Répartition des sous-ensembles conjonctivaux CD4 + et CD8 + naïfs, mémoire centrale (T CM ) et effecteur (T EM et T EMRA ) dans des contrôles humains sains; Chaque point de données représente une moyenne individuelle séparée ± SEM montrée. Le pourcentage de la population est marqué comme rouge au-dessous du nom de chacune des populations. Le pourcentage total de la population est de 98%, car la population CD4 + T EMRA n&#39;était pas incluse dans le diagramme de dispersion mentionné (modifié par Bose et al., 21 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

La surface oculaire normale exposée est constituée de cornée et de conjonctive. Les cellules épithéliales, les cellules caliciformes et les cellules immunitaires sont présentes dans la conjonctive. Ici, une technique non invasive de cytologie d&#39;impression est décrite en utilisant un dispositif de cytologie d&#39;impression et une cytométrie de flux pour analyser les cellules immunitaires dans la conjonctive.

Une manière non invasive d&#39;isoler et de phénotype des cellules de la conjonctivite

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

L'objectif général de cette technique de cytologie par impression est d'obtenir suffisamment de cellules pour déterminer immunologiquement le phénotype des cellules impliquées dans les maladies de la surface oculaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de la surface oculaire, telles que quelles cellules immunitaires sont importantes pour l'inflammation de la surface oculaire. Les principaux avantages de cette technique sont qu'elle est relativement peu invasive et simple à réaliser en clinique et au laboratoire.Les implications de cette technique s'étendent vers le traitement des troubles inflammatoires de la surface oculaire, car elle permet l'identification de populations spécifiques de cellules immunitaires. Cette méthode peut fournir des informations sur la population de cellules immunitaires de la surface oculaire. Elle peut également être appliquée à l'étude de la toxicologie oculaire et de la fibrose oculaire.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison d'un manque d'expérience dans la manipulation du faible nombre de cellules prélevées à partir de l'œil. Après avoir déterminé l'état clinique du participant, appliquer une à deux gouttes d'anesthésique topique sur la conjonctive bulbaire supérieure et le fornix inférieur des yeux du participant. Attendre quatre à cinq minutes afin que la sensation de picotement provoquée par l'anesthésique disparaisse.Ensuite, positionner un dispositif de cytologie par empreinte tangentiennement sur la conjonctive du côté bulbaire temporal et appuyer doucement sur le bouton pendant deux à trois secondes. À l’aide de pinces, transférer la membrane oculaire prélevée dans un tube de microcentrifugeuse contenant un millilitre de milieu de culture, puis effectuer un grattage continu de la membrane pendant une minute à l’aide d’une pointe de pipette de 10 microlitres afin de récupérer le reste des cellules du dispositif. Faire attention lors du grattage de la membrane, car un grattage excessif entraînera un mélange de débris, tandis qu’un grattage insuffisant peut conduire à une faible utilisation des cellules.Lorsque la surface de la membrane devient irrégulière, effectuez une deuxième collecte du même œil du côté nasal de l’œil, comme vient de l’être démontré. Prélevez les cellules à l’aide de la première suspension d’échantillon oculaire et collectez deux échantillons provenant de l’autre œil du participant. Deux à trois heures après la collecte, centrifugez les cellules oculaires et remettez en suspension le culot dans 50 microlitres de tampon de marquage pour cytométrie en flux, composé de solution saline tamponnée au phosphate enrichie de 0,05 % d’albumine de sérum bovin.Ensuite, colorer les cellules avec un panel d'anticorps d'intérêt pendant 20 à 30 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière. À la fin de l'incubation, laver les cellules avec un millilitre de tampon de marquage et re-suspendre le culot dans 200 microlitres de tampon de marquage frais. Étalonner les tensions des canaux du cytomètre en flux dans le panneau de configuration du cytomètre et préparer un tube de billes de suivi afin de normaliser l'acquisition des données conformément aux instructions du fabricant.Ensuite, dans le logiciel de collecte de données de cytométrie en flux, cliquez sur Configuration du contrôle qualité et sélectionnez le numéro de lot correct des billes de réglage et de suivi du cytomètre. Chargez les billes et cliquez sur le bouton Démarrer. Maintenant, resuspendez délicatement la suspension cellulaire en tapotant doucement, puis placez le tube dans l'appareil.Ouvrez le logiciel de collecte des données et cliquez sur Aperçu. Lorsque le taux de seuil est stable, cliquez sur Acquérir. Surveillez le niveau de l'échantillon et cliquez sur Arrêter lorsque l'échantillon est épuisé.Après avoir acquis 10 000 événements, générez un nuage de points de diffusion avant par diffusion latérale (en aire) et utilisez l'outil de sélection polygonale pour tracer une région 1 englobant tous les événements dont la valeur de l'aire de diffusion avant est supérieure à cinq fois dix puissance quatre, afin d'exclure les débris. Cliquez sur Créer un nuage de points pour générer un nouveau nuage de points. Faites un clic droit sur le graphique et sélectionnez Propriétés pour ouvrir la fenêtre de l'éditeur de graphique.Choisissez P1 et cliquez sur la zone de diffusion avant sur l'axe des abscisses pour modifier l'axe affiché en CD3. Ouvrez un nouveau diagramme de dispersion pour la population P2 et modifiez l'axe des abscisses en 7-AAD. Dessinez une fenêtre autour de la population négative pour le 7-AAD afin de sélectionner les cellules viables positives pour le CD3.Nommez cette porte P3 et ouvrez un nouveau diagramme de dispersion. Dans la fenêtre de l'éditeur de graphique, sélectionnez CD3 pour l'axe des abscisses et CD4 pour l'axe des ordonnées. Utilisez maintenant les populations P4 et P5 pour ouvrir deux nouveaux diagrammes de dispersion et configurez les axes des abscisses pour afficher les cellules positives pour CD45RO et les axes des ordonnées pour afficher les cellules positives pour CCR7 dans chaque graphique.Ensuite, créez une fenêtre P6 autour des cellules positives pour CD3, positives pour CD4, positives pour CCR7 et positives pour CD45RO, ainsi que les fenêtres P7, P8 et P9 autour des cellules positives pour CD3, négatives pour CD4, positives pour CCR7, positives pour CD45RO ; négatives pour CD45RO, négatives pour CCR7, négatives pour CD4, positives pour CD3 ; et positives pour CD45RO, négatives pour CCR7, négatives pour CD4, positives pour CD3, respectivement. Les populations positives pour CD4 et négatives pour CD4 peuvent être caractérisées comme des lymphocytes T mémoires centraux positifs pour CD45RO et positifs pour CCR7, et des lymphocytes T mémoires effecteurs positifs pour CD45RO et négatifs pour CCR7.Et CD45RO négatif, CCR7 négatif, T mémoire effecteur différencié de manière terminale selon leur expression des marqueurs CCR7 et CD45RO. Parmi ces sous-populations, les lymphocytes T mémoire effecteurs CD4 positifs et CD8 positifs constituent la sous-population majeure de lymphocytes T généralement observée à la surface oculaire chez les sujets humains sains. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux heures, si elle est effectuée correctement.Lors de cette tentative, d'autres procédures telles que le dosage immunoenzymatique (ELISA), le Western blot et d'autres études peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les cytokines et les gènes impliqués dans la voie de signalisation. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des études de la surface oculaire pour évaluer les différents types de cellules immunitaires au sein d'une population de patients spécifique d'intérêt. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer la cytologie par impression et de la façon d'isoler et de traiter les cellules immunitaires provenant de la surface oculaire.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo décrit une technique basée sur l’écouvillonnage pour isoler les bactéries commensales viables de la conjonctive oculaire. La technique peut être utilisée pour profiler le microbiome bactérien commensale de la conjonctive, qui joue un rôle défensif contre les agents pathogènes.

Isolement des bactéries commensales conjonctivales à base d’écouvillons : une technique pour isoler les bactéries commensales de la conjonctive d’un modèle murin

Dans cette vidéo, nous montrons une procédure pour obtenir des cellules épithéliales pigmentaires oculaires à partir d’un modèle de lapin. Les cellules sont utiles dans le développement de stratégies thérapeutiques pour les maladies dégénératives de la rétine.

Isolement des cellules IPE et RPE : une technique pour obtenir des cellules épithéliales de pigment oculaire à partir d’œil de lapin

Nous avons collecté, coloré et imagé des cellules de la conjonctive du bord interne de la paupière de sujets humains. En caractérisant la morphologie cellulaire et l’activité métabolique, cette méthode peut approfondir notre compréhension de la sécheresse oculaire et du rôle que le frottement entre les surfaces oculaires peut jouer dans la perception de l’inconfort oculaire.

Impression cytologie de la zone d&#39;essuie-glace du couvercle

Des millions de personnes souffrent de maladies dégénératives de la rétine qui entraînent une cécité irréversible. Un élément commun de nombreuses de ces maladies est la perte de cellules ganglionnaires de la rétine (RGC). Ce protocole détaillé décrit l'isolement des RGC murins primaires par sélection positive et négative avec cytométrie de flux.

Isolement des cellules de ganglion rétiniennes murines primaires (RGC) par cytométrie de flux

Ce protocole décrit une méthode pour l'isolement du globe oculaire de souris avec la paupière, la surface oculaire, les segments antérieurs et postérieurs dans la position relativement intacte.

Isolement de intact Globe oculaire pour obtenir le tissu de surface oculaire intégral pour l'examen histologique et l'immunohistochimie

Présenté ici est une plate-forme microscopique multiphoton pour l’imagerie de surface oculaire de souris vivante. La souris transgénique fluorescente permet la visualisation des noyaux cellulaires, des membranes cellulaires, des fibres nerveuses et des capillaires à l’intérieur de la surface oculaire. Les signaux non linéaires de deuxième génération harmonique dérivés de structures collagènes fournissent une imagerie sans étiquette pour les architectures stromales.

Une plate-forme personnalisée de microscopie multiphoton pour l’imagerie en direct de la cornée de souris et de la conjonctive

Présenté ici est un protocole pour l’isolement et l’amplification des bactéries commensales conjonctivales anaérobies aérobies et facultatives de souris utilisant un écouvillon unique d’oeil et une étape basée sur culture d’enrichissement avec l’identification suivante par des méthodes basées microbiologiques et la spectrométrie de masse MALDI-TOF.

Isolement et identification commensaux conjonctivaux chez la souris

Ici, un protocole pour isoler et transfecter les cellules épithéliales pigmentaires primaires de l’iris et de la rétine de divers mammifères (souris, rats, lapins, porcs et bovins) est présenté. La méthode est parfaitement adaptée à l’étude des approches de thérapie génique oculaire dans diverses configurations pour des analyses ex vivo et des études in vivo transférables à l’homme.

Isolement, culture et génie génétique de cellules épithéliales pigmentaires primaires de mammifères pour la thérapie génique non virale

Le milieu sans sérum de veau fœtal sans rouge de phénol est une meilleure option que le RPMI avancé pour éliminer les hormones exogènes sans altérer la fonction normale des cellules caliciformes conjonctivales dans l’étude des différences basées sur le sexe.

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Nous présentons ici un protocole permettant d’isoler et d’identifier les cellules de niche limbique humaines.

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Cet article démontre le fonctionnement et l’effet de la microscopie confocale in vivo dans le diagnostic et le traitement de la sécheresse oculaire et étudie l’application et les résultats de la microscopie confocale in vivo afin de fournir une base pour les recherches futures.

In vivo La microscopie confocale dans le diagnostic et la prise en charge de la sécheresse oculaire : un regard sur les protocoles d’imagerie et l’interprétation

Découvrez la cytologie d'impression pour isoler et immunophénotyper les cellules de la surface oculaire. Cette méthode non invasive permet d'analyser les populations de cellules immunitaires par cytométrie en flux.

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