Une manière non invasive d'isoler et de phénotype des cellules de la conjonctivite

L’objectif global de cette technique de cytologie d’empreinte est de dériver suffisamment de cellules pour phénotyper immunologiquement les cellules impliquées dans les maladies de la surface oculaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de la surface oculaire, telles que les cellules immunitaires importantes pour l’inflammation de la surface oculaire. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est relativement non invasive et simple à réaliser en clinique et en laboratoire.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement des troubles inflammatoires de la surface oculaire puisqu’elle permet l’identification de populations spécifiques de cellules immunitaires. Cette méthode peut donner un aperçu de la population de cellules immunitaires de la surface oculaire. Il peut également être appliqué à l’investigation de la toxicologie oculaire et de la fibrose oculaire.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés en raison d’un manque d’expérience dans la manipulation du faible nombre de cellules collectées dans l’œil. Après avoir déterminé l’état clinique du participant, appliquez une à deux gouttes d’anesthésie topique sur les conjectives bulbaires supérieurs et le fornix inférieur des yeux du participant. Attendez quatre à cinq minutes pour que la sensation de picotement de l’anesthésique se dissipe.

Positionnez ensuite un appareil de cytologie d’empreinte tangentiellement sur les conjectives du côté bulbaire temporal et appuyez doucement sur le bouton-poussoir et maintenez-le enfoncé pendant deux à trois secondes. À l’aide d’une pince, libérez la membrane oculaire prélevée en vrac dans un tube de microcentrifugation contenant un millilitre de milieu de culture, suivi d’une minute de grattage continu de la membrane avec une pointe de pipette de 10 microlitres pour récupérer le reste des cellules du dispositif. Soyez prudent lorsque vous grattez la membrane, car trop de grattage entraînera une combinaison de débris, tandis que trop peu de grattage peut entraîner une faible utilisation des cellules.

Lorsque la surface de la membrane devient inégale, répétez une deuxième collecte du même œil sur la face nasale de l’œil, comme nous venons de le démontrer. Prélevez les cellules avec la suspension du premier échantillon oculaire et prélevez deux échantillons de l’autre œil du participant. Dans les deux à trois heures suivant le prélèvement, centrifugez les cellules oculaires et remettez la pastille en suspension dans 50 microlitres de tampon de coloration par cytométrie en flux, contenant une solution saline tamponnée au phosphate complétée par 0,05 % d’albumine sérique bovine.

Ensuite, colorez les cellules avec un panel d’anticorps d’intérêt pendant 20 à 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, lavez les cellules avec un millilitre de tampon de coloration et remettez la pastille en suspension dans 200 microlitres de tampon de coloration frais. Étalonnez les tensions des canaux du cytomètre en flux dans le panneau de configuration du cytomètre et configurez un tube de billes de suivi pour normaliser l’acquisition de données conformément aux instructions du fabricant.

Ensuite, dans le logiciel de collecte de données de cytométrie en flux, cliquez sur Setup QC et choisissez la configuration du cytomètre et le numéro de lot de perles de suivi appropriés. Chargez les perles et cliquez sur le bouton Démarrer. Maintenant, remettez la suspension de la cellule en tapotant doucement et chargez le tube sur la machine.

Ouvrez le logiciel de collecte de données et cliquez sur Aperçu. Lorsque l’option Taux de seuil est stable, cliquez sur Acquérir. Surveillez le niveau de l’échantillon en cliquant sur Arrêter lorsque l’échantillon est épuisé.

Après avoir acquis 10 000 événements, générez un graphique à points de zone de diffusion avant par côté et utilisez l’outil de porte polygonale pour dessiner une population une porte sur tous les événements avec une valeur de zone de diffusion vers l’avant supérieure à cinq fois 10 à la puissance quatre pour exclure les débris. Cliquez sur Créer un graphique à points pour générer un nouveau graphique à points. Faites un clic droit sur le tracé et choisissez Propriétés pour ouvrir la fenêtre de l’éditeur de tracé.

Choisissez P1 et cliquez sur la zone de diffusion vers l’avant sur l’axe des x pour changer l’axe affiché sur CD3. Ouvrez un nouveau graphique à points pour la population P2 et remplacez l’axe des x par 7-AAD. Tracez une porte autour de la population 7-AAD négative pour sélectionner les cellules CD3 positives viables.

Nommez cette porte P3 et ouvrez un nouveau diagramme à points. Dans la fenêtre de l’éditeur de tracé, sélectionnez CD3 pour l’axe x et CD4 pour l’axe y. Utilisez maintenant les populations P4 et P5 pour ouvrir deux nouveaux diagrammes à points et définissez les axes x pour afficher les cellules CD45RO positives et les axes y pour afficher les cellules CCR7 positives dans chaque graphique.

Créez ensuite une porte P6 autour des cellules CD3 positives, CD4 positives, CCR7 positives, CD45RO positives et des portes P7, P8 et P9 autour des cellules CD3 positives, CD4 négatives, CCR7 positives et CD45RO positives. CD45RO négatif, CCR7 négatif, CD4 négatif, CD3 positif et CD45RO positif, CCR7 négatif, CD4 négatif, CD3 positif, respectivement. Les populations CD4 positives et CD4 négatives peuvent être caractérisées comme suit : lymphocytes T CD45RO positifs, CCR7 positifs, lymphocytes T à mémoire centrale et lymphocytes T effecteurs CD45RO positifs, CCR7 négatifs.

Et CD45RO négatif, CCR7 négatif, T terminalement différencié en fonction de l’expression de leurs marqueurs CCR7 et CD45RO. Parmi ces sous-ensembles, les lymphocytes T effecteurs CD4 positifs et CD8 positifs, constituent la principale sous-population de lymphocytes T généralement observée sur la surface oculaire des humains en bonne santé. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en deux heures, si elle est correctement exécutée.

Pendant ce temps, d’autres procédures telles que ELISA, Western blot et d’autres études peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les cytokines et les gènes impliqués dans la voie de signalisation. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des études de la surface oculaire pour évaluer les différents types de cellules immunitaires au sein d’un groupe démographique spécifique de patients d’intérêt. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la cytologie d’empreinte et d’isoler et de traiter les cellules immunitaires de la surface oculaire.