Name: Chirurgical Ablation Essai pour étude de la régénération des yeux dans planaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Apprenez l'ablation chirurgicale des yeux chez les planaires pour étudier la régénération oculaire et les mécanismes des cellules souches in vivo. Cette méthode précise minimise les dommages aux tissus environnants.

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Les auteurs tiennent à remercier Michelle Deochand pour perfectionner cette technique d&#39;ablation de l&#39;oeil, Taylor Birkholz pour l&#39;aide à l&#39;analyse fonctionnelle, Michael Levin pour l&#39;anticorps anti-arrestine et Junji Morokuma des informations sur les plaques à effet Peltier. Ce travail a été soutenu par une subvention SFSA de l&#39;Université Western Michigan à WSB.

1. Culture des animaux et la manipulation NOTE: Ce protocole utilise mediterranea Schmidtea, une espèce planaires diploïdes avec un génome séquencé 16, 17 qui est couramment utilisé pour la recherche sur la régénération. Cependant, le dosage est le même succès avec d&#39; autres espèces, telles que Girardia Tigrina et Girardia dorotocephala (qui sont disponibles dans le commerce). <ol><li> Maintenir vers dans « l&#39; eau à vis sans fin » fabriqué à partir de 0,5 g de sels de mer / L dans ultrapure (ou déminéralisée filtrée) de l&#39; eau. Utilisation polypropylène stériles ou des récipients en verre pour contenir l&#39;eau à vis sans fin. Voir <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55594/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">fichier supplémentaire 1</a> pour plus de détails sur la préparation de l&#39; eau du ver. REMARQUE: Ne jamais utiliser de savon pour nettoyer des récipients (ou d&#39;autres fournitures) que le savon est toxique pour les vers; à la place essuyer avec 70% d&#39;éthanol et laisser sécher à l&#39;air. &lt;ol&gt; <li> Porter des gants tout en travaillant avec planaires pour les protéger de la contamination. NOTE: Les vers sont très sensibles aux toxines environnementales et les produits chimiques, y compris du savon, eau de javel, du shampoing, revitalisant et lotion pour les mains. </li></ol></li><li> colonies de la maison dans des récipients alimentaires en polypropylène, avec le couvercle partiellement ouvert à gauche pour l&#39;échange de l&#39;air à environ 20 ° C (température ambiante). vers expérimentales du magasin dans les deux boîtes de Pétri (20 vers par boîte de 100 mm) ou de plaques de culture de tissus non traités (1 ver par puits pour les plaques à 12 puits). Pour réduire le stress, maintenir les colonies et expériences dans l&#39;obscurité. NOTE: Les colonies ne devraient pas avoir plus de 500-1.000 vers par litre d&#39;eau de ver. Pour les expériences, laisser les paupières complètement en place, étant donné que le flux d&#39;air est conçu dans ces plats. </li><li> Nourrir les vers non expérimentales une fois par semaine avec du bœuf biologique ou de purée de foie de volaille en laissant tomber la purée d&#39;une pipette de transfert, en plaçant des gouttes de nourriture à travers le récipient. Laisser les vers 2 h à consommer de la nourriture dans laobscurité avant le nettoyage de conteneur (voir étape 1.4). Avant l&#39;utilisation, la purée de conserver à -20 ° C pour le court terme (semaines) ou -80 ° C pour le long terme (mois); ne pas recongeler la purée pour la réutilisation (comme les bactéries peuvent fleurir et nuire aux vers). NOTE: Le foie ne doit pas contenir des hormones ou des antibiotiques et de préférence être préalablement congelé. Centrifugeuse de purée avant la congélation (ou avant l&#39;alimentation) pour éliminer l&#39;air et éviter que les aliments flottant. La nourriture doit couler au fond du récipient. 1 ml de purée est suffisante pour les vers 500-1000. </li><li> l&#39;eau d&#39;échange une fois par semaine avec de l&#39;eau de ver frais pour les colonies et expériences. Conteneurs de colonies doit également être essuyés avec une serviette en papier non blanchie (pour éliminer les résidus de mucus que les déchets de casiers) une fois par semaine pour les vers de faim, ou deux fois par semaine pour les vers d&#39;alimentation (2 h après le repas et encore 2 jours plus tard). Afin de conserver le biofilm, ne pas essuyer plus de 80% du récipient. </li><li> Déplacer vers entre les conteneurs (ou Setu de chirurgiep) à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert. Pour les vers libres adhèrent à la surface des récipients, injecter de l&#39;eau sur / derrière la vis sans fin pour le libérer de la surface. Puis aspirer le ver dans la pipette, en essayant de garder le ver dans la partie inférieure pouces (plus mince) de la pipette. <ol><li> pipettes backloading avec une petite quantité d&#39;eau de ver avant de les aspirer. </li><li> Essayez de déplacer l&#39;eau autour du ver, plutôt que le ver lui-même, pour aider à prévenir la déchirure vers corps mou en les touchant avec la pipette. </li><li> Garder plats expérimentaux couverts à moins que le transfert vers ou en remplaçant l&#39;eau. </li></ol></li></ol> 2. Préparation <ol><li> Arrêtez vers l&#39; alimentation au moins une semaine avant les expériences. <ol><li> Sélectionner des vers qui ont été pas été nourris pendant ≥1 semaine et sont au moins 5-7 mm de longueur. Transférer les vers à une boîte de Pétri 2/3 plein d&#39;eau à vis sans fin, et confirmer la longueur de vis sans fin en faisant glisser une règle sous le plat. mesurer wORM en pleine extension et en mouvement. REMARQUE: Bien que plus petit (5-7 mm) vers fonctionnent mieux lors de l&#39; exécution ultérieure et immunofluorescence analyses hybridation in situ, les vers de plus grands (8-10 mm) sont plus faciles à travailler avec - en particulier lors de l&#39; apprentissage à pratiquer l&#39; ablation. </li><li> Assurez-vous que les vers sont entiers, en bon état, et non récemment régénération. NOTE: les vers régénérant auront beaucoup plus léger pigment (ou pas) de la tête et / ou de la région de la queue par rapport à la normale vers. </li><li> Si vous effectuez ARNi ou traitements pharmacologiques sur les vers, le faire à ce stade. Si les vers ont été nourris dans le cadre du traitement (comme pour ARNi), attendez au moins 7 jours après la dernière alimentation avant de continuer à l&#39;étape 2.2. </li></ol></li><li> Nettoyer la base de microscope espace de travail et disséquant avec 70% d&#39; éthanol et laisser sécher complètement. Placez le plat de vers sélectionnés sur la gauche de la portée. A droite de la portée, de placer une paire de forceps # 5, un 31 G 5/16-inch aiguille à l&#39;insuline avec une 1ml seringue, et une pipette de transfert propre. <ol><li> Veiller à ce que les instruments sont gardés de toucher le banc (qui pourrait introduire des contaminants). Utiliser un élément rigide (par exemple un reste de baguettes) pour maintenir la pince, l&#39;aiguille, et la pipette propre. Sinon, place des instruments sur le dessus d&#39;un nouveau brun (écrue) serviette en papier. REMARQUE: Ces instructions et suivantes sont écrites en ce qui a trait aux personnes droitiers. les individus gauchers doivent inverser les directions droite / gauche. </li></ol></li><li> A côté de l&#39;espace de travail, placer une boîte de lingettes de tissu sans peluches, une source d&#39;eau de ver frais, et quelques pipettes de transfert supplémentaires (protégés par le haut du banc). Mettre l&#39;eau ver dans une bouteille en plastique de lavage pour faciliter la distribution. Également placer une plaque de 12 puits marqué (ou boîte de Petri de 100 mm) à droite de la portée de la collecte des animaux ablation. </li><li> Si vous utilisez une plaque à effet Peltier sur mesure pour immobiliser les vers, positionner la plaque Peltier dans la dépression en til base du microscope à dissection et ajuster la sortie de la source d&#39;alimentation en courant continu jusqu&#39;à ce que la surface de travail de la plaque Peltier est suffisamment froide (typiquement ~ 5 V) .Alternatively, faire une plaque froide en remplissant une boîte de Petri de 100 mm ½ avec de l&#39;eau et congeler pendant au moins 24 h. Jeter le couvercle et placer le fond de la boîte de 100 mm sur la base du champ de dissection, puis placer le couvercle d&#39;une boîte de Pétri à l&#39;envers 60 mm vers le bas directement sur la surface de la glace (figure 1A). <ol><li> Après que l&#39;eau a gelé dans le plat de 100 mm, un « volcan » de la glace peut apparaître dans le centre de la plaque. Si cela se produit, utilisez une lame de rasoir pour gratter le plat de glace, pour éliminer les irrégularités de la surface. REMARQUE: lors de chirurgies de la glace va fondre, ce qui rend beaucoup plus difficile ablations. Préparer plusieurs plats à base de glace à l&#39;avance, et remplacer les surgelés pour les faire fondre pendant l&#39;essai dès que le couvercle de la boîte de 60 mm commence flottant. </li></ol></li><li> Préparer lasurface de la chirurgie. Couper une 5 cm x 10 cm morceau de film de paraffine en matière plastique (4 cm 2 si l&#39;on utilise la plaque froide boîte de Pétri) et le placer sur le centre du dispositif d&#39;immobilisation. Plier un tissu non pelucheux essuyer dans un carré d&#39; environ 2 cm 2 et le placer sur le dessus du film. Couper un morceau de papier filtre blanc de 1,5 à 2 cm 2 et le placer sur le dessus de la lingette. Voir Figure 1B-1E. <ol><li> Tenir le plié lingette en place avec un doigt ganté, et utiliser l&#39;eau de ver pour amortir légèrement la lingette pour qu&#39;il reste plié. Utiliser le côté d&#39;une pipette de transfert pour rouler le chiffon plat. REMARQUE: La température froide permet de garder les vers de se déplacer. Travailler « sec » contribue également à l&#39;immobilisation. Le tissu essuyer agit pour évacuer l&#39;eau à travers le papier filtre, en maintenant la vis sans fin humide pendant la chirurgie sans laisser les vers à sécher complètement (qui est létale). </li></ol></li></ol> 3. Ablation chirurgicale <ol><li> Utiliser une pipette de transfert pour placer surface dorsale de e à vis sans fin vers le haut sur le papier filtre. Tournez la source de lumière et de diriger les cols de cygne pour que la lumière se concentre sur le ver. Ajustez la mise au point de la portée à disséquer et à un grossissement de sorte que les yeux soient clairement visibles (l&#39;ensemble du ver n&#39;a pas besoin d&#39;être en vue); grossissement 5X est un bon point de départ. Orienter la vis sans fin en faisant tourner le film de paraffine de sorte que la tête est pointée vers le chercheur (vers l&#39;avant du microscope), en angle 30-40 degrés vers la droite. <ol><li> Évitez l&#39;utilisation de la lumière vive pour empêcher le mouvement excès de ver. Planaires afficher phototaxie négatifs et tenteront d&#39;échapper à la lumière vive. </li><li> Si la vis sans fin est positionnée face ventrale vers le haut (avec ouverture pharyngée visible), utiliser le côté mat de la pince pour repositionner doucement la face dorsale de la vis sans fin vers le haut (avec les yeux visibles). Évitez de vous approcher l&#39;animal avec la pointe acérée de la pince pour minimiser le risque de déchirer à travers les tissus mous lors du repositionnement de l&#39;animal. </li><li&gt; Régler la mise au point du microscope afin que les yeux soient clairement mis au point. Assurez-vous également que les yeux et les tissus environnants tête sont en vue. </li></ol></li><li> Tenir une nouvelle aiguille / seringue dans la main droite comme si elle était un stylo (entre le pouce et l&#39;index). Préparez le pouce gauche contre la plaque Peltier (ou boîte de Petri de la plaque froide), et en utilisant le pouce gauche comme un point d&#39; appui sur lequel la partie inférieure de la seringue de repos (figure 2A). Regardez à travers le microscope, et assurez - vous que le biseau de l&#39;aiguille est visible. NOTE: Les aiguilles sont très pointues. Soyez prudent lors de la manipulation. Le port de gants en latex ou en nitrile peut offrir une certaine protection. <ol><li> Utilisez le pouce gauche pour aider à maintenir la constante aiguille / seringue tout au long de la procédure et éviter de serrer la main. </li><li> Faire un angle d&#39;environ 40 ° avec le pouce gauche et l&#39;index gauche (avec l&#39;index sur la surface de la chirurgie) pour aider à maintenir la stabile de surface de la chirurgie. </li></ol></li><li> Avecle biseau de l&#39;aiguille dirigée vers le haut (comme une cuillère), positionner l&#39;aiguille à angle droit par rapport à l&#39;oeil (figure 2B). Utilisez la pointe de l&#39;aiguille pour pénétrer doucement la mince couche de tissu recouvrant la coupe optique (région blanche, non pigmenté) de l&#39;oeil, l&#39;excavation de droite à gauche. Très retirer doucement tout tissu pigmenté situé à l&#39; intérieur de la cupule optique, en prenant soin de ne pas perforer le fond ou détruire les bords de la coupe optique. <ol><li> Si le ver a été mis sur le papier filtre pour&gt; 1-2 min à tout moment au cours de la procédure, ajouter une goutte d&#39;eau de ver pour réhydrater le ver. NOTE: Déshydratation va augmenter la sensibilité du ver à des blessures ripping. </li></ol></li><li> Répétez l&#39;étape 3.3 jusqu&#39;à ce que tous les tissus pigmentés en noir (cellules pigmentaires), ainsi que tous les tissus blancs de la coupe optique (les dendrites des cellules photoréceptrices), sont supprimés. Retirer les tissus excisés collé à l&#39;extrémité de l&#39;aiguille en l&#39;essuyant avec une lingette soigneusement le tissu. Si Abla double oeiltion est souhaitée, le second oeil ablater à ce stade. REMARQUE: Pour éviter les blessures, les aiguilles peuvent être nettoyés en saisissant l&#39;aiguille avec un tissu propre lingette tenue avec le pouce et l&#39;index, puis en utilisant l&#39;autre main pour tirer l&#39;aiguille à travers la lingette loin du pouce et l&#39;index. En variante, l&#39;aiguille peut être effacée sur la surface d&#39;une lingette humide et le tissu examiné pour la propreté. </li><li> Une fois terminé, en utilisant une pipette de transfert pour déplacer la vis sans fin à un plat marqué contenant de l&#39; eau fraîche à vis sans fin. Si l&#39; analyse des données de groupe, placer jusqu&#39;à 20 vers dans une seule boîte de Petri de 100 mm. Si la régénération de suivi dans les mêmes personnes au fil du temps, placer 1 ver dans chaque puits d&#39;une plaque de 12 puits. Une fois que tous les vers sont transférés, laver les vers en enlevant l&#39; eau à vis sans fin à partir des plats / puits et le remplacement avec de l&#39; eau à vis sans fin plus frais. <ol><li> Pour supprimer les vers du filtre, backloading la pipette avec une petite quantité d&#39;eau sans fin et libérer l&#39;eau sur le ver. Cela devrait soulever til ver le papier-filtre, pour être immédiatement aspiré dans la pipette de transfert. </li></ol></li><li> Incuber expériences à ~ 20 ° C (température ambiante) à l&#39;abri de la lumière et de suivre le processus de régénération. REMARQUE: Les vers peuvent être stockés dans un incubateur à température contrôlée pour maintenir une température constante, mais ce n&#39;est pas strictement nécessaire. La plupart des températures ambiantes ne varient que de + 5 ° C, ce qui ne sera pas affecter la capacité du ver à se régénérer. </li><li> Si l&#39;on désire fixer des vers pour l&#39; immunohistochimie (voir les figures 3-4) et / ou l&#39;hybridation in situ analyse de l&#39; expression génique. Différentes méthodes de fixation existent pour l&#39; immunohistochimie planaire 18, 19, 20 et l&#39;hybridation in situ 21, 22, 23 protocoles. </li><li> Lorsque les expériences sont terminées, sacrifiCE en direct vers en éliminant l&#39;eau du ver de la capsule et le remplacement avec 70% d&#39;éthanol. Incuber les vers pendant 3-5 min, pour les vers à vérifier lyser et tourner grisâtres. </li><li> Placez les vers non traités dans le flux de déchets normaux une fois sacrifié. Éviter d&#39;introduire des vers vivants dans l&#39;environnement, en particulier les espèces non indigènes. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Cette technique d&#39;ablation de l&#39;oeil améliore les méthodes actuelles (comme perforatrice) en excluant les tissus du cerveau et en limitant l&#39;excision principalement aux tissus oculaires. Avec la pratique, cette technique peut être réalisée par la plupart des individus, des techniciens expérimentés dans microchirurgies aux étudiants de premier cycle inexpérimentés mais consciencieux. Il est recommandé que cette technique soit pratiquée plusieurs fois avant d&#39;utiliser ablations dans des expériences, y comp...

Planaires sont un organisme modèle puissant pour étudier la régénération des cellules à médiation souches adultes. Ces planaires d&#39;eau douce non parasites possèdent la capacité de régénérer les tissus et tous les disparus, y compris leur système nerveux central et le cerveau 1. Étudié dès les années 1700 2, les avancées technologiques dans le domaine planaire au cours des 10-15 dernières années ( par exemple un génome séquencé, l&#39;hybridation in situ, l&#39; immunohistochimie, l&#39; interférence ARN (ARNi), et transcriptomique) ont mis à jour cet organisme modèle historique . Plus précisément, les planaires ont récemment gagné en popularité comme un nouveau modèle pour la recherche des yeux 3. Planaires ont des yeux prototypiques avec seulement deux types de tissus, les neurones photorécepteurs et des cellules de pigment; ce qui a permis la caractérisation de la population oeil sur les cellules souches et a démontré que la plupart des mêmes gènes de régulation de l&#39;oeil de vertébrésveloppement sont conservés dans planaires 4, 5. Les coupes optiques sont situés dorsalement et comprennent des dendrites blanches, non pigmentés des neurones photorécepteurs et les cellules de pigment noir semi-lunaires, et les yeux innervent le cerveau par l&#39;intermédiaire d&#39;un chiasma optique. En plus d&#39;être un modèle pour élucider les processus de régénération 6, l&#39;oeil planaire est bien adaptée à l&#39; étude de l&#39;évolution des mécanismes visuels 7, les réponses comportementales à la lumière (planaires afficher phototaxie négative) 8, et la base du comportement neurologique 9. La régénération des yeux dans planaires a été largement étudié dans deux contextes principaux: dans le cadre de la régénération de la tête suivante 4 décapitation, 10, et après l&#39; excision de seulement les tissus oculaires 11, 12 </sup&gt;. La plupart des études planaires sur la régénération des yeux ont utilisé la méthode de la décapitation, car il est simple et direct. La méthode la plus courante de l&#39; excision des yeux planarian à ce jour a été par perforatrice avec un beau tube capillaire en verre 13, 14, bien que certaines études ont également effectué des amputations juste derrière les yeux (décapitation partielle) 15. Cependant, toutes ces méthodes impliquent la perte de nombreux tissus autres que de l&#39;œil (comme le cerveau, les intestins, et néphridies), ce qui complique l&#39;interprétation des résultats potentiellement. Le protocole d&#39;ablation oculaire présenté ici limite l&#39;excision des tissus oculaires (en particulier à l&#39;exclusion du cerveau), entraînant des données plus spécifiques à l&#39;œil. De plus, à la différence des vers décapités qui prennent 7-14 jours pour commencer l&#39; alimentation, les yeux vers ablatée alimenteront dans les 24 h d&#39;ablation 12, ce qui permet des expériences ARNi (où l&#39; ARNi est délivré par la nourriture) à performeD simultanément. Bien que l&#39;ablation de l&#39;oeil est techniquement plus difficile à réaliser avec succès que la décapitation, les études en cours portant sur l&#39;excision des yeux ne sont pas inclus des instructions détaillées sur leurs procédures. L&#39;objectif de cet article vidéo est de permettre aux chercheurs d&#39;enlever systématiquement la coupe optique planaires sans perturber les tissus cérébraux sous-jacents et la suppression de quelques autres tissus que possible. Cette méthode peut être utilisée à la fois l&#39;ablation oculaire simple et double et est applicable à un large éventail d&#39;enquêtes. Comme la plupart des essais de régénération, l&#39;ablation de l&#39;œil est bien adapté pour une combinaison avec les deux écrans (ARNi) pharmacologiques et génétiques, ainsi que des études comportementales. Nous décrivons ici les méthodes pour la manipulation des vers, en maintenant une colonie planaires, et la technique d&#39;ablation de l&#39;œil lui-même.

<table><tbody><tr><td>Sels de mer instantanés de l’océan</td><td>Spectrum Brands&nbsp ;</td><td>SS15-10</td> <td>« Boîte de 10 gallons » (poids net 3 lbs)</td></tr><tr><td>Kimwipes EX-L Lingette mouchoir non pelucheuse</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>4,5 x 8,5 po&nbsp ;</td></tr><tr><td>Papier filtre Whatman #2</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td></td><td>WHA1002125 Cercles, 125 mm de diamètre, blanc</td></tr><tr><td>Seringue à insuline Easy Touch (avec aiguille)</td><td>Pet Health Market</td><td>17175-04</td><td>&nbsp ; U-100 Seringue de 1 cc, 31 G 5/16 po aiguille</td></tr><tr><td>100 mm Boîte de Pétri</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 60 mm</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pince</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11254-20</td><td>Inox, pointe droite, 11 cm</td></tr><tr><td>Pipettes de transfert&nbsp ;</td><td>Samco Scientific&nbsp ;</td><td>225</td><td>Gradué, grande ampoule, 7,5 mL,</td></tr><tr><td>film de paraffine Parafilm M</td><td></td> non stérile<td>701606</td><td>&nbsp ; Rouleau de 4 po x 125 pi</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire non traitée à 12 puits</td><td>VWR</td><td>15705-059</td><td>Non traité, à fond plat, stérile, de marque Falcon</td></tr><tr><td>Contenants alimentaires en plastique (pour colonie)&nbsp ;</td><td>Ziploc</td><td>Grand rectangle</td><td>de 2,25 pintes (2,12 L), 10 po x 6 -3/4 po x 3 -3/16 po.</td></tr><tr><td>Planaria (Girardia tigrina)</td><td>Carolina Biological</td><td>132954</td><td>Vendu sous le nom de Planaria « Brown » ; le plus souvent, ils sont G. tigrina (alias Dugesia tigrina), mais parfois sont G. dorotocephala (alias Dugesia dorotocephala) ; l’un ou l’autre fonctionnera.</td></tr><tr><td>Planaria (Schmidtea mediterranea)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>S. mediterranea ne sont pas disponibles dans le commerce. À l’heure actuelle, les animaux ne peuvent être obtenus que dans les laboratoires qui les utilisent et qui ont des animaux supplémentaires.</td></tr><tr><td>Essuie-tout brun</td><td>Grainger</td><td>2U229</td><td>Essuie-tout à plis multiples à 1 pli 9-3/16 x 9-3/8",</td></tr><tr><td>bouteille de lavage non blanchie (pour l’eau de vers),</td> bouteilles de lavage <td>VWR</td><td>16650-275</td> en option<td>, polyéthylène basse densité, col large, 500 ml</td></tr><tr><td>d’anticorps anti-synapsine, en option</td><td>Études de développement Hybridoma Bank</td><td>3C11</td><td>Anticorps anti-arrestine surnageant</td></tr><tr><td>, en option</td><td>n/a</td> n<td>/a</td><td>Non disponible dans le commerce. Aimable cadeau de Michael Levin, Tufts University</td></tr><tr><td>Nalgene Bonbonne Lowboy avec robinet (pour stocker l’eau des vers), en option</td><td>Nalge Nunc International Corporation</td><td>2324-0015</td><td>15 L,&nbsp ; polypropylène, profil bas facilite le remplissage des conteneurs de colonie en plastique&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaque Peltier personnalisée, machine Williams en option</td><td>, Foxboro, MA&nbsp ;</td><td>n/a</td><td>Caractéristiques de conception avec l’aimable autorisation de Junji Morokuma, Université Tufts :&nbsp ; La plaque Peltier est construite à partir d’une pompe à chaleur thermoélectrique standard (par exemple, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).&nbsp ; La pompe à chaleur carrée est recouverte d’une fine surface réfléchissante, puis placée à l’intérieur d’un trou carré de 30 mm2 en forme de plexiglas circulaire (~50 mm de diamètre). Cette forme est d’une épaisseur similaire à celle de la pompe à chaleur, et s’insère au ras d’un puits bien usiné au centre d’un dissipateur thermique rond (~115 mm de diamètre). La forme/pompe à chaleur est&nbsp ; « Ancré » à l’évier avec un composé de dissipateur thermique à base de silicone. Les fils sont filetés à travers des trous percés à la fois dans la forme et dans le dissipateur thermique. La moitié inférieure du dissipateur thermique est usinée dans un « pied » qui s’insère dans l’ouverture de la plaque de base de votre microscope.</td></tr><tr><td>Source d’alimentation CC (pour plaque Peltier), B</td><td>& K Precision</td><td>1665</td><td>Alimentation basse tension CC régulée, 1-18 V (DC), 1-10 ampères.</td></tr><tr><td>Autres fournitures</td><td></td><td></td><td></td>courantes</tr><tr><td>Gants</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lunette de dissection avec éclairage en</td><td></td><td></td><td></td>col de cygne</tr><tr><td>Repose-baguettes, en option</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

chirurgical ablation essai pour étude de la régénération des yeux dans planaires

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Dans l&#39;étude des cellules souches adultes et les mécanismes de régénération, flatworms planaires sont un aliment de base dans le système modèle in vivo. Cela est dû en grande partie à leur population de cellules souches pluripotentes abondante et la capacité de régénérer tous les types de cellules et de tissus après des blessures qui seraient catastrophiques pour la plupart des animaux. Récemment, planaires ont gagné en popularité en tant que modèle pour la régénération des yeux. Leur capacité à régénérer l&#39;œil entier (comprenant deux types de tissus: cellules de pigment et photorécepteurs) permet la dissection des mécanismes de régulation de la régénération du système visuel. L&#39;ablation des yeux présente plusieurs avantages par rapport aux autres techniques (telles que la décapitation ou perforatrice) pour l&#39;examen des voies spécifiques à l&#39;oeil et les mécanismes, dont le plus important est que la régénération est en grande partie limitée aux tissus oculaires seuls. Le but de cet article vidéo est de montrer comment supprimer de manière fiable la coupe optique planaires sans perturber le cerveau ou les tissus environnants.La manipulation des vers et à l&#39;entretien d&#39;une colonie établie est également décrite. Cette technique utilise un 31 G, 5 / aiguille d&#39;insuline de 16 pouces pour ramasser une intervention chirurgicale sur la coupe optique planaires de immobilisées sur une plaque froide. Cette méthode englobe à la fois l&#39;ablation oculaire simple et double, avec les yeux régénérant dans les 1-2 semaines, ce qui permet un large éventail d&#39;applications. cette technique d&#39;ablation en particulier, peut être facilement combiné avec des écrans pharmacologiques et génétiques (interférence ARN) pour une meilleure compréhension des mécanismes de régénération et de leur évolution, les cellules souches des yeux et leur entretien, et les réponses comportementales phototaxic et leur base neurologique.

Pour la première 1-2 h après la chirurgie, les animaux peuvent présenter un mouvement diminué par rapport aux vers intacts (mais ils se déplaceront encore). Si vous le souhaitez, les vers mangent dans les 24 h de la chirurgie (par exemple, pour l&#39;alimentation ARNi). En suivant la régénération des yeux chez les mêmes personnes au fil du temps, assurez-vous de prendre une photo de chaque ver à la fois avant la chirurgie (intacte) et à 1 h ablation post (hpa). En 4 jours après l&#39; ab...

Ce protocole montre comment exciser constamment les yeux planaires (tasses optiques) sans déranger les tissus environnants. En utilisant une aiguille d&#39;insuline et d&#39;une seringue, un ou les deux yeux peuvent être ablatée pour faciliter les enquêtes sur les mécanismes de régulation de la régénération des yeux, l&#39;évolution de la régénération visuelle, et les bases neurales du comportement induite par la lumière.

Chirurgical Ablation Essai pour étude de la régénération des yeux dans planaires

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer comment retirer de manière fiable la cupule optique des planaires sans perturber le cerveau ni les tissus environnants, afin que cette technique puisse être mise en œuvre par des chercheurs et des étudiants à tous les niveaux d'enseignement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération, comme la détermination des mécanismes régulant le maintien et la différenciation in vivo des cellules souches oculaires endogènes. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet aux chercheurs de retirer uniquement les tissus oculaires avec une perturbation minimale des autres tissus.En général, une pratique préalable est nécessaire avant que des personnes novices avec cette méthode puissent retirer de manière fiable la quantité appropriée de tissu, en ablatant tout l'œil tout en évitant d'endommager les tissus environnants. Pour commencer, sélectionnez des vers qui n'ont pas été nourris depuis au moins une semaine et qui mesurent au moins cinq à sept millimètres de long. Transférez 15 à 30 vers dans une boîte de Pétri de 100 millimètres remplie aux deux tiers d'eau pour vers et remettez immédiatement le couvercle.Observer les vers présentant des tissus manquants ou dépigmentés, tels que des têtes ou des queues blanches, afin de s'assurer qu'ils sont intacts et ne régénèrent pas récemment. Commencer par nettoyer la surface de travail et la base du microscope stéréoscopique avec une solution d'éthanol à 70 %, puis laisser sécher complètement. Placer la boîte contenant les vers sélectionnés du côté gauche du microscope.Ensuite, sur le côté droit du microscope, placez une paire de pinces de taille 5, une aiguille à insuline de calibre 31 de 5/16 de pouce munie d'une seringue d'un millilitre, une pipette de transfert propre et une plaque de 12 puits étiquetée pour recueillir les vers ablatés. Placez une boîte de lingettes sans peluches, une bouteille en plastique remplie d'eau fraîche pour vers et des pipettes de transfert supplémentaires afin qu'elles soient facilement accessibles pendant l'intervention chirurgicale. Positionnez une plaque Peltier au centre de la platine du microscope stéréoscopique, puis réglez la sortie de la source d'alimentation continue de sorte que la surface de la plaque Peltier soit suffisamment froide pour immobiliser les vers.Alternativement, une boîte de Pétri remplie de glace peut être utilisée à la place d'une plaque Peltier. Pour préparer la surface chirurgicale, découpez d'abord un morceau de film plastique en paraffine de cinq centimètres sur dix centimètres et placez-le au centre de la plaque Peltier. Ensuite, pliez une lingette sans peluches en un carré d'environ deux centimètres de côté, et placez-la par-dessus le film.Ensuite, maintenez le tampon plié en place, humidifiez-le avec de l’eau de vers et aplatissez-le à l’aide d’une pipette de transfert. Enfin, découpez un morceau de papier filtre blanc de 1,5 à deux centimètres carrés, et posez-le par-dessus le tampon. Pour commencer la chirurgie, placez un vers sur le dos sur le papier filtre à l’aide de la pipette de transfert.Activez la lumière et dirigez son faisceau vers le ver. Réglez la mise au point et le grossissement du microscope stéréoscopique de manière à ce que les yeux du ver soient clairement visibles. Faites pivoter le film de paraffine pour ajuster la position du ver afin que sa tête soit orientée vers le chercheur et inclinée de 30 à 40 degrés vers la droite.Si le ver est positionné avec le côté ventral vers le haut et que l'ouverture pharyngée est visible, utilisez le côté émoussé de la pince pour modifier délicatement la position du ver afin qu'il soit dorsal vers le haut, avec les yeux visibles. Ajustez à nouveau les paramètres du microscope pour que les yeux soient nettement au point. Assurez-vous également que les deux yeux ainsi que les tissus environnants de la tête soient visibles.Tenez une seringue propre de la main droite entre le pouce et l'index. Soutenez la partie inférieure de la seringue avec le pouce gauche, appuyé contre la plaque Peltier. Regardez à travers le microscope pour vous assurer que le biseau de l'aiguille est visible.Placer l'index gauche sur la surface chirurgicale de manière à former un angle de 40 degrés avec le pouce gauche afin de garantir la stabilité de la surface pendant l'intervention. Positionner l'aiguille à un angle de 90 degrés par rapport à l'œil, avec le biseau de l'aiguille orienté vers le haut. À l'aide de la pointe de l'aiguille, pénétrer délicatement la fine couche de tissu recouvrant la cupule optique de l'œil, visible comme une région blanche et non pigmentée.En raclant de droite à gauche, retirer très délicatement tous les tissus pigmentés noirs situés à l'intérieur de la cupule optique ainsi que tous les tissus blancs. Si une ablacion double des yeux est réalisée, ablationner le deuxième œil maintenant. Après avoir terminé la chirurgie, charger la pipette en arrière avec une petite quantité d'eau de vers et relâcher l'eau sur le vers pour le soulever du papier filtre.Aspirez immédiatement le ver dans la pipette de transfert. Placez le ver dans une plaque de 12 puits étiquetée, remplie aux deux tiers d'eau fraîche pour vers. Une fois tous les vers transférés, lavez-les en remplaçant l'eau des puits par de l'eau fraîche pour vers.Incubez les vers à l'abri de la lumière dans un incubateur à 20 degrés Celsius et surveillez le processus de régénération. Pour sacrifier les vers vivants, retirez l'eau des vers de la boîte et remplacez-la par de l'éthanol à 70 %. Incubez les vers pendant trois à cinq minutes et observez si les vers lysent et deviennent gris.Voici des photographies de vers plats ayant subi une ablation double des yeux et une ablation simple de l'œil, prises avant, quatre jours après et deux semaines après l'intervention chirurgicale. Les images montrent l'évolution de la régénération au fil du temps. La régénération oculaire chez les vers ablés a également été confirmée par une coloration immunohistochimique de l'arrestine et des neurones photorécepteurs nouvellement formés.La récupération du système visuel chez les vers plats après une double ablation des yeux a également été étudiée dans un test fonctionnel fondé sur la réponse photophobe typique à la lumière. Vingt-quatre heures après l'ablation, les vers dépourvus d'yeux n'évitent pas la lumière et traversent les zones éclairées. La photophobie est rétablie sept jours après l'intervention, indiquant que le système visuel régénéré est fonctionnel.Une fois maîtrisée, la procédure d'ablation double des yeux d'un vers peut être réalisée en environ trois minutes. Lors de l'ablation, il est important d'exciser tous les tissus pigmentés et non pigmentés de l'œil, tout en veillant à ne pas endommager le tissu situé entre les yeux ni à déchirer le tissu plus tard dans l'œil. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'immunohistochimie et l'interférence ARN peuvent être effectuées afin d'examiner le rôle de gènes spécifiques et de leur processus de régénération.En outre, des tests comportementaux peuvent être réalisés pour évaluer la fonction oculaire après la régénération. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment exciser les yeux de planaires sans perturber les tissus environnants. N’oubliez pas que le travail avec des aiguilles peut présenter des risques, et que des précautions telles que le port de gants et le maintien de l’aiguille orientée loin de vous doivent être prises.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Lésions rénales aiguës (IRA) chez les humains est un problème clinique fréquent causé par des dommages aux cellules épithéliales qui forment néphrons du rein, et Aki est associée à des taux de mortalité élevé de 50-70% 1. Suite à la destruction des cellules épithéliales, néphrons ont une capacité limitée à se régénérer, même si les mécanismes et les limites qui guident ce phénomène reste mal compris. Dans cet article, vidéo, nous décrivons notre technique pour l'ablation laser ciblée des...

Laser Ablation de l&#39;pronéphros Zebrafish d&#39;étude rénale régénération épithéliale

Un modèle intéressant pour étudier différenciation des cellules souches au sein d'un animal vivant est le ver plat planaire. La régénération est étudiée par des expériences simples amputations qui sont facilement réalisées dans un laboratoire de base et sont susceptibles d'être (pharmacologiques et...

Pharmacologiques et des essais de génétique pour manipuler la régénération de l&#39;Planaires Japonica Dugesia</em

Une méthode efficace pour le greffage des tissus de taille définie et cohérente entre les planaires est décrite. On y trouve aussi une description de la façon dont la technique d'immobilisation utilisée pour la transplantation peut être adapté, en collaboration avec des boucliers de plomb, pour l'irradiation partielle d'animaux vivants.

Immobilisation planaire, l&#39;irradiation partielle, et la transplantation de tissus

&lt;p style='hauteur-de-ligne :1.2 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;' dir='ltr'&gt;Source : Volpe, B. A., et al. Essai d’ablation et de régénération laser basé sur un microscope confocal dans les cellules interneuromastères du poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2020) Cette vidéo démontre la surveillance de la récupération des cellules interneuromastes chez le poisson-zèbre à l’aide de la microscopie confocale, le suivi de la mort et de la réparation cellulaires grâce à Imagerie par fluorescence...

Surveillance de la récupération de cellules interneuromastiques ablatées au laser chez le poisson-zèbre à l’aide de la microscopie confocale

Parce que de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques sont étudiés dans les poissons adultes plutôt que l'embryon / larve, nous avons développé un dosage latéral de régénération de ligne quantitative qui peut être appliquée à des modèles de maladies de poisson zèbre adulte. Le dosage impliqué résolution au neuromastes 1) et 2) les niveaux cellulaires de cheveu.

Un test pour ligne latérale de régénération à l&#39;âge adulte de poisson zèbre

Le poisson-zèbre est un populaire modèle animal pour étudier les mécanismes de dégénérescence rétinienne/régénération chez les vertébrés. Ce protocole décrit une méthode pour induire des lésions localisées perturbant la rétine externe avec un minimum de dommages à la rétine interne. Par la suite, nous surveillons in vivo la morphologie de la rétine et la réponse de glia Müller tout au long de la régénération rétinienne.

Activation des cellules Müller Glia dans une dégénérescence rétinienne induite par Laser et le modèle de régénération chez le poisson zèbre

La planaire Schmidtea mediterranea est un excellent modèle pour l’étude des cellules souches et la régénération des tissus. Cette publication décrit une méthode pour éliminer sélectivement un organe, le pharynx, en exposant les animaux à l’azoture de sodium chimique. Ce protocole décrit également les méthodes de suivi de la régénération du pharynx.

Amputation chimique et la régénération du Pharynx dans le planaire Schmidtea mediterranea

L’ablation au laser est une technologie largement applicable pour étudier la régénération dans les systèmes biologiques. Le protocole présenté décrit l’utilisation d’un microscope confocal standard de laser-balayage pour l’ablation de laser et la formation image time-lapse suivante des cellules interuromast régénérantes dans la ligne latérale de zebrafish.

Essai confocal d’ablation et de régénération au microscope dans les cellules interuromast de Zebrafish

L’article explique comment enlever chirurgicalement les yeux des larves vivantes de poisson zèbre comme première étape vers l’étude de la façon dont l’apport rétinien influence la croissance et le développement du tectum optique. En outre, l’article fournit des informations sur l’anesthésie larvaire, la fixation et la dissection cérébrale, suivies de l’immunohistochimie et de l’imagerie confocale.

Enlèvement des yeux chez les larves vivantes de poisson zèbre pour examiner la croissance et le développement du système visuel dépendants de l’innervation

Ce protocole décrit la méthodologie pour ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l’aide d’un modèle transgénique de poisson-zèbre. L’adaptation du protocole pour incorporer la modulation de la voie de signalisation à l’aide de composés pharmacologiques est très détaillée. Une plate-forme MATLAB pour quantifier la régénération RPE basée sur la pigmentation a été développée et est présentée et discutée.

Ablation médiée par la nitroréductase/métronidazole et une plate-forme MATLAB (RpEGEN) pour l’étude de la régénération de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson-zèbre

Nous proposons ici trois méthodes différentes pour endommager les fibres sensorielles qui innervent la cornée. Ces méthodes facilitent l’étude de la régénération axonale chez la souris. Ces trois méthodes, adaptables à d’autres modèles animaux, sont idéales pour l’étude de la physiologie et de la régénération de l’innervation cornéenne.

Trois stratégies pour induire la kératite neurotrophique et la régénération nerveuse dans la cornée murine

Apprenez l'ablation chirurgicale des yeux chez les planaires pour étudier la régénération oculaire et les mécanismes des cellules souches in vivo. Cette méthode précise minimise les dommages aux tissus environnants.

Chirurgical Ablation Essai pour étude de la régénération des yeux dans planaires

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