Chirurgical Ablation Essai pour étude de la régénération des yeux dans planaires

Ce protocole montre comment exciser constamment les yeux planaires (tasses optiques) sans déranger les tissus environnants. En utilisant une aiguille d'insuline et d'une seringue, un ou les deux yeux peuvent être ablatée pour faciliter les enquêtes sur les mécanismes de régulation de la régénération des yeux, l'évolution de la régénération visuelle, et les bases neurales du comportement induite par la lumière.

L’objectif global de cette procédure est de démontrer comment retirer de manière fiable la cupule optique planaire sans perturber le cerveau ou les tissus environnants afin que la technique puisse être mise en œuvre par les chercheurs et les étudiants à tous les niveaux d’éducation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération, telles que la détermination des mécanismes qui régulent le maintien et la différenciation des cellules souches oculaires endogènes in vivo. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet aux chercheurs d’enlever uniquement les tissus oculaires avec une perturbation minimale des autres tissus.

En général, il faut s’entraîner avant que les personnes qui ne connaissent pas cette méthode puissent prélever de manière fiable la bonne quantité de tissu, ablant ainsi l’œil entier tout en évitant l’ablation des tissus environnants. Pour commencer, sélectionnez des vers qui n’ont pas été nourris depuis au moins une semaine et qui mesurent au moins cinq à sept millimètres de long. Transférez 15 à 30 vers dans une boîte de Pétri de 100 millimètres remplie aux deux tiers d’eau de vers et replacez immédiatement le couvercle.

Observez les vers à la recherche de tissus manquants ou non pigmentés, tels que des têtes blanches ou des queues, pour vous assurer qu’ils ne sont pas endommagés et qu’ils ne se régénèrent pas récemment. Tout d’abord, essuyez l’espace de travail et la base du microscope de dissection avec une solution d’éthanol à 70 % et laissez-le sécher complètement. Placez la parabole avec les vers sélectionnés sur le côté gauche du microscope.

Ensuite, sur le côté droit du microscope, placez une paire de pinces numéro cinq, une aiguille à insuline de calibre 31 de 5/16e de pouce avec une seringue d’un millilitre, une pipette de transfert propre et une plaque à 12 puits étiquetée pour recueillir les vers ablatés. Placez une boîte de lingettes en tissu non pelucheuses, une bouteille de lavage en plastique remplie d’eau fraîche de vers de terre et des pipettes de transfert supplémentaires afin qu’elles soient facilement accessibles pendant la chirurgie. Placez une plaque Peltier au centre de la base du microscope à dissection et réglez la sortie sur la source d’alimentation CC de sorte que la surface de la plaque Peltier soit suffisamment froide pour immobiliser les vers.

Alternativement, une boîte de Pétri remplie de glace peut être utilisée à la place d’une plaque Peltier. Pour préparer la surface de la chirurgie, coupez d’abord un morceau de film de paraffine plastique de cinq centimètres sur dix centimètres et placez-le au centre de la plaque Peltier. Ensuite, pliez une lingette en tissu non pelucheuse en un carré d’environ deux centimètres et placez-la sur le film.

Ensuite, tenez la lingette pliée en place, humidifiez-la avec de l’eau de ver et roulez la lingette à plat avec une pipette de transfert. Enfin, coupez un morceau de papier filtre blanc de 1,5 à deux centimètres carrés et posez-le sur la lingette. Pour commencer l’opération, placez un ver côté dorsal vers vers le haut sur le papier filtre, à l’aide de la pipette de transfert.

Allumez la lumière et concentrez son faisceau sur la vis sans fin. Ajustez la mise au point et le grossissement du microscope de dissection de manière à ce que les yeux du ver soient clairement visibles. Faites pivoter le film de paraffine pour ajuster la position du ver de sorte que sa tête soit pointée vers le chercheur et inclinée de 30 à 40 degrés vers la droite.

Si le ver est positionné sur le côté ventral vers le haut et que l’ouverture pharyngée est visible, utilisez le côté émoussé de la pince pour changer doucement la position du ver vers le côté dorsal vers le haut avec les yeux visibles. Réajustez les paramètres du microscope pour que les yeux soient clairement nets. Assurez-vous également que les yeux et les tissus céphaliques environnants sont visibles.

Tenez une seringue propre dans la main droite entre le pouce et l’index. Soutenez la partie inférieure de la seringue sur le pouce gauche, calée contre la plaque Peltier. Regardez au microscope pour vous assurer que le biseau de l’aiguille est visible.

Placez l’index gauche sur la surface de la chirurgie de manière à ce qu’il fasse un angle de 40 degrés avec le pouce gauche pour s’assurer que la surface reste stable pendant la procédure. Positionnez l’aiguille à un angle de 90 degrés par rapport à l’œil, le biseau de l’aiguille étant orienté vers le haut. Avec la pointe de l’aiguille, pénétrez doucement la fine couche de tissu recouvrant la cupule optique de l’œil visible comme une région blanche et non pigmentée.

En ramassant de droite à gauche, retirez très délicatement tout tissu pigmenté noir situé à l’intérieur de la cupule optique ainsi que tous les tissus blancs. Si vous effectuez une double ablation oculaire, ablation du deuxième œil maintenant. Une fois l’opération terminée, chargez la pipette avec une petite quantité d’eau de ver et libérez l’eau sur le ver pour le retirer du papier filtre.

Aspirez immédiatement la vis sans fin dans la pipette de transfert. Déplacez le ver dans une plaque étiquetée à 12 puits remplie aux deux tiers d’eau fraîche de ver. Une fois que tous les vers sont transférés, lavez-les en remplaçant l’eau des puits par de l’eau fraîche de vers.

Incuber les vers à l’abri de la lumière dans un incubateur à 20 degrés Celsius et surveiller le processus de régénération. Pour sacrifier les vers vivants, retirez l’eau des vers de la plaque et remplacez-la par de l’éthanol à 70 %. Incuber les vers pendant trois à cinq minutes et observer si les vers lysent et deviennent gris.

Voici des photographies de vers plats soumis à une double ablation oculaire et à une ablation oculaire unique, prises avant, quatre jours après et deux semaines après l’intervention chirurgicale. Les images montrent la progression de la régénération au fil du temps. La régénération oculaire chez les vers ablatés a également été confirmée par la coloration immunohistochimique de l’arrestine et des neurones photorécepteurs nouvellement développés.

La récupération du système visuel chez les vers plats après une double ablation oculaire a également été étudiée dans un test fonctionnel basé sur la réponse photophobe de type sauvage à la lumière. 24 heures après l’ablation, les vers sans yeux n’évitent pas la lumière et voyagent à travers des points lumineux. La photophobie est rétablie sept jours après l’intervention, ce qui indique que le système visuel régénéré est fonctionnel.

Une fois maîtrisée, la procédure d’ablation double oculaire d’un ver peut être effectuée environ trois minutes. Lors de l’ablation, il est important d’exciser tous les tissus pigmentés et non pigmentés de l’œil, tout en veillant à ne pas endommager le tissu entre les yeux ou à déchirer le tissu plus tard dans l’œil. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunohistochimie et l’interférence ARN peuvent être effectuées afin d’examiner le rôle de gènes spécifiques et leur processus de régénération.

De plus, des tests comportementaux peuvent être effectués pour tester la fonction oculaire après la repousse. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exciser les yeux planaires sans perturber les tissus environnants. N’oubliez pas que travailler avec des aiguilles peut être dangereux et que des précautions telles que porter des gants et tenir l’aiguille loin de vous doivent être prises.