À l’aide de Transmission optique extraordinaire pour quantifier les biomarqueurs cardiaques dans le sérum humain

L’objectif global de cette technique est de mesurer les biomarqueurs présents dans un fond de fluide biologique complexe à des concentrations cliniquement pertinentes dans un lieu de soins, sans avoir besoin de configurations optiques ou électriques élaborées. Cette méthode peut aider à faire des biocapteurs basés sur une transmission extraordinaire une réalité dans des scénarios de point of care. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas de configurations électriques ou optiques compliquées.

Dans nos expériences, il a pu détecter de manière fiable des biomarqueurs à des concentrations cliniquement pertinentes. La fabrication de la puce du capteur s’effectue en salle blanche et ne peut pas être filmée. À des fins de démonstration, la procédure est représentée ici par une animation.

Pour la préparation du moule en nickel, appliquez une couche de 220 nanomètres d’épaisseur de faisceau d’électrons négatifs sur une plaquette de silicium de 600 microns d’épaisseur et de quatre pouces. Écrivez le réseau de nano-trous conçu sur cette plaquette, à l’aide d’un système de lithographie par faisceau d’électrons. Pour accélérer l’écriture du faisceau d’électrons, écrivez les motifs avec une carte à points faibles de 20 000 pour chaque taille de champ de 300 microns.

Développez la résine en immergeant la plaquette de silicium de quatre pouces dans la solution de révélateur pendant 10 secondes et en laissant sécher la plaquette à l’air. Déposez une couche d’amorce d’un métal, tel que du nickel, du cuivre ou de l’aluminium sur la plaquette de silicium. Ensuite, galvanisez la plaquette dans un système de placage dans un bain de nickel-sulfamate en deux étapes.

Séparez le moule en nickel du substrat de silicium en appliquant une force mécanique douce. Ensuite, à l’aide d’une nano-imprimante, imprimez les nanomotifs sur une plaquette de verre de quatre pouces qui a été recouverte d’une réserve de lithographie de nano-impression photodurcissable de 300 nanomètres d’épaisseur. Transférez le moule, la résine photo et la plaquette de verre dans un système de photopolymérisation à la lumière UV et de photopolymérisation.

Si toutes les étapes ont été suivies correctement, le moule en nickel doit être facilement démoulé de la résine photosensible. Après avoir effectué une gravure à blanc de la résine photosensible sur le verre subdroit, sur la plaquette de verre, dans une machine de dépôt par faisceau d’électrons, déposer une couche de chrome pour l’adhérence du métal et une couche d’or pour le capteur plasmonique. Effectuez le décollage de la résine photosensible par gravure au plasma d’oxygène pendant trois minutes, suivi d’une étape de sonofication de 15 secondes dans l’acétone.

Ensuite, coupez l’échantillon en puces de cinq millimètres sur cinq millimètres. Le réseau de nano-trous occupera le carré central, de deux millimètres sur deux millimètres, de la puce. Pour acquérir les données, configurez l’appareil pour effectuer les mesures optiques, de sorte qu’un faisceau de lumière blanche sortant par l’extrémité de la fibre optique de l’émetteur soit en colonne et soit incident de la surface du capteur à 90 degrés.

La lumière est transmise à travers l’ensemble du réseau de nano-trous. Collecter le signal transmis avec la fibre optique du récepteur et l’enregistrer avec un spectromètre UV-visible fonctionnant dans la gamme de 300 à 1 000 nanomètres. Pour le test de sensibilité en vrac du capteur, déposez le liquide à indice de réfraction standard dans la cellule liquide avec des indices de réfraction variant de 1,31 à 1,39.

Plongez la puce du capteur dans le liquide à indice de réfraction standard et alignez-la avec le faisceau de lumière blanche. Obtenez ensuite le spectre de transmission. Nettoyez la puce du capteur après chaque mesure avec un réactif de nettoyage tensioactif et séchez-la avec de l’azote gazeux.

Pour modifier la surface du capteur, nettoyez les puces du capteur par immersion séquentielle dans de l’isopropanol, de l’acétone et de l’eau désionisée avant toute modification chimique. Ensuite, séchez les puces du capteur à température ambiante dans une vapeur d’azote gazeux sec. Ensuite, incubez les puces du capteur dans une solution éthanolique pendant 12 heures à température ambiante.

Cela formera une monocouche réactive aux amines, auto-assemblée. Après l’incubation, utilisez de l’éthanol pour rincer abondamment et sécher les copeaux à température ambiante. Ensuite, plongez les copeaux dans un mélange de 75 millimolaires de sulfo n hydroxysuccinimide et de 15 millimolaires d’EDC pendant 15 minutes.

Cela activera le groupe carboxsilic de la monocouche à monter soi-même. Ensuite, placez 50 microlitres d’une solution d’anticorps anti-triponents de 200 microgrammes par millilitre fabriquée dans un tampon d’acitate de pH 4,5 sur la surface du capteur. Après une incubation de 30 minutes, désactivez les esters non réactifs en immergeant la puce du capteur dans une solution molaire d’éthanolamine HCL pendant 15 minutes.

Enfin, rincez la puce à l’eau déminéralisée et séchez-la dans un jet d’azote gazeux sec à température ambiante. Bloquez toute liaison non spécifique en repérant 100 microlitres de solution d’albumine sérique bovine à 1 % sur la surface de la puce du capteur. Incuber pendant 15 minutes.

Rincez les puces du capteur trois fois dans une solution saline tamponnée au phosphate. Insérez la puce dans la cellule de mesure pour enregistrer le spectre de transmission. Il s’agit du spectre de référence.

Ensuite, placez 50 microlitres de troponine cardiaque, un étalon, sur la surface de la puce. Incuber la puce dans un environnement humide pendant 30 minutes. Après avoir rincé les puces du capteur trois fois dans une solution PBS, insérez-la dans la cellule de mesure pour enregistrer le spectre de transmission.

Il s’agit du spectre de post-liaison. Ensuite, immergez les puces dans 50 millimolaires de glycine HCL pendant une minute, puis rincez-les trois fois dans une solution PBS pour régénérer la surface de la puce. Mesurer le spectre de transmission en PBS pour vérifier le succès de l’étape de régénération.

Le changement du spectre de transmission du biocapteur lors de l’interaction avec 30 nanogrammes par millilitre de troponine cardiaque humaine dans le sérum est montré. Le graphique bleu représente l’avant de l’interaction, tandis que le graphique rouge représente l’après l’interaction. Le cercle pointillé indique la bande suivie.

Voici le décalage de longueur d’onde de la deuxième bande à des concentrations de troponine de 2,5 nanogrammes par millilitre, 7,5 nanogrammes par millilitre, 30 nanogrammes par millilitre et 75 nanogrammes par millilitre. Les barres d’erreur représentent l’écart type. Ce graphique montre le décalage des longueurs d’onde des bandes observé après la régénération d’une puce de biocapteur à nano-trous.

Le déplacement de la position de la bande deux à sa position d’origine indique que l’étape de régénération a réussi. Une fois maîtrisée, la mesure peut être effectuée en une heure si elle est effectuée correctement. Lors de la mesure des bioanalytes dans cette méthode, il est important d’utiliser des réactifs fraîchement préparés.

Assurez-vous de sortir vos consommables. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication de biocapteurs qui fonctionnent sur le principe de la transmission optique extraordinaire et peuvent surveiller les bioanalytes dans un contexte complexe. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il est difficile de générer des réseaux de nano-trous haute fidélité qui permettent d’interfacer la puce avec une fibre optique sans avoir besoin d’un microscope et d’opter pour des résines reproductibles.

Cette technique vous permet d’effectuer des mesures en série qui sont cruciales dans le cadre médical. La fabrication de la puce contribue grandement à assurer la reproductibilité des mesures. La plate-forme de base restant la même, d’autres améliorations de cette technique proviendront de l’utilisation de la technique avec une meilleure résolution qui améliorera la sensibilité et de l’utilisation de méthodes de traitement du signal pour obtenir de meilleurs rapports signal/bruit.

L’implication de cette technique s’étend à la surveillance de plusieurs bioanalytes dans un contexte complexe de sérum dans un lieu d’intervention en temps réel.