Fluorométrie de tension-serre dans

L'objectif général de cette procédure est d'introduire un acide aminé non naturel fluorescent dans une protéine membranaire exprimée dans des ovocytes de Xenopus et de déterminer simultanément la fonction de la protéine et ses réarrangements structuraux, à l'aide de la fluorométrie en blocage de tension. Cette technique permettra de répondre à des questions clés dans le domaine des relations structure-fonction des protéines membranaires. Grâce à la fluorométrie en blocage de tension, nous pouvons corréler directement les réarrangements structuraux avec la fonction de la protéine.

L'ajout d'un marquage par des acides aminés non naturels fluorescents permet de surmonter les limitations précédentes liées au marquage, notamment l'accessibilité des sites de marquage ainsi que le marquage de fond dû à des sites de liaison endogènes. L'application de cette technique s'étend à une meilleure compréhension biophysique des protéines membranaires, car il est désormais possible d'explorer des domaines auparavant inaccessibles avec la fluorométrie classique en condition de blocage de tension.

Après l'ablation chirurgicale des ovocytes de Xenopus, laver les ovocytes trois fois avec la solution SOS. Sélectionner individuellement les ovocytes de grande taille et en bon état, puis les incuber à 18 degrés Celsius pendant au moins quatre heures dans une solution de Barth enrichie avec des antibiotiques et 5 % de sérum de cheval avant l'injection. Pour l'injection nucléaire d'ADN, préparer une micropipette longue et fine afin d'atteindre le noyau sans endommager les ovocytes.

Ensuite, remplissez la pointe d'injection avec de l'huile, puis fixez la pointe d'injection sur le dispositif de nanoinjection. Installez ensuite le nanoinjecteur sous un microscope stéréo et cassez l'extrémité de la pointe à l'aide de pinces. Après cela, expulsez l'huile jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de bulle d'air piégée à l'intérieur de l'extrémité de la pointe.

Ensuite, déposez un microlitre de pAnap à 0,1 microgramme par microlitre dans de l'eau sans nucléase sur un morceau de Parafilm sous le stéréomicroscope, puis remplissez la pipette d'injection avec l'ADN. Transférez ensuite les ovocytes dans une boîte d'injection contenant une grille et une solution de Barth supplémentée avec des antibiotiques. Étant donné que le noyau de l'ovocyte se situe au pôle animal, visez le centre du pôle animal avec la pipette d'injection et pénétrez de sorte que la pointe atteigne une zone proche du centre de l'hémisphère animal.

Ensuite, injectez 9,2 nanolitres de la solution pAnap dans le noyau de chaque ovocyte. Incubez ensuite les ovocytes dans deux millilitres de solution de Barth complétée par des antibiotiques et 5 % de sérum de cheval, à 18 degrés Celsius pendant six à 24 heures, afin de permettre une expression robuste des ARNt spécifiques à Anap et des ARNt-synthétases. Préparez maintenant à nouveau le nanoinjecteur, mais cette fois, la pointe d'injection n'a pas besoin d'être aussi fine que celle utilisée pour l'injection d'ADN.

Travailler uniquement sous lumière rouge à partir de ce point afin d'éviter le photoblanchiment de l'Anap. Mélanger un microlitre d'Anap à un millimolaire avec un microlitre d'ARNm à une à deux microgrammes par microlitre directement sur un morceau de Parafilm, puis remplir la pipette d'injection avec cette solution. Enfoncer la pipette au pôle végétatif juste sous la membrane et injecter 46 nanolitres de la solution dans chaque ovocyte injecté avec le pAnap.

Ensuite, protégez les ovocytes de la lumière en les plaçant dans une boîte opaque à la lumière ou en enveloppant le flacon dans du papier d'aluminium. Incubez-les dans une solution de Barth supplémentée avec des antibiotiques et 5 % de sérum de cheval à 18 degrés Celsius pendant deux à trois jours. Remplacez-la par de la solution de Barth fraîche chaque jour, et retirez les ovocytes morts afin d'éviter toute contamination.

Dans ce dispositif, l'équipement de blocage de tension en configuration cut-open est intégré à un montage de microscopie à fluorescence. La chambre d'enregistrement est installée sur un coulisseau qui permet de la déplacer entre le stéréoscope standard utilisé pour positionner l'ovocyte et le microscope destiné à effectuer les mesures de fluorescence. Un système de détection par photodiode est connecté au port de sortie C-mount du microscope à fluorescence, et la lecture du photocourant est reliée à un second canal d'entrée du processeur de signal numérique.

Une lampe halogène de 100 watts et 12 volts est utilisée comme source lumineuse pour l'excitation de la fluorescence. L'excitation est contrôlée par un obturateur mécanique placé entre la source lumineuse d'excitation et le microscope. L'activation est déclenchée par une impulsion TTL provenant du processeur de signal numérique, elle-même synchronisée dans le logiciel d'enregistrement de manière à ce que l'obturateur s'ouvre environ 100 millisecondes avant le début de l'enregistrement, et un cube de filtres approprié est nécessaire dans la tourelle de cubes de filtres.

Pour la VCF à deux couleurs, incubez les ovocytes préparés dans une solution de marquage contenant du TMR-maléimide à cinq micromoles pendant 15 minutes immédiatement avant l’enregistrement. Ensuite, lavez les ovocytes trois fois avec la solution de marquage afin d’éliminer l’excès de colorant avant l’enregistrement. À ce stade, la protéine est spécifiquement marquée avec deux fluorophores différents.

Après le montage de l'ovocyte, avec le pôle animal orienté vers le haut et perméabilisé, déplacez la chambre vers le microscope et focalisez sur l'ovocyte à l'aide d'un objectif 4X. Ensuite, piquez l'ovocyte avec une électrode V1 de détection de tension. Puis, passez à l'objectif à immersion dans l'eau 40X.

Concentrez-vous sur le pôle animal, qui est orienté vers le haut. Ensuite, éteignez la lumière rouge. Sélectionnez le cube de filtres Anap en tournant la tourelle du cube de filtres et la sortie optique connectée à la photodiode.

Par la suite, allumez la lampe halogène à l'intensité maximale et ouvrez l'obturateur pendant deux à cinq secondes afin de mesurer l'intensité de fluorescence de fond provenant de l'ovocyte. Ensuite, activez le clamp, basculez l'interrupteur bain/garde en position active et réglez le potentiel membranaire au potentiel de commande en tournant le bouton du préamplificateur. Puis, sélectionnez dans le logiciel d'enregistrement le potentiel de maintien, le protocole d'échelon, le nombre et la durée des impulsions.

Ensuite, enregistrez les courants dépendants de la tension et les intensités de fluorescence d'Anap. Pour la VFC à deux couleurs, sélectionnez le cube de filtres TMR en tournant la tourelle du cube. Lisez la fluorescence de fond pour TMR, comme décrit pour Anap, et enregistrez simultanément les courants dépendants de la tension et l'intensité de fluorescence TMR.

Cette figure affiche les signaux de fluorescence de l'Anap et du TMR obtenus à l'aide de protocoles en paliers à partir du même ovocyte exprimant un mutant de Shaker. En ajoutant une cystéine accessible à partir de la solution externe dans un fond génétique L382 stop W434F, puis en la marquant avec du maléimide de TMR, il est possible de sonder en temps réel les mouvements de différentes régions de la même protéine simultanément. La relation fluorescence-tension est obtenue en traçant l'intensité de fluorescence en régime permanent en fonction de la tension.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'exprimer des acides aminés non naturels fluorescents dans des ovocytes de Xenopus et de réaliser une fluorométrie à voltage fixe en une couleur ou deux couleurs. Une fois la technique maîtrisée, elle prend à peu près le même temps que les expériences traditionnelles d'électrophysiologie, à ceci près que vous devez ajouter l'étape supplémentaire d'injection d'ADN dans le noyau de l'ovocyte. Lorsque vous réalisez cette procédure, il est important de vous souvenir de vérifier l'expression de fuite en l'absence de l'acide aminé non naturel.

Cela doit être fait pour chaque mutation, car la quantité d'expression fuiteuse dépend du site d'insertion du codon d'arrêt au sein de la protéine. Cette technique permet désormais aux chercheurs d'étudier les changements conformationnels au niveau du site cytosolique de la protéine, où se produisent bon nombre des mécanismes de régulation.