Fluorométrie de tension-serre dans Xenopus Oocytes utilisant des acides aminés fluorescents non naturels

Cet article décrit une amélioration de la Fluorométrie conventionnelle en tension-clamp (VCF) où les acides aminés non naturels fluorescents (fUAA) sont utilisés à la place des colorants maléimidés, pour sondage des réarrangements structurels dans les canaux ioniques. La procédure comprend l'injection d'ADN ovocytaire de Xenopus, la co-injection d'ARN / fUAA et les mesures simultanées de courant et de fluorescence.

L’objectif global de cette procédure est d’introduire un acide aminé fluorescent non naturel dans une protéine membranaire exprimée dans les ovocytes de xénope et de déterminer simultanément la fonction et le réarrangement structurel de la protéine, à l’aide de la fluorométrie à pince de tension. Cette technique aidera à répondre à des questions clés dans le domaine des relations structure-fonction des protéines membranaires. En utilisant la fluorométrie à pince de tension, nous pouvons corréler directement les réarrangements structurels avec la fonction des protéines.

L’ajout d’un marquage fluorescent non naturel des acides aminés aide à surmonter les limitations précédentes de l’étiquetage. Il s’agissait autrefois de l’accessibilité des sites d’étiquetage ainsi que de l’étiquetage de fond dû aux sites de liaison endogènes. L’implication de cette technique s’étend vers une meilleure compréhension biophysique des protéines membranaires, car il est désormais possible de sonder des domaines, qui étaient auparavant inaccessibles avec la fluorométrie traditionnelle à pince de tension.

Après l’ablation chirurgicale des ovocytes de xénope, lavez les ovocytes trois fois avec une solution SOS. Sélectionnez des ovocytes volumineux et sains individuellement et incubez-les à 18 degrés Celsius pendant au moins quatre heures dans la solution de Barth complétée par des antibiotiques et 5 % de sérum de cheval avant l’injection. Pour l’injection nucléaire d’ADN, préparez un embout d’injection long et mince pour atteindre le noyau sans endommager les ovocytes.

Ensuite, remplissez l’embout d’injection avec de l’huile et montez l’embout d’injection sur le dispositif de nano-injecteur. Ensuite, installez le nanoinjecteur sous un stéréomicroscope et cassez l’extrémité de la pointe avec une pince. Après cela, éjectez l’huile jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de bulle d’air piégée à l’intérieur de l’extrémité de la pointe.

Ensuite, placez un microlitre de pAnap de 0,1 microgramme par microlitre dans de l’eau sans nucléase sur un morceau de Parafilm sous le stéréoscope, et remplissez l’embout d’injection avec de l’ADN. Ensuite, transférez les ovocytes dans une boîte d’injection contenant un filet contenant la solution de Barth complétée par des antibiotiques. Comme le noyau de l’ovocyte est situé dans le pôle animal, dirigez l’embout d’injection vers le centre du pôle animal et empalez de manière à ce que l’embout atteigne près du centre de l’hémisphère animal.

Ensuite, injectez 9,2 nanolitres de la solution pAnap dans le noyau de chaque ovocyte. Par la suite, incubez les ovocytes dans deux millilitres de la solution de Barth complétée par des antibiotiques et 5 % de sérum de cheval à 18 degrés Celsius pendant six à 24 heures pour permettre une expression robuste des ARNt et des ARNt synthétases spécifiques d’Anap. Maintenant, préparez à nouveau le nano-injecteur, mais cette fois, l’embout d’injection n’a pas besoin d’être aussi fin que celui de l’injection d’ADN.

Travaillez uniquement à la lumière rouge à partir de ce point pour éviter le photoblanchiment de l’Anap. Mélangez un microlitre d’Anap d’un millimolaire avec un microlitre d’un à deux microgrammes par microlitre d’ARNm directement sur un morceau de Parafilm, et remplissez l’embout d’injection avec la solution de mélange. Empalez l’extrémité dans le pôle végétal juste en dessous de la membrane et injectez 46 nanolitres de la solution de mélange dans chaque ovocyte injecté par pAnap.

Ensuite, protégez les ovocytes de la lumière en les plaçant dans une boîte étanche à la lumière ou en enveloppant le flacon dans du papier aluminium. Incuber-les dans la solution de Barth complétée par des antibiotiques et 5 % de sérum de cheval à 18 degrés Celsius pendant deux à trois jours. Remplacez-le par une solution fraîche de Barth tous les jours et retirez les ovocytes morts pour éviter toute contamination.

Dans cette configuration, l’équipement de pince de tension à ouverture coupée est intégré dans une configuration de microscopie à fluorescence. La chambre d’enregistrement est installée sur un curseur qui lui permet de se déplacer entre le stéréoscope standard pour le placement de l’ovocyte et le microscope pour effectuer des mesures de fluorescence. Un système de détection de photodiodes est connecté à l’orifice de sortie de la monture C du microscope à fluorescence, et la lecture du photocourant est connectée à un deuxième canal d’entrée dans le processeur de signal numérique.

Une lampe halogène de 100 watts, 12 volts est utilisée comme source lumineuse pour l’excitation de la fluorescence. L’excitation est contrôlée par un obturateur mécanique entre la source lumineuse d’excitation et le microscope. L’activation est déclenchée par une impulsion TTL provenant du processeur de signal numérique qui est chronométrée dans le logiciel d’enregistrement de telle sorte que l’obturateur s’ouvre environ 100 millisecondes avant le début de l’enregistrement, et un cube de filtre approprié est nécessaire dans la tourelle du cube de filtre.

Pour le VCF bicolore, incuber les ovocytes préparés dans du maléimide TMR à cinq micromolaires dans une solution d’étiquetage pendant 15 minutes immédiatement avant l’enregistrement. Ensuite, lavez les ovocytes avec la solution d’étiquetage trois fois pour éliminer l’excès de colorant avant l’enregistrement. À ce stade, la protéine est spécifiquement marquée avec deux fluorophores différents.

Après le montage de l’ovocyte, avec le pôle de l’animal vers le haut et perméabilisé, faites glisser la chambre vers le microscope et faites la mise au point sur l’ovocyte à l’aide d’un objectif 4X. Ensuite, empalez l’ovocyte avec une électrode V1 sensible à la tension. Ensuite, passez à l’objectif d’immersion dans l’eau 40X.

Concentrez-vous sur le mât de l’animal, qui est tourné vers le haut. Après cela, éteignez la lumière rouge. Sélectionnez le cube de filtre Anap en tournant la tourelle du cube de filtre et le port de sortie optique connecté à la photodiode.

Ensuite, allumez la lampe halogène à l’intensité la plus élevée et ouvrez l’obturateur pendant deux à cinq secondes pour lire l’intensité de fluorescence de fond provenant de l’ovocyte. Ensuite, allumez la pince, basculez l’interrupteur bain/protection sur actif et ajustez le potentiel de membrane au potentiel de commande en tournant le bouton sur le toit. Ensuite, sélectionnez le potentiel de maintien, le protocole de pas, le nombre et la durée des impulsions dans le logiciel d’enregistrement.

Ensuite, enregistrez les courants dépendants de la tension et les intensités de fluorescence Anap. Pour le VCF bicolore, sélectionnez le cube de filtre TMR en tournant la tourelle du cube. Lire la fluorescence de fond pour la RTM, comme décrit pour l’Anap, et enregistrer simultanément les courants dépendants de la tension et l’intensité de la fluorescence de la RTM.

Cette figure montre les signaux de fluorescence Anap et TMR à l’aide de protocoles d’étape obtenus à partir du même ovocyte exprimant un mutant Shaker. En ajoutant une cystéine, accessible à partir de la solution externe, dans le fond L382 stop W434F et en le marquant avec du maléimide TMR, il est possible de sonder simultanément les mouvements en temps réel dans différentes régions de la même protéine. La relation entre la tension de fluorescence est obtenue en traçant l’intensité de fluorescence à l’état stationnaire en fonction de la tension.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exprimer des acides aminés fluorescents non naturels dans les ovocytes de xénope et de la façon d’effectuer une fluorométrie à pince de tension unicolore ou bicolore. Une fois que vous maîtrisez la technique, cela devrait prendre à peu près le même temps que les expériences d’électrophysiologie traditionnelles, vous avez juste l’étape supplémentaire d’injecter de l’ADN dans le noyau de l’ovocyte. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de vérifier l’expression de la fuite en l’absence de l’acide aminé non naturel.

Cela doit être fait pour chaque mutation, car la quantité d’expression de la fuite dépend du site d’insertion du codon stop dans la protéine. Cette technique permet maintenant aux chercheurs d’étudier les changements de conformation sur le site cytosolique de la protéine, où se produisent de nombreux mécanismes de régulation.