Une nouvelle méthode pour modéliser l'encéphalopathie traumatique chronique dans Drosophila

L’objectif global de cette nouvelle procédure est d’infliger des lésions cérébrales traumatiques fermées chez la mouche des fruits, la drosophile, afin d’établir un nouveau modèle d’encéphalopathie traumatique chronique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’encéphalopathie traumatique chronique, telles que la façon dont le traumatisme répétitif induit la dégénérescence des neurones. Le principal avantage de cette technique est qu’elle délivre les impacts répétitifs de forces réglables directement à la tête de la mouche sans causer d’endommagement à d’autres parties du corps de l’animal.

La démonstration réelle de cette méthode est essentielle car l’assemblage de l’appareil et les étapes de chargement des mouches sont difficiles à apprendre, car la tête de la drosophile est si petite et il est important d’appliquer l’impact uniquement sur la tête. Pour fabriquer l’appareil utilisé pour commotionner ou frapper les mouches des fruits, il faut d’abord fabriquer la partie impacteur de l’appareil. Retirez le piston d’une seringue à tuberculine en polycarbonate d’un millilitre, puis coupez le canon au repère d’un millilitre.

Pour un impacteur, utilisez la barrière anti-aérosol trouvée sur une pointe de pipette de 200 microlitres. Cet impacteur doit mesurer trois millimètres de long et quatre millimètres de diamètre. Ensuite, placez l’impacteur dans le corps de la seringue avec le côté plat vers la buse.

Pour fournir de la force, fixez le corps de la seringue à un régulateur de débit de dioxyde de carbone. Le régulateur doit être équipé d’un interrupteur à bascule On Off et d’un bon contrôle du débit de gaz. Ensuite, fixez le canon verticalement à un support en fer, de sorte que l’impacteur tombe au fond du canon.

Ensuite, fabriquez le porte-mouche. Commencez avec une pointe de pipette de 200 microlitres. Coupez la pointe de la pipette à cinq millimètres de la petite extrémité pour faire une ouverture de 8 millimètres de diamètre.

Une tête de mouche passera par ce trou, mais pas le thorax. Enfin, faites un pour le porte-mouche et le dispositif d’impact. Tout d’abord, coupez une pointe de pipette d’un millilitre à 44 millimètres de la petite ouverture.

Deuxièmement, coupez une longueur de six millimètres à partir du couvercle de l’aiguille pour une seringue d’un millilitre. Ensuite, poussez les deux ensemble. Anesthésie une seule mouche femelle adulte de deux jours à l’aide de dioxyde de carbone.

À partir du tampon à dioxyde de carbone, utilisez une brosse fine pour transférer doucement la mouche dans le support. Ensuite, tapotez doucement le support jusqu’à ce que la tête dépasse de la pointe. De la trompe est exposée, utilisez une aiguille de seringue émoussée d’un millilitre pour la rentrer doucement à l’intérieur de l’extrémité.

Il est essentiel de garder le corps de la mouche, en particulier la partie buccale, à l’intérieur du support. Sinon, la mouche peut mourir d’endommagement des organes internes ou de l’impossibilité d’ingérer de la nourriture. Ensuite, réglez la pression du gaz sur 100 kilopascals et ajustez le débit si nécessaire.

Une fois la mouche chargée, serrez le support sur le corps de la seringue à l’aide du connecteur, de sorte que la tête de la mouche soit tournée vers le bas. Ensuite, à l’aide de l’interrupteur à bascule, envoyez une rafale de gaz qui déplace l’impacteur pour frapper la mouche une seule fois. Maintenant, détachez le porte-mouche et reversez la mouche sur le tampon de dioxyde de carbone.

Brossez la mouche dans un flacon vide jusqu’à ce qu’elle se rétablisse. Conservez une mouche par flacon. La récupération ne prend que quelques minutes.

Répétez le processus pour tester quatre mouches par groupe expérimental. Le traitement de deux groupes, un test et un simulacre, ne devrait prendre que 20 à 30 minutes. Traitez les couvre-oreillers comme des animaux de laboratoire, sauf qu’il n’y a pas de barrière anti-aérosol dans le tube de l’impacteur.

Pour suivre les mouvements des mouches dans une boîte de Pétri, remplissez d’abord une boîte de six centimètres avec de l’élastomère de silicium transparent pour créer l’arène de suivi. Laissez un espace de trois millimètres entre le silicone et le couvercle afin que les mouches puissent se promener librement dans l’espace, mais pas s’envoler. Sous l’arène de pistage, ayez un fond blanc.

Ensuite, anesthésez quatre mouches du même groupe de traitement et placez-les dans l’arène. Laissez les mouches s’acclimater pendant une heure à l’arène, qui doit être entièrement éclairée et à environ 22 degrés Celsius. Pas plus chaud que la température ambiante.

Après une heure, utilisez une caméra à dispositif à couplage de charge positionnée au-dessus de l’arène pour enregistrer l’activité de la mouche pendant cinq minutes. Après l’enregistrement de cinq minutes, anesthésez les mouches dans l’arène et remettez-les dans une nouvelle fiole de maison. Ensuite, débarrassez-vous de l’arène.

Plus tard, analysez les enregistrements à l’aide du logiciel Ctrax disponible gratuitement. Ce logiciel génère des données de suivi, qui peuvent être exportées dans un format compatible avec un langage programmable, tel que le format MATLAB. À partir des données, calculez la distance parcourue par image, la distance de marche moyenne pour chaque mouche et la distance moyenne parcourue par mouche.

Pour une signification statistique, attendez-vous à tester environ 100 mouches par groupe de traitement. Pour établir un modèle d’encéphalopathie traumatique chronique, l’efficacité d’une seule blessure à la tête fermée causée par l’appareil d’impact à différentes vitesses a été analysée à l’aide de femelles Canton-S âgées de deux jours. La pression du gaz a été maintenue à 100 kilopascals.

Les mouches exposées à un seul coup au débit testé le plus élevé présentaient des défauts externes minimes. Bien qu’il n’y ait aucune preuve claire de dommages externes, les blessures à un débit de 15 litres par minute étaient extrêmement mortelles, entraînant un taux de survie inférieur à 10 % dans les 24 heures. Le taux de survie augmentait avec des débits plus faibles.

La survie à cent pour cent a été atteinte à cinq litres par minute ou moins, de sorte que cinq litres par minute ont été choisis comme norme pour le modèle. Juste après avoir été frappées, les mouches ont progressivement retrouvé leur mobilité en quatre minutes. La récupération des simulacres a été environ une minute plus rapide.

Après l’impact, le suivi vidéo des mouvements a été utilisé pour mesurer le fonctionnement de la locomotive. Au cours des deux jours qui ont suivi l’impact, la locomotion est lentement revenue à la normale. Cette preuve d’une récupération progressive est conforme à la récupération de l’ETC chez l’homme.

Pour évaluer les effets à long terme, un protocole de lésions cérébrales traumatiques répétitives de cinq coups sur cinq jours a été appliqué. Vingt jours après le traitement, la locomotion des membres survivants de chaque groupe a été comparée et le groupe traité a clairement moins marché. La durée de vie du groupe traité a également été considérablement réduite, avec une médiane de 26 jours contre 37 jours pour les témoins.

Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine des lésions cérébrales traumatiques répétitives légères pour explorer les mécanismes pathogènes chez le modèle animal classique Drosophila melanogaster. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de protéger le proboscis, le thorax et l’abdomen de l’impact direct de la barrière aérosol