Name: Extraction et purification des polyphénols à partir de la poudre de baies lyophilisée pour le traitement des cellules musculaires lisses vasculaires In Vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Apprenez l'extraction et la purification des polyphénols à partir de baies lyophilisées par ultrasons et solvants organiques. Cette méthode permet d'étudier leurs effets cardioprotecteurs sur les cellules musculaires lisses vasculaires.

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Ce travail a été financé par l&#39;American Heart Association (14GRNT20180028) et le Florida State University Council on Research and Creativity (COFRS).

1. Préparation des réactifs <ol><li> Préparez 80% d&#39;éthanol (100 mL) en mélangeant 80 mL d&#39;éthanol absolu (biologie moléculaire) et 20 mL d&#39;eau stérile de culture cellulaire. </li><li> Pour préparer l&#39;extrait de polyphénol (10 mg / mL), pesez 10 mg de CE ou de PE. Ajouter 1 ml de milieu d&#39;Eagle modifié Modifié Dulbecco (DMEM) sous un capot de culture cellulaire. Vortex la solution. Aliquote dans des portions de 200 μL et stockez à -20 ° C. </li><li> Préparer le tampon de lyse. <ol><li> Ajouter 5 ml d&#39;une solution mère HEPES 1 M (pH 7,4, finale 50 mM), 1 ml d&#39;une solution mère NaCl 5 M (finale 50 mM), 1 ml d&#39;une solution mère EDT 0,5 M (finale 5 mM), 2 ml de 0,5 M NaF stock solution (10 mM finale), 286 μL de solution mère de Na 3 VO 4 700 mM (2 mM de finale), 5 ml d&#39;une solution mère de Na4P2O7 200 mM (10 mM de finale) et 5 ml de 20% de solution mère Triton-X-100 préparée dans l&#39;eau (1% finale). Ajouter de l&#39;eau pour atteindre un volume de 100 ml. Conserver à 4 ° C. </li><lI&gt; Ajoutez 10 μL / mL de cocktail inhibiteur de protéase. Ajouter frais lorsque les cellules sont prêtes pour la lyse. </li></ol></li><li> Préparer le tampon d&#39;échantillon de Laemmli (4x). <ol><li> Ajouter 31,25 ml de solution mère Tris 2 M (pH 6,8), 100 ml de glycerol, 50 ml d&#39;une solution à 20% de sulfate de sodium et de sodium (SDS) préparée dans de l&#39;eau et 50 ml de β-mercaptoéthanol. Ajouter de l&#39;eau jusqu&#39;à 250 ml. Conserver à 4 ° C. </li></ol></li><li> Pour préparer un tampon salin tamponné au Tris (TBS), pesez 3 g de Tris (25 mM final), 0,18 g de KCl (2,5 mM finale) et 8,76 g de NaCl (150 mM finale). Réglez le pH à 7,4 et ajoutez de l&#39;eau jusqu&#39;à 1 L. Conserver à la température ambiante. </li><li> Pour préparer TBS-T, ajouter 997,5 ml de TBS et 2,5 ml d&#39;une solution à 20% de Triton-X-100 préparée dans de l&#39;eau. Garder à la RT. </li></ol> 2. Préparation des extraits de Blackerry <ol><li> Préparation de l&#39;extrait brut de la poudre de baies lyophilisée. <ol><li> Peser 10 g de poudre de mûre lyophilisée (ou 5 g de poudre fraîche). Si des fruits surgelés sont utilisés, coupez-leÀ de très petits morceaux avant de commencer l&#39;extraction. </li><li> Mélangez la poudre de fruit avec 100 ml d&#39;éthanol aqueux à 80% dans une fiole Erlenmeyer à fond rond de 1 L. </li><li> Sonicate le mélange pendant 20 min à 42 kHz, 135 W en utilisant un bain à ultrasons à 25 ° C, sans intervalle de temps entre les deux. Effectuez la sonication avec une purge continue d&#39;azote en lumière modérée. Pour les fruits surgelés, augmenter le temps d&#39;incubation à 4 h. </li><li> Filtrer le mélange à travers un papier filtrant n ° 2 à l&#39;aide d&#39;un entonnoir Buchner refroidi avec aspiration sous vide. REMARQUE: à la fin de cette étape, les résidus de l&#39;échantillon apparaissent sur le papier filtre; C&#39;est ce qu&#39;on appelle le gâteau de filtre. </li><li> Rincer le gâteau de filtration avec 50 ml d&#39;éthanol à 100%. Enregistrer le filtrat et ajouter le gâteau de filtre dans un ballon à fond rond de 1 L contenant 100 ml d&#39;éthanol aqueux à 80%. </li><li> Répétez le processus d&#39;extraction du résidu (étapes 2.1.2 - 2.1.4). </li><li> Mélanger les deux filtrats dans un ballon à fond rond avec 50 ml supplémentairesD&#39;éthanol aqueux à 80%. REMARQUE: Le volume final devrait être d&#39;environ 300 mL. </li><li> Utilisez un évaporateur rotatif à 62 ° C et 50 tr / min pour évaporer le solvant. Continuez ce processus jusqu&#39;à ce que l&#39;éthanol ne s&#39;évapore plus. REMARQUE: ce processus dure environ 45 minutes. </li><li> Transférer l&#39;échantillon dans un tube conique de 50 ml. Evaporer l&#39;éthanol en injectant de l&#39;azote gazeux au sommet du tube pendant 10 min. REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour assurer l&#39;évaporation complète de l&#39;éthanol. Le volume de l&#39;échantillon à cette étape est d&#39;environ 20 ml. </li><li> Geler l&#39;échantillon à -80 ° C pendant au moins 24 h. REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour permettre un processus de lyophilisation plus efficace. </li><li> Sécher l&#39;échantillon à -50 ° C pendant environ 8 h. Stockez les échantillons à -20 ° C. REMARQUE: Le séchoir à glaçons crée un vide puissant à -50 ° C à l&#39;intérieur de la chambre pour sécher les échantillons mais conserve la plupart des composés, tels que le polypheNols. </li></ol></li><li> Préparation d&#39;extraits de polyphénols purifiés à partir d&#39;extraits bruts. <ol><li> Peser les échantillons prélevés par lyophilisation. REMARQUE: Le volume de l&#39;extrait à cette étape est d&#39;environ 10 mL. </li><li> Ajouter deux volumes (~ 20 mL) de chloroforme à l&#39;extrait brut et agiter la solution pendant 5 minutes dans une plaque d&#39;agitation. </li><li> Verser le mélange dans un entonnoir de séparation. Laissez l&#39;extrait brut décanter pendant 1 h à la température ambiante pour obtenir la fraction purifiée. REMARQUE: à cette étape, un mélange en deux phases se formera. </li><li> Jeter la couche inférieure (phase chloroforme) de l&#39;entonnoir de séparation et collecter la couche aqueuse dans un bécher propre. </li><li> Ajouter deux volumes d&#39;acétate d&#39;éthyle à la fraction aqueuse et utiliser une barre d&#39;agitation magnétique pour agiter le mélange pendant 5 min à la température ambiante. </li><li> Filtrer le mélange à travers du papier filtre n ° 2 à l&#39;aide d&#39;un entonnoir Buchner refroidi avec aspiration sous vide. </li><li> Recueillir l&#39;échantillon filtré et le transférer dans un ballon à fond rond pour être nousAvec l&#39;évaporateur rotatif. </li><li> Mettre l&#39;évaporateur rotatif à 62 ° C et à 50 tr / min et évaporer l&#39;acétate d&#39;éthyle pendant environ 30 minutes. </li><li> Sécher l&#39;échantillon à -50 ° C pendant environ 8 h. Transférer l&#39;échantillon dans un tube conique de 50 ml et le conserver à -20 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Traitement des VSMC avec des extraits de baies <ol><li> La culture des VSMC. <ol><li> Isoler les VSMC des aortas thoraciques des rats Sprague-Dawley en effectuant une digestion enzymatique, comme décrit précédemment 29 . Culturez les VSMC comme décrit 29 . </li><li> Préparer un milieu complet pour la culture de VSMC en utilisant du DMEM contenant 1 g / L de glucose et supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / mL de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine. Conserver le milieu complet à 4 ° C. </li></ol></li><li> Incubation de VSMC avec des extraits de polyphénols. <ol><li> Pour diviser les VSMC, jeter le cultuRe medium et lave les cellules deux fois avec une solution salée tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 4 mL de PBS et 2 mL de trypsine EDTA 0,25%. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C dans un incubateur de CO 2 . <ol><li> Recueillir les cellules, les mélanger avec 2 ml de milieu complet dans un tube de centrifugation de 15 ml et centrifuger à 1 100 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 ml de PBS. Comptez les cellules en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Graine 50 000 VSMC par puits dans des plaques de culture à 6 puits et développez-les en milieu complet contenant 10% de FBS jusqu&#39;à atteindre 90% de confluence (environ 3 jours). Maintenir les VSMC à 37 ° C dans un incubateur humidifié à 5% de CO 2 . </li></ol></li><li> Préparer le milieu pour le traitement en utilisant un milieu DMEM contenant 1 g / L de glucose, 100 U / mL de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 0,5% de FBS. Conserver le milieu de traitement à 4 ° C. REMARQUE: Les extraits de polyphénols et Ang II sont ajoutés directement aux cellules en utilisant ce moiDium. </li><li> Préparez une solution mère d&#39;extrait brut (CE) de 10 mg / ml ou d&#39;extrait purifié (PE) de polyphénols en dissolvant 10 mg d&#39;extrait dans 1 mL de milieu DMEM ordinaire. Conserver le stock dans des aliquotes de 200 μL à -20 ° C. </li><li> Incuber les VSMC avec 2 mL de milieu de traitement contenant 0,5% de FBS et ajouter des extraits CE ou PE pour obtenir une concentration de 50 à 500 μg / mL. Changer le milieu toutes les 24 h en ajoutant des extraits de polyphénols frais. Traiter les cellules pendant 3 jours. </li><li> Pour le traitement avec Ang II ou d&#39;autres hormones et facteurs de croissance, affamer les cellules pendant au moins 24 h en incubant les cellules avec un milieu de traitement contenant 0,5% de FBS avant l&#39;addition d&#39;Ang II (100 nM). NOTE: L&#39;incubation avec et sans CE et PE dans un milieu de traitement FBS à 0,5% avant l&#39;addition d&#39;Ang II est recommandée. <ol><li> Après 24 h de famine, ajouter 100 nM Ang II. Remplacez le milieu de traitement par CE, PE ou Ang II frais toutes les 24 h pendant 3 jours. </li></ol></li></ol></li><li> Préparation des échantillons de cellules. <ol><li> Lavez les cellules traitées deux fois dans du PBS froid et lysez-les avec 200 μL de tampon de lyse sur de la glace. </li><li> Recueillir des lysats cellulaires à l&#39;aide de grattoirs cellulaires et transférer les lysats dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Incuber les lysats cellulaires totaux pendant 20 min sur de la glace et du vortex toutes les 5 min. </li><li> Sonicate les extraits de cellules avec trois rafales à 125 W pendant 10 s chacune, avec une pause de 2 s entre les deux. Gardez les échantillons sur de la glace tout au long de la sonication. </li><li> Mesurer la concentration de protéines en utilisant un réactif de dosage de protéines à 595 nm. </li><li> Conservez les échantillons à -20 ° C pour analyse par Western blot. </li></ol></li><li> Western blot. <ol><li> Mélanger des quantités égales de protéines (environ 50 μg) à partir d&#39;échantillons traités non traités et traités avec des polyphénols ou Ang II avec un tampon de lyse pour obtenir un volume total maximal de 50 μL. Ajouter 16 μL d&#39;un tampon d&#39;échantillon 4x Laemmli. Chauffer les échantillons pendant 5 min à 75 ° C. </li><li> Séparer l&#39;échantillonnageEs dans 10% de gels SDS-PAGE et les transférer dans des membranes PDVF à 10 V pendant 75 minutes dans un système de transfert semi-sec pour une analyse Western Blot avec des anticorps spécifiques. </li><li> Bloquer la membrane avec 2% de lait dans du tampon Triton-X100 à 0,05% de TBS (TBS-T) pendant 20 minutes. </li><li> Retirer le lait en lavant la membrane au moins trois fois avec du TBS (5 min chacun) et incuber avec des anticorps primaires pendant 1 h à TA ou O / N à 4 ° C. </li><li> Laver la membrane trois fois, 10 min chacune, avec TBS-T et incuber avec un anticorps secondaire lié à HRP pendant 45 minutes. </li><li> Laver la membrane trois fois, 10 min chacune, avec TBS-T et se développer par une chimioluminescence améliorée (ECL). </li></ol></li></ol>

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<li>Kim, D. O., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471142913.fai0102s06/abstract">Extraction and Isolation of Polyphenolics.</a> Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, John Wiley & Sons. New York. 2.1-2.12 (2002).</li>
<li>Queires, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenols+purified+from+the+Brazilian+aroeira+plant+%28Schinus+terebinthifolius%2C+Raddi%29+induce+apoptotic+and+autophagic+cell+death+of+DU145+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells.</a> Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).</li>
<li>Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+phosphatidylinositol-specific+phospholipase+C+from+cultured+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells.</a> J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).</li>
<li>Vuong, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+polyphenol-enriched+preparation+on+chemoprevention+of+mammary+carcinoma+through+cancer+stem+cells+and+inflammatory+pathways+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation.</a> J Transl Med. 14, (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les polyphénols isolés des baies contiennent des compositions distinctes. Le protocole d&#39;extraction à base d&#39;éthanol décrit ici a permis d&#39;identifier différents niveaux d&#39;acides phénoliques et de flavonoïdes présents dans des extraits de polyphénols bruts et purifiés de BL ( Tableau 1 ). CE a été enrichi en acide gallic, en acide ferulique, en acide 4-O-caffeoylquinique et en acide 5-O-caffeoylquinique. Le processus de purification n&#39;a pas modifié de manière significative les niveaux...

Les polyphénols sont des composés contenant au moins un anneau phénolique dans leur structure et sont abondamment présents dans le règne végétal 1 . Les humains ont consommé des plantes pendant des millénaires à des fins médicales sans connaître l&#39;existence de tels composés 2 . Beaucoup de fruits et légumes ont des composés polyphénoliques partagés, bien qu&#39;avec des quantités différentes, y compris les flavonoïdes, les stilbènes et les acides phénoliques 3 . Bien que les polyphénols soient souvent associés à des fruits et légumes colorés, cela n&#39;est pas strictement vrai. Par exemple, la zéaxanthine et la xanthine sont présentes dans les légumes qui ne sont pas très colorés, comme les oignons et l&#39;ail, qui proviennent de la famille des écrevisses et sont associés à de nombreux avantages pour la santé 4 . En plus d&#39;être associé à plusieurs avantages pour la santé 5 , les polyphénols servent également les plantes en les protégeant des insectes etD rayonnement ultraviolet 2 . Les polyphénols sont couramment présents dans l&#39;alimentation humaine et sont considérés comme des antioxydants puissants, car ils peuvent éliminer les espèces d&#39;oxygène réactif (ROS) 6 , 7 , 8 . Ils ont également des propriétés anti-inflammatoires 9 , antimicrobiennes 10 , anti-hypertensives 11 et anti-cancérogènes 12 , 13 . Les études épidémiologiques démontrent une association inverse entre la consommation de flavonoïdes et l&#39;incidence des maladies cardiovasculaires (MCV) 16 , 17 et la mortalité 14 , 15 . Les baies sont largement consommés aux États-Unis et ont une grande quantité de polyphénols, y compris les flavonoïdes. Par exemple, la consommation de jus de mûre (BL) (300<html> ML / d) pendant huit semaines a diminué de manière significative la tension artérielle systolique chez les patients dyslipidémiques 18 . Jeong et al. 19 ont rapporté que les hommes et les femmes pré-hypertendus consommant 2,5 g d&#39;extrait de framboise noire (BRB) par jour avaient une pression artérielle inférieure de 24 h et une nuit par rapport à ceux qui consommaient un placebo. Les framboises (RB) ont diminué la tension artérielle tout en augmentant l&#39;expression de la superoxyde dismutase (SOD) chez les rats spontanément hypertendus 20 . Il a récemment été démontré que BL, RB et BRB réduisent les niveaux de ROS et de sénescence induite par l&#39;angiotensine II (Ang II) dans les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) 21 . De plus, la fraction anthocyanique de l&#39;extrait BL a réduit l&#39;expression de l&#39;oxyde nitrique synthase inducible (iNOS) et a inhibé l&#39;activité du facteur nucléaire kappa B (NF-kB) et de la kinase extracellulaire régulée par le signal (ERK) dans le lipopolysaccharide (LPS) - stimulée Cellules J774Ass = &quot;xref&quot;&gt; 22. Les extraits de BRB ont diminué l&#39;activation NF-κB et l&#39;expression de la cyclooxygénase 2 (COX-2) in vitro 23 , amélioré le profil lipidique et empêché la formation de la lésion de l&#39;athérosclérose chez des souris nourries avec un régime riche en matières grasses 24 . Les anthocyanines, qui sont considérées comme les flavonoïdes les plus abondants dans les baies, modulent la réponse inflammatoire dans les macrophages RAW 264.7 stimulés par le LPS en diminuant la production de facteur 25 de nécrose tumorale (TNF-α) 25 et en diminuant la prolifération et la migration des VSMC 26 . Étant donné qu&#39;il y a eu un intérêt grandissant à comprendre le rôle des polyphénols dans la santé humaine et les maladies, il est important d&#39;optimiser la méthode d&#39;extraction. L&#39;extraction par solvants est largement utilisée à cette fin, car elle est rentable et facilement reproductible. Dans cette étude, une extraction par solvant a été utilisée avec de l&#39;éthanol, avec une extraction assistée par ultrasonsN méthode, qui a été adaptée de Kim et Lee 27 . La purification et le fractionnement des extraits bruts (CE) à l&#39;aide de chloroforme et d&#39;acétate d&#39;éthyle ont été réalisés pour obtenir la fraction d&#39;extrait purifié (PE) adaptée de Queires et al 28 . En outre, on a comparé l&#39;efficacité des extraits de polyphénols bruts versus purifiés de BL pour réduire la phosphorylation basale de ERK1 / 2 et des exemples représentatifs de l&#39;effet inhibiteur de l&#39;extrait de polyphénol BL purifié sur les réductions de signalisation induites par Ang II dans les VSMC ont été fournis.

<table><tbody><tr><td>Angiotensine II</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A9525-10MG</td><td>Traitement des VSMCs</td></tr><tr><td>&bêta ;-actine</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A2228</td><td>Anticorps primaire (1:5000)</td></tr><tr><td>Mûre</td><td>Mercer Foods</td><td></td><td>Poudre de mûre lyophilisée</td></tr><tr><td>Catalase&nbsp ;</td><td>Calbiochem</td><td>219010</td><td>Anticorps primaire (1:1000)</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Biotech Grd, Inc.</td><td>97064-678</td><td>Préparation d’extraits de polyphénols purifiés</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM )</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-014-CV</td><td>Culture d’éthanol VSMC</td></tr><tr><td>(grade absolu de biologie moléculaire)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>E7023-500ML</td><td>Préparation des extraits de polyphénols</td></tr><tr><td>Acétate d’éthyle</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>439169</td><td>Préparation d’extraits de polyphénols purifiés</td></tr><tr><td>ERK1/2</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>9102S</td><td>Anticorps primaire (1:500)</td></tr><tr><td>EDTA, 500 mM, pH 8,0</td><td>Teknova, Inc.</td><td>E0306</td><td>Tampon</td></tr> de <tr><td>lyse Lyophilisateur</td><td>Labconco</td><td>VirTis Benchtop K</td><td>Préparation d’extraits de polyphénols</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1400-500</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>H3375</td><td>Tampon de lyse&nbsp ;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>EMD Millipore, Inc.</td><td>7760</td><td>Tampon de lyse</td></tr><tr><td>NaF</td><td>J.T.Baker, Inc.</td><td>3688-01&nbsp ;</td><td>Tampon de lyse</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>450243</td><td>Tampon de lyse</td></tr><tr><td>Na4P2O7 , décahydrate</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>S-9515</td><td>Tampon de lyse</td></tr><tr><td>phospho ERK1/2&nbsp ;</td><td>Technologie de signalisation cellulaire, Inc.</td><td>9101S</td><td>Anticorps primaire (1:1000)</td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>P8340-5ml</td><td>Tampon de lyse</td></tr><tr><td>Réactif de colorant pour dosage de protéines</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>500-0006</td><td>Mesure de la concentration en protéines</td></tr><tr><td>Membrane de transfert PVDF</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td><td>88518</td><td>Western blots</td></tr><tr><td>Évaporateur rotatif</td><td>Buchi Labortechnik</td><td>Rotavapor R3000</td><td>Préparation d’extraits de polyphénols</td></tr><tr><td>Eau stérile</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-055-CV</td><td>Préparation d’extraits de polyphénols</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>QSonica, LLC</td><td>Q125</td><td>Préparation d’extraits cellulaires</td></tr><tr><td>SOD2</td><td>Enzo Life Sciences, Inc.</td><td>ADI-SOD-110-F</td><td>Anticorps primaire (1:1000)</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>X100</td><td>Western blots</td></tr><tr><td>Whatman #2 papier filtre</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>28317-241</td><td>Préparation des extraits de polyphénols</td></tr></tbody></table>

extraction et purification des polyphénols à partir de la poudre de baies lyophilisée pour le traitement des cellules musculaires lisses vasculaires<em&gt; in vitro</em

Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro

Des études épidémiologiques indiquent que l&#39;augmentation de la consommation de flavonoïdes est en corrélation avec la diminution de la mortalité due aux maladies cardiovasculaires (ECV) aux États-Unis (États-Unis) et en Europe. Les baies sont largement consommés aux États-Unis et ont un contenu polyphénolique élevé. On a montré que les polyphénols interagissent avec de nombreuses cibles moléculaires et exercent de nombreuses fonctions biologiques positives, y compris les effets antioxydants, anti-inflammatoires et cardioprotecteurs. Les polyphénols isolés de la mûre (BL), de la framboise (RB) et de la framboise noire (BRB) réduisent le stress oxydatif et la sénescence cellulaire en réponse à l&#39;angiotensine II (Ang II). Ce travail fournit une description détaillée du protocole utilisé pour préparer les extraits de polyphénols à partir de baies lyophilisées. Les extractions de polyphénols à partir de poudre de baies lyophilisées ont été réalisées en utilisant de l&#39;éthanol aqueux à 80% et un procédé d&#39;extraction assisté par ultrasons. L&#39;extrait brut a été encore purifié et fractionné en utilisant du chloroforme et de l&#39;acétate d&#39;éthyle,respectivement. Les effets des extraits bruts et purifiés ont été testés sur des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) en culture.

On a déjà démontré que les extraits de polyphénols isolés de BL, RB et BRB réduisaient la sénescence des VSMC en réponse à Ang II 21 . Il a été démontré que ces extraits de polyphénols purifiés modulent la signalisation Ang II en réduisant la phosphorylation d&#39;Akt, de la protéine Kinase Activée par Mitogen (MAPK) et de l&#39;ERK1 / 2. BL empêche la sénescence en réduisant l&#39;expression de la NADPH oxydase (Nox) 1, une enzyme qui produit des anions superoxyd...

Ce travail détaille une méthode étape par étape pour préparer des extraits riches en polyphénols à partir de poudres de baies lyophilisées. En outre, il fournit une description détaillée de la façon d&#39;utiliser ces extraits riches en polyphénols dans la culture cellulaire en présence de l&#39;hormone peptidique angiotensine II (Ang II) à l&#39;aide de cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC).

Extraction et purification des polyphénols à partir de la poudre de baies lyophilisée pour le traitement des cellules musculaires lisses vasculaires<em&gt; In Vitro</em

Epidemiological studies indicate that increased flavonoid intake correlates with decreased mortality due to cardiovascular diseases (CVD) in the United ...

L'objectif général de ce protocole est de fournir une méthode simple et reproductible pour l'extraction et la purification des polyphénols végétaux pouvant être utilisés pour traiter des cellules à l'avenir. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le rôle des aliments dans la santé humaine et les maladies. Cette extraction des polyphénols basée sur l'éthanol et assistée par ultrasons est une méthode facile et reproductible qui permet d'obtenir un rendement plus élevé en polyphénols.L'utilisation du chloroforme permet d'éliminer les sucres, les acides gras, les protéines et d'autres molécules, tandis que l'acétate d'éthyle permet la fractionnement des polyphénols. Ces extraits concentrés de polyphénols peuvent ensuite être utilisés in vitro et in vivo pour étudier les effets des polyphénols ainsi que leurs mécanismes d'action sur divers tissus, notamment le système cardiovasculaire, comme décrit ici. Pour commencer cette procédure, préparez les réactifs conformément au protocole décrit dans le texte.Ensuite, peser 10 grammes de poudre de mûre lyophilisée. Ajouter la poudre de baies à un ballon rond d’un litre contenant 100 millilitres d’éthanol aqueux à 80 %. Placer le ballon dans un bain ultrasonique à 25 degrés Celsius.Sous un courant continu d'azote et à l'abri de la lumière, soniquer le mélange pendant 20 minutes à 42 kilohertz et 135 watts. Ensuite, filtrer le mélange à l’aide d’un entonnoir Büchner refroidi et d’une aspiration sous vide à travers un papier filtre numéro 2. Rincer le gâteau de filtration avec 50 millilitres d’éthanol à 100 %.Conserver le filtrat et ajouter le gâteau de filtration à un ballon rond d’un litre contenant 100 millilitres d’éthanol aqueux à 80 %. Ensuite, répéter le processus d’extraction en soumettant le mélange à une sonication, puis en le filtrant et en le lavant. Combiner les deux filtrats dans un ballon rond contenant 50 millilitres d’éthanol aqueux à 80 %.À l’aide d’un évaporateur rotatif à 62 degrés Celsius et 50 tr/min, évaporer le solvant. Poursuivre jusqu’à ce que l’éthanol cesse de s’évaporer. Ensuite, transférer l’échantillon dans un tube conique de 50 millilitres.Injecter du gaz azote par le haut du tube pendant 10 minutes afin d'évaporer tout éthanol résiduel. Congeler l'échantillon à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 24 heures. Ensuite, lyophiliser l'échantillon à moins 50 degrés Celsius pendant environ huit heures.Conserver les échantillons à moins 20 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation. Pour commencer, peser les échantillons extraits lyophilisés. Ajouter environ 20 millilitres de chloroforme dans un bécher de 100 millilitres contenant l'échantillon.À l’aide d’un agitateur magnétique, mélanger la solution pendant cinq minutes. Ensuite, verser le mélange dans une ampoule à décanter. Laisser décanter l’extrait brut pendant une heure à température ambiante.Après cela, éliminez la couche inférieure et récupérez la couche aqueuse dans un bécher propre. Ajoutez deux volumes d'acétate d'éthyle dans le bécher. À l'aide d'un barreau aimanté, agitez le mélange pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, utilisez un entonnoir de Büchner refroidi avec aspiration sous vide pour filtrer le mélange à travers du papier filtre numéro deux. Transférez l'échantillon filtré dans un ballon à fond rond. À l'aide d'un évaporateur rotatif à 62 degrés Celsius et 50 tr/min, évaporez l'acétate d'éthyle pendant 30 minutes.Après cela, lyophilisez l'échantillon à moins 50 degrés Celsius pendant huit heures. Transférez l'échantillon dans un tube conique de 50 millilitres et conservez-le à moins 20 degrés Celsius jusqu'à son utilisation. Après la culture des cellules musculaires lisses vasculaires, jetez le milieu de culture et lavez les cellules deux fois avec du tampon phosphate salin.Ensuite, ajoutez quatre millilitres de PBS et deux millilitres de trypsine-EDTA à 0,25 %. Incubez dans une étuve à dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cela, transférez les cellules dans un tube de centrifugation de 15 millilitres contenant deux millilitres de milieu complet.Centrifuger à 1 100 ×g pendant cinq minutes. Éliminer le surnageant et re-suspendre le culot cellulaire avec un millilitre de PBS. À l’aide d’un hématimètre, dénombrer les cellules.Ensuite, dans des plaques de culture à six puits, ensemencer 50 000 cellules par puits. Faire croître les cellules jusqu'à une confluence de 90 % dans un milieu complet contenant 10 % de sérum de veau fœtal. Préparer le milieu de traitement comme indiqué dans le protocole écrit et le conserver à quatre degrés Celsius.Ensuite, ajoutez 10 milligrammes d'extrait brut ou purifié à un millilitre de DMEM simple pour préparer une solution mère à 10 milligrammes par millilitre. Conservez la solution mère en aliquotes de 200 microlitres à moins 20 degrés Celsius. Après cela, ajoutez deux millilitres de milieu de traitement, contenant 0,5 % de sérum de veau fœtal et la concentration souhaitée de la solution mère, aux cellules.Incuber pendant trois jours à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2. Ensuite, si un traitement par des hormones ou des facteurs de croissance est prévu, priver les cellules de sérum pendant au moins 24 heures en les incubant dans un milieu de traitement contenant 0,5 % de sérum de veau fœtal. Après cette privation, ajouter l'hormone souhaitée, en remplaçant le milieu de traitement toutes les 24 heures pendant trois jours, comme décrit dans le protocole écrit.Ensuite, laver les cellules traitées deux fois dans du PBS froid. Lysar les cellules en utilisant 200 microlitres de tampon de lyse sur de la glace. À l’aide de grattoirs à cellules, recueillir le lysat cellulaire et le transférer dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.Incuber le lysat recueilli pendant 20 minutes sur de la glace, en vortexant toutes les cinq minutes. Ensuite, soniquer les extraits cellulaires selon trois impulsions de 10 secondes chacune à 125 watts, avec une pause de deux secondes entre chaque impulsion. À l'aide d'un réactif de dosage des protéines à 595 nanomètres, mesurer la concentration en protéines.Mélanger 50 microgrammes de protéine avec du tampon de lyse pour obtenir un volume total maximal de 50 microlitres. Ajouter 16 microlitres d'un tampon d'échantillonnage Laemmli 4x. Ensuite, chauffer les échantillons cinq minutes à 75 degrés Celsius.Séparer les échantillons sur des gels SDS-PAGE à 10 % et transférer sur des membranes en PVDF pour une analyse par immunoblot avec des anticorps spécifiques. Dans cette étude, une extraction à base d'éthanol est utilisée afin d'identifier les différents niveaux d'acides phénoliques et de flavonoïdes présents dans des extraits bruts et purifiés de polyphénols de mûre. Bien que le processus de purification n'ait pas modifié de manière significative les concentrations d'acide gallique ou d'acide p-coumarique, il a augmenté celles de l'acide 3-O-cafféoylquinique, passant de 170,5 à 235,3 ppm, ainsi que celles de la quercétine, passant de 24,5 à 95 ppm.En revanche, l'acide férulique et la rutine ont été perdus lors de la purification de l'extrait brut. Après l'extraction, les cellules musculaires lisses vasculaires ont été incubées pendant trois jours dans un milieu contenant 0,5 % de sérum bovin fœtal, additionné de 50 à 500 microgrammes par millilitre d'extrait de mûre brut ou purifié. On observe que les deux extraits réduisent efficacement la phosphorylation basale de la protéine ERK.Cependant, l'extrait purifié provoque une forte régulation à la baisse à 100 microgrammes par millilitre, tandis que 400 à 500 microgrammes par millilitre d'extrait brut sont nécessaires. Cela suggère que l'efficacité supérieure de l'extrait purifié à inhiber la phosphorylation de l'ERK est due à ses concentrations plus élevées de composés polyphénoliques. Ensuite, les CMLV sont traitées pendant 24 heures avec 200 microgrammes par millilitre d'extrait de mûre purifié avant l'ajout de 100 nanomoles d'angiotensine II. Comme indiqué précédemment, l'extrait polyphénolique de mûre réduit la phosphorylation de l'ERK induite par l'angiotensine II, mais ne montre aucun effet sur l'expression de la catalase ou de la SOD2.Une fois maîtrisée, l'extraction de polyphénols peut être réalisée en quelques heures. Cette technique peut aider les chercheurs dans le domaine des aliments fonctionnels à explorer le rôle des polyphénols in vitro et dans des modèles animaux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d'extraire et de purifier des polyphénols à partir de fruits et de légumes, et d'utiliser les extraits de polyphénols pour traiter des cellules en culture.Nous avons utilisé cette méthode pour démontrer le rôle des polyphénols du mûrier noir dans la prévention du vieillissement des cellules musculaires lisses vasculaires aortiques. Ceci est important, étant donné que le vieillissement du système vasculaire constitue un facteur de risque majeur dans le développement de maladies cardiovasculaires.

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