Approche précise de l'ablation cellulaire pour la modélisation des lésions rénales aiguës dans le développement du poisson zèbre

L'objectif général de cette procédure est d'induire une ablation ciblée des cellules épithéliales du rein du poisson zèbre afin de modéliser une lésion et une réparation des néphrons. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération des organes, et plus particulièrement du rein. Par exemple, quels sont les principaux processus cellulaires impliqués dans la régénération, quel est le degré de plasticité des tissus survivants, et bien d'autres encore.

Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet un contrôle précis de l'atteinte lésionnelle dans l'espace et dans le temps, ainsi que la possibilité d'ajuster le degré de lésion. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie ou au diagnostic de l'insuffisance rénale aiguë, car elle permet une évaluation précise des processus cellulaires et moléculaires impliqués dans la lésion et la régénération des cellules rénales, tant dans l'espace que dans le temps. Pour commencer, produire des embryons en croisant des zebrafish fluorescents GFP au niveau du rein.

Pendant 24 heures après la fécondation, maintenir les embryons en solution E3 à 28,5 degrés Celsius. Ensuite, utiliser du PTU à 0,003 % dans du milieu E3 pour remplacer le milieu E3. Remettre les embryons dans l'incubateur pendant six jours ou plus, au bout desquels les reins seront complètement développés.

Pour cartographier le poisson zèbre en imagerie vivante, préparez de l'agarose à bas point de fusion à 1 % à 2 % avec une solution de tricaine à 0,2 milligramme par millilitre. Veillez à ce que la solution d'agarose-tricaine soit refroidie avant d'utiliser une pipette en plastique ou en verre pour transférer un embryon dans la solution. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert, aspirez la larve dans l’agarose et déposez-la au centre d’une boîte de 35 millimètres.

Étaler rapidement l'agarose contenant le poisson-zèbre afin de recouvrir uniformément le fond de la boîte. Ensuite, utiliser une sonde en verre pour orienter la larve en vue de l'ablation photochimique et de l'imagerie, de sorte que le segment rénal d'intérêt soit perpendiculaire au trajet du faisceau, tandis que le segment controlatéral est éloigné du faisceau laser. L'orientation du poisson-zèbre est cruciale pour les étapes suivantes impliquant l'ablation laser.

Il est recommandé d'utiliser une bonne technique afin de s'assurer que les larves conservent une position perpendiculaire dans l'agarose. Couvrez la boîte de Pétri pour minimiser l'évaporation et laissez l'agarose durcir pendant environ 15 minutes. Après avoir configuré le microscope confocal selon le protocole décrit, en configuration droite, placez la boîte de Pétri contenant la larve sur une lame de microscope et utilisez de la pâte à modeler pour la maintenir en place.

Ensuite, positionnez la boîte de Petri coulissante sur la platine du microscope. Puis, ajoutez trois millilitres de solution d'imagerie. Sous un objectif à immersion dans l'eau, remontez lentement la platine en veillant à ce que l'objectif soit légèrement incliné afin d'éviter que de l'air ne soit piégé dans le trajet du faisceau.

Une fois que la lentille touche la solution selon un angle, centrez-la de manière à ce qu'elle se trouve dans le champ de vision de l'embryon. Ensuite, à l'aide de la source de lumière fluorescente, repérez le segment d'intérêt, puis focalisez-vous sur la branche superficielle afin de la cibler pour la lésion. Les branches superficielles sont choisies pour minimiser la diffusion de la lumière.

Dans le logiciel du microscope, accéder à Affichage, Contrôle d'acquisition, interface C2plus compacte. Régler le temps de séjour par pixel à 1,9 microseconde, la taille de l'image à 512 sur 512 pixels et la taille du diaphragme à 90 microns. Régler l'intensité du laser à 405 nanomètres à zéro et l'intensité du laser à 488 nanomètres à une valeur faible.

Lors de l'utilisation du laser de 488 nanomètres, cliquez sur « scan » dans l'interface logicielle. Repérez le segment d'intérêt qui est perpendiculaire au trajet du faisceau et qui est bien visualisé avec une bonne fluorescence GFP. Une fois cette région identifiée, accédez à ROI, dessinez un ROI elliptique, afin de délimiter une région d'intérêt.

Ensuite, accédez à l'onglet affichage, aux commandes d'acquisition, à la zone de balayage C2plus et sélectionnez la zone de balayage par bande ; un masque rectangulaire apparaîtra dans cette interface. À l'aide du curseur, définissez manuellement un balayage rectangulaire couvrant le segment ciblé pour l'ablation laser. Cliquez avec le bouton droit de la souris dans la zone du masque pour valider la sélection.

En utilisant uniquement le laser de 488 nanomètres pour activer la GFP, commencez la mesure du temps tout en surveillant le canal vert. Assurez-vous que l'intensité du laser 488 est relativement faible. Mesurez l'intensité moyenne de la GFP dans la région d'intérêt en sélectionnant Mesurer, Mesure du temps.

Utilisez le graphique ou l'onglet de données pour surveiller les niveaux d'intensité moyens à l'intérieur de la région d'intérêt (ROI). À l'aide du laser violet, induisez des dommages aux cellules rénales en augmentant l'intensité à 100 % en déplaçant le contrôle de puissance du laser complètement vers la droite. Dans l'onglet graphique, observez un graphique linéaire ou utilisez l'onglet de données pour observer les valeurs numériques de l'intensité de la GFP et attendez jusqu'à ce qu'elle diminue jusqu'à un niveau souhaité.

Par exemple, 50 % de la ligne de base. Une fois que l'intensité de la GFP dans la région d'intérêt elliptique a diminué jusqu'à un niveau souhaité, réduisez immédiatement l'intensité du laser violet à zéro dans le panneau de contrôle du logiciel en déplaçant le curseur de puissance du laser tout à gauche. Enfin, obtenez une nouvelle ligne de base de la fluorescence de la GFP.

Comme le montre cette figure, après exposition à une lumière laser de 405 nanomètres, la fluorescence de la GFP continue de disparaître une cellule à la fois. Jusqu'à ce qu'à 220 minutes, tout le segment ablété perde 100 % de sa positivité pour la GFP. Ceci est dû à la mort cellulaire et non à la régulation à la baisse de l'expression de la GFP, comme en témoigne l'apparition de noyaux positifs au propidium iodure fluorescent rouge dans les cellules ayant perdu la positivité pour la GFP.

Ces images démontrent que, en faisant varier l'exposition initiale, il est possible de moduler la lésion et la réponse de l'épithélium lésé. Avec un blanchiment photo-induit de la GFP de 10 % à 20 % initial, pratiquement aucune réduction de la positivité de la GFP n'est observée cinq heures après la lésion. Un blanchiment de 50 % et 60 % entraîne une disparition complète de la GFP à cinq heures, tandis que des niveaux de blanchiment de 30 % et 40 % donnent des résultats intermédiaires, avec une mortalité estimée à 50 % observée à environ 35 % de blanchiment photo-induit.

Cela est confirmé par la coloration au propidium iodure, où un blanchiment photo à 20 % entraîne pratiquement aucune coloration au propidium iodure 100 minutes après l'ablation. En revanche, un blanchiment photo à 50 % entraîne une positivité continue au propidium iodure dans l'épithélium ablaté après 60 minutes. Un blanchiment photo à 30 % et 40 % conduit à une incorporation intermédiaire du propidium iodure.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes si elle est correctement exécutée. N'oubliez pas que le travail avec des lasers et des réactifs chimiques peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que l'évitement de regarder directement le faisceau laser et l'utilisation de gants lors de la manipulation de produits chimiques doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure. Après cette procédure, d'autres méthodes comme la microscopie en temps réel, la coloration immunofluorescente et d'autres peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires visant à analyser les mécanismes de lésion et de réparation rénale au niveau cellulaire et moléculaire.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régénération rénale, afin d'explorer le rôle de la migration collective des cellules et de la réparation rénale après une lésion chez le poisson zèbre. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la microscopie confocale pour endommager des segments rénaux spécifiques chez des larves et embryons de poisson zèbre transgéniques GPF.