Approche précise de l'ablation cellulaire pour la modélisation des lésions rénales aiguës dans le développement du poisson zèbre

L’objectif global de cette procédure est d’induire une ablation ciblée des cellules de l’épithélium rénal du poisson-zèbre afin de modéliser les lésions et la réparation du néphron. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération des organes et plus particulièrement de la régénération rénale. Par exemple, quels sont les principaux processus cellulaires impliqués dans la régénération, quelle est l’étendue de la plasticité des tissus survivants et bien d’autres.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un contrôle spatio-temporel précis de la blessure, ainsi que la possibilité d’ajuster le niveau de la blessure. Les implications de cette technique s’étendent au traitement ou au diagnostic de l’insuffisance rénale aiguë, car elle permet une évaluation spatiale et temporelle précise des processus cellulaires et moléculaires impliqués dans l’atteinte et la régénération des cellules rénales. Pour commencer, générez des embryons en croisant des poissons zèbres fluorescents GFP rénas.

Pendant les 24 heures suivant la fécondation, conservez les embryons dans la solution E3 à 28,5 degrés Celsius. Utilisez ensuite 0,003 % de PTU dans l’E3, pour remplacer le milieu E3. Renvoyez les embryons dans l’incubateur pendant six jours ou plus, après quoi les reins auront mûri.

Pour cartographier le poisson-zèbre pour l’imagerie en direct, préparez 1 à 2 % d’agarose à faible point de fusion avec une solution de trigaine de 0,2 milligramme par millilitre. Assurez-vous que la solution d’agarose trigaine est froide avant d’utiliser une pipette en plastique ou en verre pour transférer un embryon dans la solution. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert, prélevez la larve dans l’agarose et déposez-la au milieu d’une boîte de 35 millimètres.

Étalez rapidement l’agarose contenant le poisson zèbre pour couvrir uniformément le fond du plat. Ensuite, utilisez une sonde en verre pour orienter la larve pour la photoablation et l’imagerie, de sorte que le segment rénal d’intérêt soit perpendiculaire au trajet du faisceau, tandis que le segment contre-latéral est éloigné du faisceau laser. L’orientation du poisson-zèbre est cruciale pour les étapes ultérieures impliquant l’ablation au laser.

Une bonne technique est conseillée pour s’assurer que les larves maintiennent une position perpendiculaire dans l’agarose. Couvrez la boîte de Pétri pour minimiser l’évaporation et laissez l’agarose se solidifier pendant environ 15 minutes. Après avoir installé le microscope confocal, selon le protocole textuel, dans la configuration verticale, placez la boîte de Pétri contenant la larve sur une lame de microscope et utilisez de la pâte à modeler pour la maintenir en place.

Ensuite, placez la boîte de Pétri coulissante sur la platine du microscope. Ensuite, ajoutez trois millilitres de solution d’imagerie. Sous une lentille plongeante dans l’eau, soulevez lentement la platine, en vous assurant que la lentille est légèrement inclinée pour éviter que l’air ne soit piégé dans la trajectoire du faisceau.

Une fois que la lentille touche la solution en biais, centrez-la de manière à ce qu’elle soit dans le champ de vision de l’embryon. Maintenant, à l’aide de la source de lumière fluorescente, trouvez le segment d’intérêt, puis concentrez-vous sur la branche superficielle pour la cibler pour la blesser. Les branches superficielles choisies pour minimiser la diffusion de la lumière.

Dans le logiciel du microscope, accédez à la vue, au contrôle d’acquisition, à l’interface graphique compacte C2plus. Réglez le temps de séjour des pixels sur 1,9 microseconde, la taille de l’image sur 512 x 512 pixels et la taille du sténopé sur 90 microns. Réglez l’intensité laser de 405 nanomètres sur zéro et l’intensité du laser de 488 sur une valeur faible.

Lors de l’utilisation du laser de 488 nanomètres, cliquez sur scanner dans l’interface du logiciel. Trouvez le segment d’intérêt qui est perpendiculaire au trajet du faisceau et qui est bien visualisé avec une bonne fluorescence GFP. Une fois cette région identifiée, accédez à ROI, dessinez ROI elliptique, pour dessiner une région d’intérêt.

Ensuite, accédez à la vue, aux commandes d’acquisition, à la zone de balayage C2plus et choisissez la zone de balayage à bande, le masque rectangulaire apparaîtra dans cette interface. À l’aide du curseur, définissez manuellement un balayage rectangulaire pour couvrir le segment ciblé pour l’ablation laser. Faites un clic droit dans la zone du masque pour accepter la sélection.

En utilisant uniquement le laser de 488 nanomètres pour activer la GFP, commencez la mesure du temps tout en surveillant le canal vert. Assurez-vous que l’intensité du laser 488 est relativement faible. Mesurez l’intensité moyenne de la GFP dans la région d’intérêt en sélectionnant mesure, mesure du temps.

Utilisez le graphique ou l’onglet données pour surveiller les niveaux d’intensité moyens dans le ROI. À l’aide du laser violet, induisez des dommages aux cellules rénales en augmentant l’intensité à 100 % en faisant glisser la commande de puissance laser, tout à droite. Dans l’onglet graphique, observez un graphique linéaire ou utilisez l’onglet données pour observer les valeurs numériques de l’intensité GFP et attendez qu’elle tombe au niveau souhaité.

Par exemple, 50 % de la ligne de base. Une fois que l’intensité GFP dans le retour sur investissement elliptique a chuté au niveau souhaité, diminuez immédiatement l’intensité du laser violet à zéro dans le panneau de commande du logiciel en déplaçant le curseur de puissance du laser, complètement vers la gauche. Enfin, obtenez une nouvelle base de fluorescence GFP.

Comme le montre cette figure, après une exposition à une lumière laser de 405 nanomètres, la fluorescence GFP continue de disparaître une cellule à la fois. Jusqu’à ce qu’à 220 minutes, l’ensemble du segment ablate perde 100 % de sa positivité GFP. Cela est dû à la mort cellulaire et non à la régulation négative de l’expression de la GFP, comme en témoigne l’apparition de noyaux positifs à l’iodure de propidium fluorescent rouge dans les cellules qui perdent la positivité de la GFP.

Ces images démontrent qu’en variant l’exposition initiale, il est possible de déterminer la lésion et la réponse à l’épithélium blessé. Avec un photoblanchiment initial de 10 à 20 %, pratiquement aucune réduction de la positivité de la GFP n’est observée cinq heures après la blessure. 50 % et 60 % conduisent à une disparition complète de la GFP à cinq heures, tandis que le blanchiment à 30 % et 40 % conduit à des résultats intermédiaires avec une mortalité estimée à environ 30 % de photoblanchiment.

Ceci est soutenu par la coloration à l’iodure de propidium où un photoblanchiment à 20 % n’entraîne pratiquement aucune coloration à l’iodure de propidium 100 minutes après l’ablation. Cependant, un photoblanchiment à 50 % conduit à une positivité continue de l’iodure de propidium dans l’épithélium ablaté, après 60 minutes. Tandis que le photoblanchiment à 30 % et 40 % conduit à une incorporation intermédiaire d’iodure de propidium.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes si elle est bien exécutée. N’oubliez pas que travailler avec des lasers et des réactifs chimiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que d’éviter de regarder le faisceau laser et d’utiliser des gants lors de la manipulation de produits chimiques doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la microscopie à intervalle de temps, la coloration par immunofluorescence et d’autres peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires visant à disséquer les lésions rénales et à les réparer au niveau cellulaire et moléculaire.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régénération rénale. Explorer le rôle de la migration cellulaire collective et de la réparation rénale après une blessure chez le poisson-zèbre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la microscopie confocale pour blesser des segments rénaux spécifiques dans les larves et les embryons de poisson-zèbre transgénique GPF.