L'imagerie à haute résolution et d'analyse de l'individu Astral microtubules Dynamique dans la levure bourgeonnante

L'objectif général de cette procédure est de mesurer la dynamique des microtubules dans des cellules de levure. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des microtubules, telles que la manière dont les mutations dans les tubulines et les régulateurs des microtubules influencent la dynamique des microtubules dans une cellule vivante. Le principal avantage de cette technique est que les cellules de levure vivantes sont stabilisées sur l'image.

Plutôt une haute résolution temporelle pendant dix minutes, ou une faible résolution temporelle pendant plusieurs heures. La procédure sera démontrée par Colby Fees et Cassi Estrem, deux étudiants diplômés de mon laboratoire. Les cellules de levure utilisées dans cette expérience ont été conçues pour exprimer de manière constitutive une tubuline marquée par la GFP.

Inoculez environ un microlitre de cellules de levure provenant d'une colonie unique sur une plaque dans trois millilitres de milieu synthétique complet. Laissez les cellules croître toute la nuit à 30 degrés Celsius avec agitation à 250 tr/min. Le jour suivant, diluez la culture saturée jusqu'à une DO600 inférieure à 0,1 dans le milieu.

Replacer la culture diluée dans l'agitateurs à 30 degrés Celsius pendant trois à quatre heures, ou jusqu'à ce que l'OD600 soit comprise entre 0,4 et 0,8. Commencer la préparation des lames pour chambre d'écoulement en découpant une feuille de film en paraffine en un morceau mesurant quatre pouces de large sur sept pouces de long. Placer une lame de microscope standard dans le sens de la longueur sur la largeur de quatre pouces du film en paraffine et enrouler le film autour de la lame trois à quatre fois, de sorte que la lame soit recouverte d'un film d'une épaisseur de trois à quatre couches.

Appuyez fermement les couches ensemble afin d'assurer un scellement correct, mais évitez d'appuyer trop fort ou de froisser le film. À l'aide d'un cutter propre et d'une autre lame servant de bord droit pour couper, découpez le film de paraffine le long des bords extérieurs de la lame. Retirez le film excédentaire de la lame de travail et jetez-le.

À l’aide de la deuxième lame comme bord droit, découper les couches superposées de film selon l’axe long de la lame en environ 10 bandes, chacune ayant une largeur de deux à quatre millimètres. Ensuite, découper les couches superposées de film de paraffine perpendiculairement aux découpes précédentes, selon l’axe court de la lame, afin d’obtenir des bandes d’une largeur de deux à quatre millimètres, d’une longueur de 23 à 24 millimètres et d’une épaisseur de trois à quatre couches. Utiliser un rasoir à un angle de 45 degrés pour détacher les bandes de film découpées.

Ensuite, utilisez une pince pour répartir uniformément les bandes découpées sur une lame de microscope propre afin de créer le nombre souhaité de chambres. Dans cet exemple, quatre bandes de film seront utilisées pour créer trois chambres. Placez une lame couvre-objet unique au-dessus des bandes de film et positionnez-la à l’aide d’une pince.

Placer la lame préparée, avec la lamelle vers le haut, sur un bloc chauffant réglé à environ 95 degrés Celsius, et chauffer la lame pendant environ trois minutes jusqu'à ce que les bandes de film deviennent translucides. Sceller la lame et la lamelle ensemble en utilisant une pince pour appuyer doucement sur les régions de la lamelle situées directement au-dessus des bandes de film de paraffine. Utiliser des pinces pour retirer la lame du bloc chauffant, puis la laisser refroidir, côté lamelle vers le haut.

À mesure que la lame refroidit, le film redeviendra d'une couleur blanche opaque. Pour commencer cette procédure, décongeler un aliquot de 200 microlitres de concanavaline A congelé à température ambiante. Ajouter environ 100 microlitres de concanavaline A décongelée dans chaque chambre de la lame préparée en pipetant par l'une des extrémités ouvertes.

Ensuite, suspendre la lame, avec la lamelle vers le bas, entre deux supports de tubes microcentrifugeuses pendant cinq minutes afin de permettre à la concanavaline A de s'adhérer à la lamelle. Replacer la lame dans une position avec la lamelle vers le haut, puis éliminer la concanavaline A en lavant la chambre avec du milieu synthétique complet. Faire circuler un volume de milieu équivalent à deux fois le volume de la chambre à travers la chambre en utilisant le coin d'un papier absorbant pour extraire le liquide d'une extrémité de la chambre, tout en pipetant simultanément du liquide frais dans l'autre extrémité de la chambre.

Chargez les cellules en faisant circuler deux fois le volume de la chambre de la suspension cellulaire en utilisant la méthode d'écoulement dirigé. Suspendez la lame, avec la lamelle vers le bas, pendant 10 minutes afin de permettre l'adhésion des cellules à la lamelle. Éliminez les cellules non adhérentes en faisant circuler quatre fois le volume de la chambre de milieu synthétique complet.

Séchez soigneusement chaque extrémité de la chambre avec un coin propre de papier essuie-tout, en ramenant le ménisque jusqu'au bord de la lame couvre-objet. Scellez chaque extrémité de la chambre avec un scellant chaud. L'acquisition d'images sera effectuée à l'aide d'un microscope inversé équipé d'un objectif CFI Plan Apo 100X à ouverture numérique 1,45, d'une platine piézoélectrique, d'une unité de balayage confocale à disque tournant, d'un laser d'illumination et d'une caméra EMCCD.

Conserver la température de la platine à température ambiante pendant l'acquisition des images. Mettre les cellules au point et parcourir la lame à la recherche de cellules regroupées afin de s'assurer que le champ d'acquisition contient au moins cinq à six cellules regroupées sur le même plan focal. Programmer une acquisition multidimensionnelle pour recueillir plusieurs séries z au fil du temps.

Régler les paramètres dans les paramètres d'acquisition actifs comme suit : une profondeur Z totale de six micromètres pour englober l'ensemble de la cellule de levure, une taille de pas Z de 300 nanomètres afin de maximiser la collecte de lumière sans suréchantillonnage, une durée totale de 10 minutes, des intervalles de temps de quatre secondes entre chaque série Z, et un temps d'exposition de 90 millisecondes pour chaque plan Z. Démarrer l'acquisition en cliquant sur Exécuter, puis laisser le processus s'exécuter pendant toute la durée de 10 minutes. Les données sont enregistrées sous forme de séries d'images, et un exemple de résultat d'imagerie en laps de temps est montré ici.

Démarrez l'analyse d'image en ouvrant ImageJ et en faisant glisser directement la pile d'images acquise sur le panneau de contrôle. Les formats biologiques importés démarreront automatiquement. Sélectionnez « Ok » pour charger la pile d'images en tant qu'hyperpile.

À l’aide de la fonction ZProject, réduire chaque série z à une projection bidimensionnelle d’intensité maximale. Appliquer un filtre médian à la pile d’images pour réduire le bruit de scintillement en sélectionnant le menu processus, le sous-menu filtre, puis la fonction médiane. Saisir 2,0 pixels dans la zone de rayon, puis cliquer sur OK. Identifier les cellules pré-NFA dans le champ.

Elles se caractérisent par des bourgeons de taille moyenne et un fuseau mitotique court d'environ un à un virgule cinq micromètre de longueur. À partir du premier point temporel de la série d'images, utilisez l'outil de ligne segmentée pour tracer une ligne le long d'un microtubule astral unique, depuis l'intersection entre le microtubule astral et les microtubules du fuseau plus intensément marqués, jusqu'à l'extrémité plus, située dans le cytoplasme. Double-cliquez sur l'extrémité du microtubule pour finaliser la ligne segmentée.

Enregistrez la mesure dans le tableau des résultats à l'aide de la fonction de mesure en appuyant sur le bouton M du clavier. Une fois que les mesures ont été effectuées pour tous les points temporels, copiez les données à partir du tableau des résultats, collez-les dans un tableur, puis sélectionnez « Enregistrer sous » pour sélectionner les données. Ce graphique affiche une série temporelle des dynamiques des microtubules astraux dans une cellule de type sauvage et une souche mutante précédemment décrite comme possédant des microtubules plus stables.

Les microtubules sont marqués par la tubuline alpha associée à la GFP afin de visualiser la longueur des microtubules. Les flèches rouges indiquent la longueur totale d'un microtubule astral, les pointes des flèches désignant les extrémités plus. La longueur des microtubules a été mesurée à chaque point temporel pendant huit minutes, et ces longueurs regroupées sont représentées dans des courbes de vie.

Les points verts indiquent la polymérisation, et les points roses indiquent la dépolymérisation. Les événements de catastrophe sont indiqués par des flèches. Ces graphiques montrent que le microtubule du mutant est plus long et présente moins de catastrophes que le microtubule de type sauvage.

En outre, les taux de polymérisation et de dépolymérisation déterminés à partir des pentes des longueurs de microtubules croissantes et décroissantes sont réduits chez le mutant par rapport au type sauvage. Les mesures de la dynamique des microtubules révèlent également que la dynamique des microtubules dans la cellule mutante est diminuée par rapport au type sauvage. Une fois maîtrisées, la préparation des lames, le chargement des cellules et l'acquisition d'images peuvent être réalisées en 30 minutes, ce qui signifie que de nombreux échantillons différents peuvent être observés en une seule journée.

Les chambres à lame peuvent être fabriquées et stockées à l'avance avant d'ajouter la concanavaline A. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment stabiliser des cellules de levure dans des chambres à lame simples, réaliser des images en quatre dimensions et mesurer la dynamique des microtubules dans des cellules vivantes. En plus des microtubules, ce protocole peut être modifié pour mesurer la dynamique d'autres protéines marquées par fluorescence dans des cellules de levure vivantes, sur des échelles de temps allant de quelques secondes à plusieurs heures.