Name: Une méthode intégrale pour lanalyse rapide de la chimiotaxie des neutrophiles directement à partir dune goutte de sang (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Découvrez une méthode d'isolation et d'analyse de la chimiotaxie des neutrophiles à partir d'une goutte de sang entier en 25 minutes. Cette technique microfluidique intégrée simplifie l'étude de la migration des cellules immunitaires.

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Ce travail bénéficie en partie de subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) et des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). Nous remercions l&#39;Institut clinique de recherche appliquée et d&#39;éducation à l&#39;Hôpital général de Victoria à Winnipeg et à Seven Oaks General Hospital à Winnipeg pour la gestion d&#39;échantillons cliniques de sujets humains. Nous remercions le Dr Hagit Peretz-Soroka pour une discussion utile sur les stratégies d&#39;opération de dosage. <style type="text/css">
</style> Nous remercions le Professeur Carolyn Ren et le Dr Xiaoming (Cody) Chen de l&#39;Université de Waterloo pour leur soutien généreux au processus de tournage.

Tous les protocoles de collecte d&#39;échantillons humains ont été approuvés par le Joint-Faculty Research Ethics Board de l&#39;Université du Manitoba à Winnipeg. 1. Fabrication de dispositifs microfluidiques ( figure 1A ) <ol><li> Conception et impression de masque de transparence. <ol><li> Concevez l&#39;appareil comme décrit précédemment 25 . Voir la figure 1A . REMARQUE: l&#39;appareil comprend deux couches. La première couche (4 μm de hauteur) définit le canal de la barrière d&#39;ancrage de la cellule pour piéger les cellules à côté du canal dégradé. La deuxième couche (60 μm de hauteur) définit le canal de génération de gradient, le port et le canal pour le chargement des cellules, les réservoirs d&#39;entrée chimiques et la sortie des déchets. Les marques d&#39;alignement sont conçues pour les deux couches. Pour la deuxième couche, la longueur et la largeur du canal d&#39;entrée en serpentin en amont sont respectivement de 60 mm et 200 μm; La longueur et l&#39;épaisseur de l&#39;avalLe canal d&#39;entrée en serpentin est respectivement de 6 mm et 280 μm. </li><li> Imprimez les caractéristiques de la première et de la deuxième couche dans un masque de transparence à l&#39;aide d&#39;une imprimante haute résolution. REMARQUE: la résolution d&#39;impression dépend des caractéristiques minimales de la conception. Dans la conception actuelle, 32 000 ppp ont été choisis pour une caractéristique minimale de 10 μm. </li></ol></li><li> Nettoyez la plaquette de silicium. <ol><li> Placez une plaquette de silicium de 3 po dans le nettoyeur à plasma. Appliquer l&#39;aspirateur pendant 3 min. </li><li> Activez la puissance du plasma et réglez le niveau sur HIGH. Utilisez le plasma d&#39;oxygène pour traiter la plaquette de silicium pendant 30 minutes. </li><li> Éteignez le nettoyeur de plasma et sortez la plaquette de silicium; La plaquette de silicium est prête à fabriquer le moule de l&#39;appareil. </li></ol></li><li> Fabriquer la première couche par photolithographie dans une salle blanche. REMARQUE: les paramètres de fabrication exacts peuvent varier en fonction de l&#39;installation de fabrication. <ol><li> Diluer 10 mL de SU-8 2025 avec 10 mL de SU-8 2000 dans un briseur de verre pour préparer le photorésist conçu. Laissez le mélange dans la hotte pendant 10 minutes jusqu&#39;à ce que les bulles disparaissent. </li><li> Placez soigneusement la pastille de silicium nettoyée sur la centrifugeuse avec le mandrin approprié et appliquez le vide pour immobiliser la plaquette de silicium. </li><li> Verser soigneusement 3 ml du mélange de photoresist sur le centre de la plaquette de silicium. Tourner à 500 tr / min pendant 5 s. Ensuite, tournez à 3 000 tr / min pendant 30 s pour obtenir un revêtement de résine photosensible final de 4 μm sur la plaquette de silicium. </li><li> Retirez soigneusement la plaquette de silicium de la centrifugeuse et faites cuire la plaquette de silicium sur une plaque chauffante pendant 4 min à 95 ° C. </li><li> Placez soigneusement la plaquette de silicium sur un alignement de masque et réglez le temps d&#39;exposition aux UV à 6 s. Fixez soigneusement le masque de transparence de la première couche sur une plaque de verre transparente à l&#39;aide d&#39;un ruban adhésif. </li><li> Placez doucement la plaque de verre transparente avec le masque attaché à l&#39;alignement et alignez le masque avec la plaquette de silicium. Exposez le siLicon wafer à l&#39;UV pour modeler la structure d&#39;amarrage de la cellule. </li><li> Retirez délicatement la plaque de verre et enlevez la plaquette de silicium exposée. Faire cuire la plaquette de silicium sur une plaque chauffante pendant 4 min à 95 ° C. </li><li> Transférez la plaquette de silicium à une hotte et placez-la dans un récipient en verre contenant le développeur SU-8. Secouez doucement pendant 30 s. </li><li> Nettoyez la plaquette de silicium en utilisant un nouveau développeur SU-8 suivi d&#39;un alcool isopropylique (IPA) à l&#39;intérieur de la hotte aspirante. Sécher la plaquette de silicium par du gaz d&#39;azote à l&#39;intérieur de la hotte aspirante; La première couche est prête. </li></ol></li><li> Créez la deuxième couche sur la première couche. <ol><li> Utilisez un ruban adhésif pour couvrir les marques d&#39;alignement sur la première couche. Placez soigneusement la pastille de silicium avec la première couche sur le mandrin sous vide de la centrifugeuse et appliquez un vide pour immobiliser la tranche de silicium. </li><li> Verser 3 mL de photoréserve SU-8 2025 sur la plaquette de silicium. Faire tourner la plaquette de silicium à 500 tr / min pendant 5 s. Ensuite, tournez à 2000 tr / min pour 30S pour obtenir un revêtement final de photoresist de 60 μm d&#39;épaisseur sur la plaquette de silicium. </li><li> Retirez soigneusement la plaquette de silicium de la centrifugeuse et transférez-la sur une plaque chauffante; Cuire à 65 ° C pendant 2 min. </li><li> Retirez doucement le ruban adhésif pour exposer les repères d&#39;alignement sur la première couche. Placez la plaquette de silicium sur une plaque chauffante et faites cuire à 95 ° C pendant 6 min. </li><li> Placez soigneusement la plaquette de silicium sur un alignement de masque et réglez le temps d&#39;exposition aux UV à 18 s. </li><li> Fixez soigneusement le masque de transparence de la deuxième couche sur une plaque de verre transparente à l&#39;aide d&#39;un ruban adhésif. </li><li> Placez soigneusement la plaque de verre avec le masque attaché à l&#39;alignement et alignez le masque et la première couche sur la plaquette de silicium par les marques d&#39;alignement de croisement à l&#39;aide du microscope d&#39;inspection de l&#39;alignement. </li><li> Exposez la plaquette de silicium revêtue de photorésist aux rayons ultraviolets pour modéliser les canaux de chargement et de gradient des cellules. </li><li> Retirez délicatement la plaque de verre et sortez le silicium wAfer. Faire cuire la plaquette de silicium sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 2 min, puis transférer la plaquette de silicium dans une autre plaque chauffante à 95 ° C et cuire au four pendant 6 min. </li><li> Transférez la plaquette de silicium à la hotte et placez-la dans un récipient en verre contenant le développeur SU-8. Secouez doucement pendant 6 minutes. </li><li> Nettoyez la plaquette de silicium en utilisant un nouveau développeur SU-8 suivi d&#39;un IPA à l&#39;intérieur de la hotte aspirante. </li><li> Sécher la plaquette de silicium à l&#39;aide de gaz d&#39;azote à l&#39;intérieur de la hotte aspirante. Placez la plaquette de silicium sur une plaque chauffante et durci le moule à 150 ° C pendant 30 minutes; La deuxième couche est prête. </li></ol></li><li> Maîtrise de la modification de la surface du moule. NOTE: Une étape de modification de la surface de silanisation est appliquée au moule SU-8 pour faciliter la libération du polydiméthylsiloxane (PDMS) à partir du moule dans la lithographie douce. <ol><li> Prendre 10 μL de solution de tridecafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyle (trichlorosilane) dans une pointe de micropipette. Mettez la pointe de la micropipette dans un tube en plastique de 15 mL aEt desserrer le capuchon du tube. </li><li> Placez le tube et la tranche de silicium à motif SU-8 à l&#39;intérieur d&#39;un déshydratant et appliquez le vide pendant 1 h; Le masque est prêt à fabriquer le dispositif PDMS. </li></ol></li><li> Fabrirez le périphérique PDMS. <ol><li> Préparez la solution PDMS en mélangeant 40 g de base PDMS et 4 g d&#39;agent de durcissement dans un bécher en plastique. Placez le moule maître SU-8 préparé dans une boîte de Petri et versez soigneusement une solution PDMS de 44 g sur le moule. </li><li> Placer la boîte de Petri dans un dessicateur et appliquer un vide pour dégager la solution PDMS pendant 20 min. Ensuite, placez la boîte de Petri dans un four et curez le PDMS à 80 ° C pendant 2 h. </li><li> Après la cuisson, sortez la boîte de Petri et placez-la sur un banc propre. Couper avec précaution et éplucher la dalle PDMS du moule SU-8. </li><li> Sortez le port de chargement de la cellule à l&#39;aide d&#39;un perforateur de 3 mm de diamètre. Sortez les réservoirs d&#39;entrée chimiques et la sortie des déchets en utilisant un perforateur de diamètre de 6 mm. </li><li> Retirer la poussière sur leSurface de la dalle PDMS à l&#39;aide d&#39;un ruban adhésif. Placez la dalle PDMS et une glissière de verre propre dans la machine à plasma. Appliquer l&#39;aspirateur pendant 3 min. </li><li> Activez la puissance du plasma et réglez le niveau sur HIGH. Réglez doucement la soupape d&#39;air et plasmassez la dalle PDMS et la glissière de verre pendant 3 min. </li><li> Éteignez la puissance du plasma et relâchez le vide. Retirez délicatement la dalle PDMS et la glissière en verre à l&#39;aide d&#39;une pince à épiler. </li><li> Placez immédiatement la dalle PDMS (avec des structures de canal face vers le bas) au dessus de la glissière en verre; Appuyez doucement sur la dalle PDMS pour la lier au verre. Remplir immédiatement le canal microfluidique avec de l&#39;eau désionisée; La fabrication et l&#39;assemblage du dispositif microfluidique sont terminés. </li></ol></li></ol> 2. Préparation du dosage de la migration des cellules microfluidiques <ol><li> Préparation du dispositif microfluidique. <ol><li> Préparez une solution de fibronectine à 50 μg / mL en diluant 50 μL de solution de fibronectine stock (1 mg / mL) à 95081; la solution saline tamponnée au phosphate de L Dulbecco (DPBS) dans un cabinet de sécurité biologique. </li><li> Préparez le milieu de migration en mélangeant 9 mL de milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) et 1 mL de RPMI-1640 avec 4% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA). </li><li> Retirez l&#39;eau désionisée de l&#39;appareil. </li><li> Ajouter 100 μL de solution de fibronectine à l&#39;appareil à partir de la sortie. Attendez 3 min pour s&#39;assurer que tous les canaux sont remplis de solution de fibronectine. Placez le dispositif microfluidique dans une boîte de Petri couverte pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Retirez la solution de fibronectine de l&#39;appareil. Ajouter un milieu de migration de 100 μL à partir de la sortie. Attendez 3 minutes pour vous assurer que tous les canaux sont remplis avec un support de migration. </li><li> Incuber l&#39;appareil pendant encore 1 h à température ambiante; L&#39;appareil est alors prêt pour l&#39;expérience chimiotaxique. </li></ol></li><li> Préparation de la solution chimio-tractante pour l&#39;expérience chimiotaxique. <ol><li> Préparer 100 nM solution fMLP dans t1 mL de milieu de migration. Mélanger 5 μL de FITC-Dextran stock (10 kDa, 1 mM) avec la solution de fMLP dans un tube de 1,5 mL. REMARQUE: FITC-Dextran est utilisé pour la mesure des dégradés. Alternativement, utilisez Rhodamine comme indicateur de gradient. La solution de chimioattracteur fMLP est alors prête pour une expérience chimiotaxique. </li></ol></li><li> Préparation de l&#39;échantillon de crachat. NOTE: La chimiotaxie des neutrophiles induite par un gradient d&#39;échantillon d&#39;expectoration de patients atteints de MPOC a été testée comme une application de diagnostic clinique de cette méthode tout-sur-puce. <ol><li> Obtenir un protocole d&#39;éthique humaine pour recueillir des échantillons de crachats provenant de patients atteints de MPOC. NOTE: Nous avons obtenu des approbations pour recueillir des échantillons à l&#39;hôpital général Seven Oaks à Winnipeg (approuvé par l&#39;Université du Manitoba). </li><li> Obtenez les formulaires de consentement écrit en connaissance de cause de toutes les matières. </li><li> Recueillir des échantillons spontanés d&#39;expectorations des patients atteints de MPOC. Placer 500 μL d&#39;échantillon d&#39;expectoration dans un tube de 1,5 mL. </li><li> Ajouter 500 μL 0,1% diThiothréitol dans le tube de 1,5 ml et mélanger doucement. Placer le tube dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 15 min. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 753 xg pendant 10 min puis collecter le surnageant. Centrifuger le surnageant à 865 xg pendant 5 min, puis collecter le surnageant final. Stocker le surnageant collecté à l&#39;intérieur d&#39;un congélateur de -80 ° C avant utilisation. </li><li> Lorsqu&#39;il est prêt pour une expérience chimiotaxique, décongeler la solution d&#39;expectoration; Transférer un milieu de migration de 900 μL à un tube de 1,5 mL et mélanger avec 100 μL de solution d&#39;expectoration à l&#39;intérieur d&#39;un coffret de sécurité biologique; La solution d&#39;expectoration est alors prête à l&#39;expérience chimiotaxique. </li></ol></li><li> Collecte d&#39;échantillon de sang. <ol><li> Obtenir un protocole d&#39;éthique humain pour collecter des échantillons de sang provenant de donneurs sains. Obtenir les formulaires de consentement écrit en connaissance de cause de tous les donneurs de sang. NOTE: Des échantillons ont été obtenus à l&#39;Hôpital général de Victoria à Winnipeg (approuvé par le Joint-Faculty Research Ethics Board de l&#39;Université de ManitOba). </li><li> Recueillir l&#39;échantillon de sang par ponction veineuse et mettre l&#39;échantillon dans un tube revêtu d&#39;EDTA. Gardez le tube dans un coffret de sécurité biologique avant l&#39;expérience. </li></ol></li></ol> 3. Opération All-on-chip Chemotaxis Assay <ol><li> Isolation cellulaire sur puce ( Figure 1B ). <ol><li> Placer 10 μL de sang entier dans un tube de 1,5 mL dans un cabinet de sécurité biologique. NOTE: Les détails de la collecte des échantillons de sang se trouvent à la section 2.4. </li><li> Ajouter 2 μL de cocktail d&#39;anticorps (Ab) et 2 μL de particules magnétiques (MP) du kit d&#39;isolation des neutrophiles (voir la table des matériaux) dans le tube de 1,5 ml et mélanger doucement; Cela étiquetera les cellules dans le sang, à l&#39;exception des neutrophiles. </li><li> Incuber le mélange sanguin-Ab-MP pendant 5 min à température ambiante. NOTE: Ceci marquera magnétiquement les cellules étiquetées par l&#39;anticorps dans le sang. </li><li> Fixez deux petits disques magnétiques sur les deux côtés du chargement de la cellule pOu de l&#39;appareil. Aspirez le support de tous les ports de l&#39;appareil. </li><li> Pipeter lentement 2 μL de mélange sanguin-Ab-MP dans le dispositif microfluidique à partir du port de chargement de la cellule. REMARQUE: les cellules étiquetées magnétiquement sont piégées sur les parois latérales du port de chargement des cellules, tandis que les neutrophiles s&#39;écoulent dans l&#39;appareil et deviennent piégés dans la structure d&#39;amarrage de la cellule. </li><li> Attendez quelques minutes jusqu&#39;à ce que suffisamment de neutrophiles soient piégés dans la zone d&#39;amarrage de la cellule. </li></ol></li><li> Dosage chimiotaxique ( figure 1C ). <ol><li> Placez le dispositif microfluidique sur le microscope à température contrôlée à 37 ° C. </li><li> Ajouter 100 μL de solution chimioattractive (solution de fMLP ou d&#39;expectoration) et 100 μL de milieu de migration à leurs réservoirs d&#39;entrée désignés à l&#39;aide de deux pipettes; Cela générera un gradient chimioattracteur dans le canal à gradient par un mélange chimique à base de flux laminaire continu assisté par une pressionE structure d&#39;équilibrage. NOTE: Les détails de la collecte des expectorations chez les patients souffrant de MPOC figurent à la section 2.3. <ol><li> Pour l&#39;expérience de contrôle moyen, n&#39;ajoutez que le milieu de migration dans les deux réservoirs d&#39;entrée. </li></ol></li><li> Acquérir l&#39;image de fluorescence de FITC-Dextran dans le canal à gradient. </li><li> Importez l&#39;image au logiciel ImageJ à l&#39;aide de la commande &quot;Fichier | Ouvrir&quot;. </li><li> Mesurez le profil d&#39;intensité de fluorescence sur le canal dégradé en utilisant la commande &quot;Analyse | Profil de tracé&quot;. </li><li> Exportez les données de mesure dans une feuille de calcul pour un traçage supplémentaire. </li><li> Incuber l&#39;appareil sur le stade du microscope à température contrôlée ou dans un incubateur de culture cellulaire classique pendant 15 min. </li><li> Image le canal dégradé à l&#39;aide d&#39;un objectif 10X pour enregistrer les positions finales des cellules pour l&#39;analyse des données. </li><li> Si nécessaire, enregistrez la migration de la cellule dans l&#39;appareil par microscopie temporelle. </li></ol></li></ol> 4. Cell Migration DAta Analysis ( Figure 1C ) <ol><li> Analyser le dosage de chimiotaxis en calculant la distance de migration cellulaire de la structure d&#39;amarrage comme décrit ci-dessous. Voir la figure 1C . </li><li> Importez l&#39;image dans le logiciel NIH ImageJ (version 1.45). </li><li> Sélectionnez le centre de chaque cellule qui se déplace dans le canal dégradé. </li><li> Mesurez les coordonnées des cellules sélectionnées pour leurs positions finales. Mesurez la coordonnée d&#39;un point au bord de la structure d&#39;ancrage en tant que position de référence initiale. </li><li> Exportez les données de coordonnées mesurées vers une feuille de calcul ( ex. Excel). Calculez la distance de migration des cellules comme la différence entre la position finale d&#39;une cellule et la position de référence initiale le long du sens de gradient. </li><li> Calibrer la distance à un micromètre. Calculez la moyenne et l&#39;écart de la distance de migration de toutes les cellules en tant que mesure de la chimiotaxis. </li><li> Comparez le migDistance de la ration en présence d&#39;un gradient de chimioattractant à l&#39;expérience de contrôle moyen en utilisant le test t de Student. </li><li> Si les images temporelles de la migration cellulaire sont enregistrées, la migration cellulaire et la chimiotaxie peuvent être analysées plus avant par analyse de suivi des cellules 15 . REMARQUE: Les matériaux nécessaires à la construction et à l&#39;exécution du test de chimiotaxie sur toute la puce sont détaillés dans le tableau des matériaux. </li></ol>

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<li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+kit-on-a-lid%3A+a+versatile+platform+for+neutrophil+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays.</a> Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).</li>
<li>Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+assay+from+a+drop+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration assay from a drop of blood.</a> Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24962731">Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+precise+measurements+of+mouse%2C+rat%2C+and+human+neutrophil+chemotaxis+in+whole-blood+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets.</a> J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).</li>
<li>Sackmann, E. K. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+asthma+from+a+drop+of+blood+using+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis.</a> P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.worldscientific.com/doi/abs/10.1142/S2339547816500035">An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum.</a> Technology. 04 (02), 104-109 (2016).</li>
</ol>

Il n&#39;y a aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

Dans cet article, un protocole détaillé pour isoler directement les neutrophiles du sang total suivi du test de chimiotaxis, tout sur une seule puce microfluidique, a été décrit. Cette méthode offre des fonctionnalités utiles dans son opération simple, la sélection négative de neutrophiles de haute pureté, le test de chimiotaxie rapide d&#39;échantillon à résultat, les réactifs réduits et la consommation d&#39;échantillon, ainsi qu&#39;une analyse précise des données de migration cellulaire. À titre d&#39;estimation app...

La chimiotaxie, un processus de migration cellulaire dirigée vers un gradient de concentration chimique soluble, est implicitement impliqué dans de nombreux processus biologiques, y compris la réponse immunitaire 1 , 2 , 3 , le développement tissulaire 4 et la métastase du cancer 5 . Les neutrophiles sont le sous-ensemble de globules blancs les plus abondants et jouent un rôle crucial en permettant les fonctions de défense de l&#39;hôte inné du corps, ainsi que dans la médiation des réponses immunitaires adaptatives 6 , 7 . Les neutrophiles sont équipés de machines chimiotactiques hautement réglementées permettant à ces cellules immunitaires mobiles de répondre à la fois aux chimioattractants dérivés des agents pathogènes ( p. Ex . FMLP) et aux chimioattractants dérivés de l&#39;hôte ( p . Ex . Interleukine-8) par voie de chocostat 8 . La migration des neutrophiles et la chimiotaxie mènent divers problèmes physiologiquesEt des maladies telles que l&#39;inflammation et les cancers 1 , 9 . Ainsi, l&#39;évaluation précise de la chimiotaxie des neutrophiles fournit une lecture fonctionnelle importante pour l&#39;étude de la biologie des neutrophiles et des maladies associées. Par rapport aux tests de chimiotaxis classiques largement utilisés ( p. Ex. Essai de transwell 10 ), les dispositifs microfluidiques sont très prometteurs pour une évaluation quantitative de la migration cellulaire et de la chimiotaxie en raison de la génération et de la miniaturisation des gradients chimiques 11 , 12 , 13 . Au cours des deux dernières décennies, divers dispositifs microfluidiques ont été développés pour étudier la chimiotaxie de différents types de cellules biologiques, en particulier les neutrophiles 11 . Des efforts considérables ont été déployés pour caractériser la migration des neutrophiles dans les complexes spatiotemportaux complexes<html> Gradients miques qui ont été configurés dans les dispositifs microfluidiques 14 , 15 . Des stratégies intéressantes ont également été développées pour étudier la prise de décision directionnelle par les neutrophiles à l&#39;aide des dispositifs microfluidiques 16. À l&#39; aide d&#39;une recherche biologiquement orientée, les applications des dispositifs microfluidiques ont été étendues pour tester les échantillons cliniques pour l&#39;évaluation de la maladie 17 , 18 , 19 . Cependant, l&#39;utilisation de nombreux dispositifs microfluidiques est limitée aux laboratoires de recherche spécialisés et nécessite une longue isolation des neutrophiles à partir d&#39;un grand volume d&#39;échantillons de sang. Par conséquent, il existe une tendance croissante à développer des dispositifs microfluidiques intégrés pour une analyse rapide de la chimiotaxie des neutrophiles directement à partir d&#39;une goutte de sang total 20 , 21 , 22 ,Ef &quot;&gt; 23 , 24 . Dans cette direction, une méthode all-on-chip a été développée qui intègre la purification neutrophile négative magnétique et le dosage de chimiotaxie subséquent sur un seul dispositif microfluidique 25 . Cette méthode tout-à-puce présente les nouvelles fonctionnalités suivantes: 1) contrairement aux stratégies antérieures sur la puce qui isolent les neutrophiles du sang par la capture cellulaire à base d&#39;adhésion ou le filtrage basé sur la taille des cellules 20 , 22 , cette nouvelle méthode permet une augmentation La pureté, la séparation magnétique des neutrophiles sur les puce à partir de petits volumes de sang total, ainsi que la mesure de la chimiotaxis lors de la stimulation chimioattractive; 2) la structure d&#39;ancrage de la cellule aide à aligner les positions initiales des neutrophiles près du canal de gradient chimique et permet une analyse chimiotaxique simple sans suivi de cellule unique; 3) l&#39;intégration de l&#39;isolement et du chimotine des neutrophilesL&#39;analyse des axes sur un seul dispositif microfluidique permet une analyse chimio-chimiométrique rapide d&#39;échantillon à résultat en 25 minutes lorsqu&#39;il n&#39;y a pas d&#39;interruption entre les étapes expérimentales. Cet article fournit un protocole détaillé pour la méthode de construction, d&#39;exploitation et d&#39;analyse de données de ce test de chimiotaxis tout-sur-puce. Le document démontre l&#39;utilisation efficace de la méthode développée pour la réalisation de la chimiotaxie des neutrophiles en testant des échantillons chimiotactiques recombinants et chimiotactiques recombinés connus, suivis d&#39;une discussion sur les stratégies de dépannage, les limites et les orientations futures.

<table><tbody><tr><td>Fabrication de dispositifs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aligneur de masque</td><td>ABM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Solitec</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>VWR</td><td>11301-022</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Dessicateur sous vide</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Balance numérique</td><td>Ohaus</td><td>CS200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 diluant</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 photorésine</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 développeur</td><td>Microchem</td><td>SU-8 développeur</td><td></td></tr><tr><td>Si wafer</td><td>Silicon, Inc</td><td>LG2065</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropylique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>(tridécafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyle) trichlorosilane</td><td>Gelest</td><td>78560-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Polydiméthylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>2065622</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri Fisher</td><td>Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>Lames de verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de coupe</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sur mesure</td></tr><tr><td>Perforateurs</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Custom-made</td></tr><tr><td>Name</td><td>Source</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Isolement cellulaire sur puce et test de chimiotaxie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025502</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>VWR</td><td>CACB356008</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Disques magnétiques</td><td>Indigo Instruments</td><td>44202-1</td><td>5 mm de diamètre, 1 mm d’épaisseur</td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine</td><td> Sigma-Aldrich</td><td>R4127-5G</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa solution de coloration</td><td>Rowley Biochemical Inc.</td><td>G-472-1-8OZ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Direct Human Neutrophiles Isolation </td><td>Kit STEMCELL Technologies Inc</td><td>19666</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé Nikon Ti-U</td> Chambre environnementale du microscope <td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>.</td><td>InVivo Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CCD</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi1</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode intégrale pour l&#39;analyse rapide de la chimiotaxie des neutrophiles directement à partir d&#39;une goutte de sang

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

La migration des neutrophiles et la chimiotaxie sont essentielles pour le système immunitaire de notre corps. Les dispositifs microfluidiques sont de plus en plus utilisés pour étudier la migration des neutrophiles et la chimiotaxie en raison de leurs avantages dans la visualisation en temps réel, un contrôle précis de la génération de gradient de la concentration chimique et une réduction de la consommation de réactifs et d&#39;échantillons. Récemment, les chercheurs en microfluidique ont fait de plus en plus d&#39;efforts pour développer des systèmes d&#39;analyse de chimiotaxie microfluidiques intégrés et facilement exploités, directement à partir de sang total. Dans cette direction, la première méthode tout-sur-puce a été développée pour intégrer la purification négative magnétique des neutrophiles et l&#39;analyse chimiotaxique à partir de petits échantillons de volume sanguin. Cette nouvelle méthode permet un test de chimiotaxie neutrophile rapide à l&#39;échantillon à 25 minutes. Dans cet article, nous fournissons une méthode détaillée de construction, d&#39;exploitation et d&#39;analyse de données pour ce test de chimiotaxie tout-sur-puce avec une discussion sur les stratégies de dépannage, limiTations et directions futures. Les résultats représentatifs du test de chimiotaxie des neutrophiles d&#39;un test chimiochimique défini, du N -Formométhyl-Met-Leu-Phe (fMLP) et des expectorations d&#39;un patient souffrant d&#39;une maladie pulmonaire obstructive chronique (COPD), en utilisant cette méthode tout-sur-puce sont présentés. Cette méthode s&#39;applique à de nombreuses recherches liées à la migration cellulaire et aux applications cliniques.

Les neutrophiles sont sélectionnés négativement à partir d&#39;une goutte de sang total directement dans le dispositif microfluidique. La pureté des neutrophiles isolés a été vérifiée par la coloration Giemsa sur puce et les résultats ont montré les noyaux typiques en forme d&#39;anneau et de lobe des neutrophiles ( Figure 2A ) 25 . Ceci indique une isolation efficace des neutrophiles sur puce à haute pureté à partir d&#39;un petit vo...

Cet article fournit la méthode détaillée pour effectuer un dosage rapide de la chimiotaxie des neutrophiles en intégrant l&#39;isolement des neutrophiles sur le puits du sang total et le test de la chimiotaxis sur une seule puce microfluidique.

Une méthode intégrale pour l&#39;analyse rapide de la chimiotaxie des neutrophiles directement à partir d&#39;une goutte de sang

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

L’objectif global de cette procédure est de démontrer une méthode permettant de séparer les neutrophiles d’une goutte de sang total, puis d’effectuer un test de chimiotaxie ultérieur à l’aide d’un seul dispositif microfluidique. Cette méthode fournit notre code pour effectuer un test de chimiotaxie des neutrophiles en utilisant un petit volume de sang total. Et peut être facilement appliqué par les chercheurs pour répondre à des questions biologiques liées à la migration des cellules immunitaires.Le principal avantage de cette technique est l’intégration et notre test de chimiotaxie sur un seul dispositif microfluidique. Cela permet d’assembler et d’analyser en 25 minutes. Pour commencer, préparez le maître maldus décrit dans le protocole de texte d’accompagnement.Ensuite, silanisez la surface du moule SU8 pour faciliter la libération des PDMS du moule. Ensuite, mélangez 40 grammes de base PDMS et quatre grammes de l’agent porteur dans un bécher en plastique. Placez le moule maître SU8 préparé dans une boîte de Pétri et versez soigneusement la solution mixte PDMS sur le moule.Placez la boîte de Pétri dans un dessiccateur et appliquez un vide pour dégazer la solution PDMS pendant 20 minutes. Ensuite, placez la boîte de Pétri dans un four et faites durcir le PDMS à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Après la cuisson, coupez et décollez soigneusement la plaque PDMS du moule SU8.Coupez la dalle PDMS pour la séparer en dispositifs individuels. Coupez le dispositif PDMS pour faire deux parois autour de l’orifice de chargement de la cellule pour maintenir les aimants. Ensuite, perforez l’orifice de chargement de la cellule à l’aide d’un perforateur de trois millimètres de diamètre.Ensuite, passez à un poinçon de six millimètres et retirez les réservoirs d’entrée de produits chimiques dans la sortie des déchets. À l’aide d’un morceau de ruban adhésif, enlevez la poussière à la surface de la dalle PDMS. Placez la plaque propre dans une lame de verre propre dans la machine à plasma.Appliquez l’aspirateur pendant trois minutes. Ensuite, allumez l’alimentation plasma et réglez le niveau sur élevé. Ajustez doucement la soupape d’air et traitez au plasma le PDMS et la lame de verre pendant trois minutes.Lorsque vous avez terminé, éteignez l’alimentation plasma et relâchez le vide. Retirez soigneusement la dalle PDMS dans la lame de verre à l’aide d’une pince à épiler, placez immédiatement la dalle PDMS sur la lame de verre, avec les structures de canaux vers le bas, appuyez doucement sur la dalle PDMS pour la lier au verre, puis remplissez immédiatement le canal microfluidique avec de l’eau désionisée. Les PDMS étaient généralement pressés sur le substrat de verre pour éviter dans le puits dans le canal barrière.Retirez l’eau déminéralisée de l’appareil et ajoutez 100 microlitres de solution de fribronectine par la sortie. Attendez trois minutes pour vous assurer que tous les canaux sont remplis d’une solution de fibronectine. Ensuite, incubez l’appareil dans une boîte de Pétri couverte pendant une heure à température ambiante.Ensuite, retirez la solution de fibronectine de l’appareil et ajoutez 100 microlitres de milieu de migration à partir de la sortie. Encore une fois, attendez trois minutes pour vous assurer que tous les canaux sont remplis avec le milieu de migration. Incuber l’appareil pendant une autre heure à température ambiante avant de l’utiliser dans l’expérience de chimiotaxie.Placez dix microlitres de sang total dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez deux microlitres du cocktail d’anticorps. Et deux microlitres de particules magnétiques provenant d’un kit d’isolement des neutrophiles et mélangez doucement le tube afin de marquer magnétiquement les cellules marquées par des anticorps.Incuber le mélange d’étiquettes pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, fixez deux petits disques magnétiques sur les deux côtés du port de chargement de cellule de l’appareil. Aspirez le support de tous les ports de l’appareil.Ensuite, pipetez lentement deux microlitres du mélange sanguin marqué dans le dispositif microfluidique à partir de l’orifice de chargement de la cellule. Placez le dispositif microfluidique sur la platine du microscope à température contrôlée à 37 degrés Celsius. Attendez quelques minutes jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de neutrophiles soient piégés dans la zone d’amarrage des cellules.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de chimioattractant et 100 microlitres de milieu de migration dans leurs réservoirs d’entrée désignés à l’aide de deux pipettes. Cela générera un gradient chimioattirant par mélange chimique continu basé sur le flux laminaire. Le chimioattractant peut être des protéines recombinantes telles que le FMLP ou un échantillon clinique tel que le surnageant des expectorations de patients atteints de BPCO.Une fois l’écoulement stabilisé, acquérez des images de fluorescence du gradient de dextron FitZ dans le canal. Ensuite, incubez l’appareil sur la platine du microscope à température contrôlée ou dans un incubateur de culture cellulaire conventionnel pendant 15 minutes. Après l’incubation, imagez le canal de gradient à l’aide d’un objectif dix fois pour enregistrer les positions finales de la cellule pour l’analyse des données.Les neutrophiles sont sélectionnés négativement à partir d’une goutte de sang total directement dans le dispositif microfluidique à l’aide d’un marquage par anticorps à particules magnétiques et d’une paire d’aimants. Afin de confirmer la pureté des neutrophiles isolés sur puce, une coloration Giemsa a été effectuée. Les résultats montrent les noyaux typiques en forme d’anneau et de lobe des neutrophiles.Après le chargement des cellules, la structure d’amarrage aligne efficacement les cellules à côté du canal de gradient avant d’appliquer un gradient chimique. Lorsqu’il est exposé à un gradient chimique pendant 15 minutes, une chimiotaxie se produit. Et peut être mesuré à l’aide de l’imagerie.Ces résultats montrent qu’après 15 minutes, peu de cellules ont rampé à travers le canal barrière dans l’échantillon contrôlé en milieu. En revanche, de nombreux neutrophiles se sont rapidement déplacés à travers le canal barrière et ont migré vers un gradient FMLP de 100 nanomolaires. Une fois que cela peut envoyer une chimiotaxie directement de notre en 25 minutes.Il s’agit d’un outil utile pour les chercheurs afin d’étudier la mécanique de la migration des cellules entières. Et un outil pour les applications cliniques.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ce protocole décrit le développement d'un dispositif microfluidique pour étudier la chimiotaxie bactérienne dans des gradients de concentration stable de chemoeffectors.

Un dispositif microfluidique pour quantifier chimiotactisme des bactéries dans des gradients de concentration stable

Cette vidéo montre le dosage de la chimiotaxie des neutrophiles à l’aide d’une méthode tout-on-puce. La méthode permet d’isoler directement les neutrophiles du sang entier par sélection immunomagnétique négative suivie d’un test de chimiotaxie sur une puce microfluidique.

Méthode basée sur une puce microfluidique pour l’analyse rapide de la chimiotaxie des neutrophiles à l’aide de sang total

Dans cet article, nous présentons une puce microfluidique pour l'analyse d'une seule cellule. Il permet la quantification des protéines intracellulaires, des enzymes, des cofacteurs, et des seconds messagers à l'aide de dosages ou des dosages immunologiques par fluorescence.

Une puce microfluidique pour l&#39;analyse chimique polyvalente de cellules isolées

Ce protocole détaille un test destiné à mesurer la chimiotaxie des neutrophiles humaine d'une gouttelette de sang total avec une reproductibilité robuste. Cette approche évite la nécessité d'une séparation des neutrophiles et ne nécessite que quelques minutes de test de temps de préparation. La puce microfluidique permet la mesure répétée de la chimiotaxie des neutrophiles au fil du temps chez les nourrissons ou les petits mammifères, où le volume de l'échantillon est limité.

Plate-forme microfluidique pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles du sang entier non transformé

Un procédé de quantification de l'adhésion des neutrophiles est rapporté. Cette méthode permet de créer un environnement dynamique d'écoulement semblable à celle rencontrée dans un vaisseau sanguin. Il permet à l'enquête de l'adhésion des neutrophiles soit à des molécules purifiées d'adhésion (ligand) ou substrat de cellules endothéliales (HUVEC) dans un contexte similaire à l'environnement in vivo avec contrainte de cisaillement.

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essais de chimiotaxie visuels sont essentiels pour une meilleure compréhension de la façon dont les cellules eucaryotes contrôler la migration cellulaire chimiotactique directionnelle médiée. Ici, nous décrivons des méthodes détaillées pour: 1) en temps réel, la surveillance à haute résolution de plusieurs essais de chimiotaxie, et 2) visualisant simultanément le gradient chimiotactique et la dynamique spatio-temporelle des événements dans les cellules HL60 neutrophiles comme la signalisation.

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Protocoles pour une évaluation quantitative de la chimiotaxie des lymphocytes et des migrations sont des outils importants pour la recherche de l’immunologie. Un protocole in vitro est décrit ici, que les permis en temps réel, multiplexés évaluation de la migration cellulaire, ainsi qu’un complémentaire en vivo technique propice suivi de cellules natives de rate.

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