Une méthode intégrale pour l'analyse rapide de la chimiotaxie des neutrophiles directement à partir d'une goutte de sang

L’objectif global de cette procédure est de démontrer une méthode permettant de séparer les neutrophiles d’une goutte de sang total, puis d’effectuer un test de chimiotaxie ultérieur à l’aide d’un seul dispositif microfluidique. Cette méthode fournit notre code pour effectuer un test de chimiotaxie des neutrophiles en utilisant un petit volume de sang total. Et peut être facilement appliqué par les chercheurs pour répondre à des questions biologiques liées à la migration des cellules immunitaires.

Le principal avantage de cette technique est l’intégration et notre test de chimiotaxie sur un seul dispositif microfluidique. Cela permet d’assembler et d’analyser en 25 minutes. Pour commencer, préparez le maître maldus décrit dans le protocole de texte d’accompagnement.

Ensuite, silanisez la surface du moule SU8 pour faciliter la libération des PDMS du moule. Ensuite, mélangez 40 grammes de base PDMS et quatre grammes de l’agent porteur dans un bécher en plastique. Placez le moule maître SU8 préparé dans une boîte de Pétri et versez soigneusement la solution mixte PDMS sur le moule.

Placez la boîte de Pétri dans un dessiccateur et appliquez un vide pour dégazer la solution PDMS pendant 20 minutes. Ensuite, placez la boîte de Pétri dans un four et faites durcir le PDMS à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Après la cuisson, coupez et décollez soigneusement la plaque PDMS du moule SU8.

Coupez la dalle PDMS pour la séparer en dispositifs individuels. Coupez le dispositif PDMS pour faire deux parois autour de l’orifice de chargement de la cellule pour maintenir les aimants. Ensuite, perforez l’orifice de chargement de la cellule à l’aide d’un perforateur de trois millimètres de diamètre.

Ensuite, passez à un poinçon de six millimètres et retirez les réservoirs d’entrée de produits chimiques dans la sortie des déchets. À l’aide d’un morceau de ruban adhésif, enlevez la poussière à la surface de la dalle PDMS. Placez la plaque propre dans une lame de verre propre dans la machine à plasma.

Appliquez l’aspirateur pendant trois minutes. Ensuite, allumez l’alimentation plasma et réglez le niveau sur élevé. Ajustez doucement la soupape d’air et traitez au plasma le PDMS et la lame de verre pendant trois minutes.

Lorsque vous avez terminé, éteignez l’alimentation plasma et relâchez le vide. Retirez soigneusement la dalle PDMS dans la lame de verre à l’aide d’une pince à épiler, placez immédiatement la dalle PDMS sur la lame de verre, avec les structures de canaux vers le bas, appuyez doucement sur la dalle PDMS pour la lier au verre, puis remplissez immédiatement le canal microfluidique avec de l’eau désionisée. Les PDMS étaient généralement pressés sur le substrat de verre pour éviter dans le puits dans le canal barrière.

Retirez l’eau déminéralisée de l’appareil et ajoutez 100 microlitres de solution de fribronectine par la sortie. Attendez trois minutes pour vous assurer que tous les canaux sont remplis d’une solution de fibronectine. Ensuite, incubez l’appareil dans une boîte de Pétri couverte pendant une heure à température ambiante.

Ensuite, retirez la solution de fibronectine de l’appareil et ajoutez 100 microlitres de milieu de migration à partir de la sortie. Encore une fois, attendez trois minutes pour vous assurer que tous les canaux sont remplis avec le milieu de migration. Incuber l’appareil pendant une autre heure à température ambiante avant de l’utiliser dans l’expérience de chimiotaxie.

Placez dix microlitres de sang total dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez deux microlitres du cocktail d’anticorps. Et deux microlitres de particules magnétiques provenant d’un kit d’isolement des neutrophiles et mélangez doucement le tube afin de marquer magnétiquement les cellules marquées par des anticorps.

Incuber le mélange d’étiquettes pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, fixez deux petits disques magnétiques sur les deux côtés du port de chargement de cellule de l’appareil. Aspirez le support de tous les ports de l’appareil.

Ensuite, pipetez lentement deux microlitres du mélange sanguin marqué dans le dispositif microfluidique à partir de l’orifice de chargement de la cellule. Placez le dispositif microfluidique sur la platine du microscope à température contrôlée à 37 degrés Celsius. Attendez quelques minutes jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de neutrophiles soient piégés dans la zone d’amarrage des cellules.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de chimioattractant et 100 microlitres de milieu de migration dans leurs réservoirs d’entrée désignés à l’aide de deux pipettes. Cela générera un gradient chimioattirant par mélange chimique continu basé sur le flux laminaire. Le chimioattractant peut être des protéines recombinantes telles que le FMLP ou un échantillon clinique tel que le surnageant des expectorations de patients atteints de BPCO.

Une fois l’écoulement stabilisé, acquérez des images de fluorescence du gradient de dextron FitZ dans le canal. Ensuite, incubez l’appareil sur la platine du microscope à température contrôlée ou dans un incubateur de culture cellulaire conventionnel pendant 15 minutes. Après l’incubation, imagez le canal de gradient à l’aide d’un objectif dix fois pour enregistrer les positions finales de la cellule pour l’analyse des données.

Les neutrophiles sont sélectionnés négativement à partir d’une goutte de sang total directement dans le dispositif microfluidique à l’aide d’un marquage par anticorps à particules magnétiques et d’une paire d’aimants. Afin de confirmer la pureté des neutrophiles isolés sur puce, une coloration Giemsa a été effectuée. Les résultats montrent les noyaux typiques en forme d’anneau et de lobe des neutrophiles.

Après le chargement des cellules, la structure d’amarrage aligne efficacement les cellules à côté du canal de gradient avant d’appliquer un gradient chimique. Lorsqu’il est exposé à un gradient chimique pendant 15 minutes, une chimiotaxie se produit. Et peut être mesuré à l’aide de l’imagerie.

Ces résultats montrent qu’après 15 minutes, peu de cellules ont rampé à travers le canal barrière dans l’échantillon contrôlé en milieu. En revanche, de nombreux neutrophiles se sont rapidement déplacés à travers le canal barrière et ont migré vers un gradient FMLP de 100 nanomolaires. Une fois que cela peut envoyer une chimiotaxie directement de notre en 25 minutes.

Il s’agit d’un outil utile pour les chercheurs afin d’étudier la mécanique de la migration des cellules entières. Et un outil pour les applications cliniques.