Un multi-trous Cryovial Elimine congélation lorsque les artefacts sont les tissus musculaires directement Immergé dans l'azote liquide
6 avril 2017
Ce protocole décrit un procédé pour congeler les tissus musculaires en les plongeant directement dans l'azote liquide. Ce protocole met également en évidence une nouvelle cryovial qui permet d'éviter « l'effet de couverture » de l'azote gazeux lorsque les contacts de l'azote liquide de la surface tissulaire d'un échantillon.
L'objectif général de cette procédure est de congeler des tissus musculaires en les plongeant directement dans de l'azote liquide tout en éliminant les artefacts de congélation. Maozhang He, un étudiant de mon laboratoire, démontrera cette procédure avec Yizhong Huang. Commencez par indiquer l'identité de l'échantillon sur chaque flacon cryogénique.
Ensuite, préparez le matériel suivant : une cuve d'azote liquide, des lunettes de sécurité ou un écran facial, des gants de congélateur, des pinces de 10 centimètres et des brucelles de 25 centimètres. Préparez également un récipient isolant en polystyrène, du film plastique, un scalpel et des pochettes de reliure PVC au format A4. Pour préparer les échantillons musculaires, commencez par remplir le récipient isolant avec de l'azote liquide.
Moins de cinq minutes après l'obtention de l'échantillon, déposez délicatement celui-ci sur une feuille de plastique de reliure au format A4 et observez l'orientation des fibres musculaires. Ensuite, utilisez un scalpel pour effectuer deux incisions parallèles à travers l'échantillon, dans le sens des fibres musculaires, d'environ 3 centimètres de longueur et espacées de 0,6 centimètre. Taillez le muscle incisé en un rectangle d'environ 0,6 centimètre de large, 0,6 centimètre de haut et 1,5 centimètre de long.
Ensuite, à l’aide de pinces de dix centimètres, placez délicatement l’échantillon sur un morceau de film plastique, l’axe longitudinal du muscle incisé étant parallèle au bord long du film. Placez le tissu musculaire dans la partie inférieure centrale d’un flacon cryogénique étiqueté, juste entre les trous d’entrée, puis fermez hermétiquement le flacon. Pour congeler l’échantillon de tissu, utilisez une pince de 25 centimètres afin d’immerger rapidement l’ensemble du flacon cryogénique dans de l’azote liquide placé dans un récipient en polystyrène prérefroidi, en attendant que l’azote liquide cesse de bouillir.
L'azote liquide doit être suffisant pour immerger entièrement l'ampoule cryogénique, et l'ampoule cryogénique doit se trouver complètement sous le niveau du liquide. Transférez les échantillons musculaires dans un réservoir d'azote liquide ou dans un congélateur à -80 degrés Celsius pour une conservation à long terme. Il est important d'éviter tout contact accidentel entre les muscles congelés et les récipients ou instruments à température ambiante.
Pour préparer les lames, prérefroidir un cryostat entre 20 degrés celsius et 22 degrés celsius. Retirer et jeter l'ancienne lame de microtome, puis nettoyer le porte-lame et la plaque anti-rouleau dans le cryostat. Ensuite, installer une nouvelle lame de microtome dans le cryostat et régler l'épaisseur de coupe à huit micromètres.
Retirer le flacon cryogénique contenant l'échantillon musculaire du réservoir d'azote liquide ou du congélateur à -80 degrés Celsius, et le placer dans l'azote liquide ou sur de la glace sèche. Ensuite, transférer l'échantillon dans le cryostat et attendre 30 minutes afin que l'échantillon s'équilibre à la température du cryostat. Après avoir utilisé du OCT pour inclure l'échantillon, monter celui-ci dans le porte-échantillon.
Ensuite, découpez des sections de huit micromètres. Montez les sections vers le centre d'une lame microscopique à température ambiante. Placez immédiatement la lame dans une boîte à lames.
Ensuite, placer la boîte de lames dans un congélateur à -80 °C. Ne pas laisser la lame sécher à température ambiante. Comme on le voit ici, des cristaux de glace se sont formés lorsqu'un échantillon de muscle longissimus dorsi de porc a été placé directement dans un congélateur à -80 °C, provoquant un effet bien connu de « trou de gruyère » sur la cryosection musculaire.
Des cristaux de glace se sont également formés lorsque le tissu musculaire a été immergé directement dans de l'azote liquide. En utilisant une autre méthode, de nombreux cristaux de glace en forme d'aiguille se sont formés dans le compartiment cytoplasmique des myofibres lorsque le tissu a été plongé dans du milieu d'incorporation OCT dans l'orientation appropriée, puis rapidement congelé dans une suspension d'isopentane. La congélation du tissu dans la cryovial multipuits permet d'obtenir une excellente intégrité de l'échantillon, avec un compartiment cytoplasmique clairement visible et un alignement étroit des myofibres par rapport au tissu environnant.
À l'aide de cette méthode, l'activité ATPase a été analysée dans les fibres musculaires à contraction rapide et à contraction lente. Lorsqu'elles sont soumises à des durées équivalentes, les fibres à contraction rapide apparaissent claires, avec deux degrés, et les fibres à contraction lente apparaissent noires. Dans une méthode de congélation standard illustrée ici, le tissu musculaire a été plongé dans une suspension d'isopentane sans contact direct avec le milieu de montage OCT, toutefois l'état solide de la suspension liquide d'isopentane est difficile à maintenir pendant plus d'une heure, et l'isopentane n'est pas toujours disponible.
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Aperçu
Ce protocole décrit une procédure permettant de congeler des tissus musculaires en les plongeant directement dans de l'azote liquide tout en éliminant les artéfacts de congélation. Il met également en évidence un nouveau cryotube conçu pour éviter l'effet d'« écran » du gaz d'azote lorsque l'azote liquide entre en contact avec la surface du tissu.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie
- Cryopréservation
Contexte
- La congélation des tissus musculaires est essentielle pour préserver les échantillons destinés à des analyses ultérieures.
- Les méthodes traditionnelles peuvent introduire des artefacts de congélation qui compromettent l'intégrité des échantillons.
- L'azote liquide est couramment utilisé pour la congélation rapide.
- Le nouveau cryotube vise à améliorer le processus de congélation en minimisant les effets des gaz.
Objectif de l'étude
- Démontrer une méthode efficace pour la congélation de tissus musculaires.
- Présenter un nouveau cryotube améliorant la conservation des échantillons.
- Fournir un protocole clair aux chercheurs du domaine.
Méthodes utilisées
- Étiqueter l'identité des échantillons sur des vials cryogéniques.
- Organiser le matériel nécessaire, y compris le réservoir d'azote liquide et les équipements de protection.
- Remplir un récipient isotherme avec de l'azote liquide pour la préparation des échantillons.
- Utiliser des pinces et des brucelles pour manipuler les échantillons.
Résultats principaux
- Le protocole fige efficacement les tissus musculaires sans introduire d'artéfacts.
- Le nouveau cryotube atténue avec succès l'effet de couverture du gaz d'azote.
- La démonstration de la procédure apporte de la clarté aux chercheurs.
- Les mesures de sécurité sont soulignées tout au long du protocole.
Conclusions
- Cette méthode constitue une approche fiable pour la congélation des tissus musculaires.
- Le nouveau design des cryotubes améliore la préservation des échantillons biologiques.
- Le suivi de ce protocole peut améliorer la qualité des échantillons congelés pour les recherches futures.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La préservation de l'intégrité tissulaire lors de la cryoconservation est essentielle pour des analyses en aval fiables en physiologie musculaire et en recherche préclinique. La formation de cristaux de glace et les effets de barrière à la vapeur dégradent la qualité des coupes, entraînant des artéfacts qui masquent les compartiments cytoplasmiques et l'adjacence entre les myofibres et les tissus. Ce protocole répond à un défi clé en phase de découverte en permettant une congélation sans artéfacts des tissus musculaires par immersion directe dans de l'azote liquide à l'aide d'un cryotube modifié, améliorant ainsi la qualité des échantillons pour la validation ciblée et les études mécanistiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet une visualisation claire des compartiments cytoplasmiques et une apposition étroite des myofibres, facilitant une évaluation précise des phénotypes des fibres musculaires.
- Valeur opérationnelle : Élimine les artefacts de congélation susceptibles de fausser l'interprétation de l'activité ATPasique et la classification des types de fibres.
- Valeur prédictive : Fournit des sections tissulaires fiables pour les tests fonctionnels, réduisant les faux négatifs dans les études d'engagement ciblé.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Produit des cryosections de haute qualité, adaptées aux tests immunohistochimiques et enzymatiques nécessitant une morphologie subcellulaire intacte.
- Valeur opérationnelle : Offre une alternative plus simple et compatible avec un débit élevé au congélation à base d'isopentane, en particulier là où les solvants inflammables sont restreints.
- Préparation aux tests : Standardise la préparation des tissus, améliorant ainsi la reproductibilité entre les campagnes de criblage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Préserve l'architecture tissulaire native, permettant une extrapolation valide des découvertes vers les modèles précliniques.
- Dérisquage mécanistique : Réduit l'ambiguïté des lectures histologiques en minimisant les artefacts induits par la préparation.
- Système pertinent pour les maladies : Applicable aux modèles de muscle squelettique utilisés dans la recherche sur les maladies neuromusculaires et métaboliques.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre dans le flux de travail de découverte, de la collecte des tissus jusqu'à la coupe et à l'analyse, permettant une progression fiable vers des tests fonctionnels et la validation de cibles.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses en préservant l'intégrité des tissus pour une analyse phénotypique précise des fibres musculaires.
- Criblage : Génère des sections reproductibles et sans artefacts pour des lectures d'essais de haute fidélité.
- Analytique : Permet des mesures quantitatives de la spécificité des types de fibres et de la clarté cytoplasmique.
- Recherche translationnelle : Préserve la fidélité tissulaire assurant une continuité préclinique dans les modèles de maladies musculaires.
- Réutilisation en entreprise : La conception réutilisable des cryotubes permet une standardisation entre laboratoires et projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans les données histologiques grâce à l'élimination des artéfacts cristallins de glace.
- Valeur opérationnelle : Procédé de congélation standardisé et évolutif, sans recours à l'isopentane inflammable.
- Valeur stratégique : Réduit le risque d'échec des expériences dû à une mauvaise qualité des coupes, améliorant ainsi l'efficacité du capital.
- Impact sur le portefeuille : Permet de prendre des décisions d'orientation fiables (à faire ou à ne pas faire) fondées sur des données solides de validation ciblée.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une formation de base en histologie et une maîtrise du cryostat.
- Exige un accès à de l'azote liquide et à des équipements de sécurité (gants, écran facial).
- Dépend d'une modification constante des cryotubes (14 orifices d'entrée) pour un fonctionnement optimal.
- Doit éviter tout réchauffement du tissu pendant le transfert afin de prévenir la recristallisation.
- Limité aux tissus suffisamment petits pour tenir dans les dimensions du cryotube.
