Name: Un multi-trous Cryovial Elimine congélation lorsque les artefacts sont les tissus musculaires directement Immergé dans lazote liquide (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Découvrez une méthode de congélation des tissus musculaires par immersion directe dans l'azote liquide sans artefacts de congélation. Ce protocole utilise un cryovial multi-trous pour éliminer l'effet de couverture gazeuse et préserver l'intégrité des échantillons biologiques.

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Ce projet a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC): 31301950 et 31671288.

La méthode actuelle a été établi et validé pour récolter et stocker plus de 1000 échantillons de muscles pour la coloration histologique dans notre laboratoire. Toutes les procédures impliquant les soins des animaux et l&#39;utilisation ont suivi les lignes directrices établies par le ministère de l&#39;Agriculture de la Chine. 1. L&#39;équipement pour le prélèvement d&#39;échantillons <ol><li> L&#39;identité de l&#39;étiquette échantillon sur chaque flacon cryogénique. Remarque: Le flacon cryogénique est spécialement conçu pour congeler des échantillons de tissus frais pour la procédure de cryosection (Figure 1A). Les flacons sont faits de polypropylène dans une usine de moule (Figure 1C). </li><li> Obtenir les équipements suivants: azote liquide dans un réservoir d&#39;azote liquide approprié, des lunettes de sécurité ou un écran facial, des gants de congélation, une pince de 10 cm, 25 une pince à épiler cm, un refroidisseur de mousse de polystyrène (dimensions intérieures: 20 cm de longueur x 12 cm de largeur x 13,5 cm de hauteur ; dimensions extérieures: 24 cm de long x 16 cm de largeur x 15 cm de haut), film de matière plastique (2,5 cm long x 0,8 cm de largeur x épaisseur 0,1 mm),un scalpel, et A4 couvercles de liaison en PVC (21 cm x 29,5 cm) (figure 1B). </li></ol> 2. Préparation des échantillons musculaires <ol><li> Remplir le refroidisseur de mousse de polystyrène avec de l&#39;azote liquide 5 min avant la collecte des échantillons. REMARQUE: La grande colonne d&#39;azote liquide est essentielle parce qu&#39;une partie de l&#39;azote liquide se résume loin et se transforme en gaz lorsque toucher des échantillons frais il. Afin de réduire la fréquence de transfert de l&#39;azote liquide pour reconstituer la perte, un refroidisseur en polystyrène de taille appropriée doit être acquise à l&#39;avance en fonction du nombre d&#39;échantillons. </li><li> Une fois qu&#39;un échantillon est obtenu, placer délicatement sur une feuille de couverture de liaison A4 PVC et d&#39;observer la direction des fibres musculaires. REMARQUE: Ici, nous avons utilisé la section du muscle long dorsal doris de la première à la dernière vertèbre lombaire chez le porc. Les échantillons sont environ 12 cm de long, 8 cm de large et 5 cm de haut. </li><li> Utilisez un scalpel pour réaliser deux incisions parallèles à travers l&#39;échantillon in la direction des fibres musculaires, à environ 3 cm de longueur et 0,6 cm de distance. Coupez le muscle incisés dans un rectangle d&#39;environ 0,6 cm de large x 0,6 cm de hauteur x 1,5 cm de long. REMARQUE: La fiabilité de la mesure de la surface de section transversale des fibres musculaires dépend essentiellement de l&#39;orientation des fibres du muscle incisé. </li><li> Utiliser des pinces 10 cm de mettre doucement l&#39;échantillon sur un morceau de film plastique, avec l&#39;axe longitudinal du muscle incisé parallèle au bord long de la feuille (figure 2A). REMARQUE: le film en matière plastique a deux fonctions: une fonction de maintien qui aide à fixer l&#39;orientation des fibres musculaires et d&#39;une fonction d&#39;adhérence qui empêche des fissures dans l&#39;échantillon due à la congélation rapide. </li><li> En utilisant des pinces, placer le tissu musculaire dans le milieu inférieur d&#39;un flacon cryogénique marqué, juste entre les trous d&#39;entrée, puis fermer hermétiquement le flacon (figure 2B). </li></ol> 3. congélation et stockage d&#39;échantillon de muscles <ol><li> En utilisant des pinces 25 cm, plonger rapidement l&#39;ensemble du flacon cryogénique dans l&#39;azote liquide dans le refroidisseur en polystyrène pré-refroidi, dans l&#39;attente jusqu&#39;à ce que l&#39;azote liquide ne bout pas (environ 10 à 20 s). NOTE: Le cryovial flottera lorsque l&#39;azote liquide est en ébullition, donc plonger soigneusement le flacon dans l&#39;azote liquide bouillant pendant 10-20 s. </li><li> Transférer les échantillons de muscles à un réservoir de stockage d&#39;azote liquide ou d&#39;un congélateur à -80 ° C pour le stockage à long terme. </li></ol> 4. Préparation Diapo <ol><li> Pré-refroidir un cryostat à -20 ° C et -22 ° C. </li><li> Enlever et jeter le vieux lame microtome, essuyer le porte-couteau et la plaque anti-roulis dans le cryostat, installer une nouvelle lame microtome dans le cryostat, et régler l&#39;épaisseur de coupe de 8 um. </li><li> Transférer l&#39;échantillon de muscle dans le flacon cryogénique du réservoir de stockage d&#39;azote liquide ou -80 ° C congélateur au cryostat, le transporter dans de l&#39;azote liquide ou de la glace sèche. </li&gt; <li> Attendre 30 min pour l&#39;échantillon à équilibrer la température du cryostat. NOTE: Tout équipement qui pourrait toucher l&#39;échantillon doit être pré-refroidi, car une température élevée peut provoquer la formation de cristaux de glace dans l&#39;échantillon. </li><li> Monter l&#39;échantillon dans le porte-échantillon en vertu de la formulation de température de coupe optimale des glycols et des résines solubles dans l&#39;eau (OCT). Couper des sections de 8 um. REMARQUE: Réglage de l&#39;angle de coupe perpendiculairement à l&#39;orientation des fibres musculaires, parce que la CSAF est la surface en coupe transversale des fibres musculaires. </li><li> Monter les sections vers le centre d&#39;une microplaque à température ambiante. Placer immédiatement la lame dans une zone de glissement dans un congélateur à -80 ° C. Ne pas laisser la lame sécher à la température ambiante. </li></ol>

<ol><li>Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+fresh+meat+quality+through+manipulation+of+muscle+fiber+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics.</a> Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).</li>
<li>Lefaucheur, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+look+into+fibre+typing--relation+to+meat+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">A second look into fibre typing--relation to meat quality.</a> Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).</li>
<li>Fiems, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+Muscling+in+Cattle%3A+Genes%2C+Husbandry%2C+Carcasses+and+Meat%5BTitle%5D)+AND+%22Animals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat.</a> Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).</li>
<li>Cockett, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+callipyge+mutation+and+other+genes+that+affect+muscle+hypertrophy+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Sel+Evol%22%5BJournal%5D)">The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep.</a> Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).</li>
<li>Stinckens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RYR1+g.1843C%3ET+mutation+is+associated+with+the+effect+of+the+IGF2+intron3-g.3072G%3EA+mutation+on+muscle+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Genet%22%5BJournal%5D)">The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy.</a> Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).</li>
<li>Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+and+hormonal+control+of+skeletal-muscle+cell+growth+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nutr+Soc%22%5BJournal%5D)">Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation.</a> Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).</li>
<li>Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+water+content+in+rats+measured+by+desiccation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue water content in rats measured by desiccation.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).</li>
<li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+triage+and+freezing+for+models+of+skeletal+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), e52793(2015).</li>
<li>Meijer, A. E., Vloedman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histochemical+characterization+of+the+coupling+state+of+skeletal+muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria.</a> Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).</li>
<li>Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201500156343">Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis).</a> Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).</li>
<li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDubowitz%2C+V+%22Muscle+Biopsy%3A+A+Practical+Approach%22">Muscle Biopsy: A Practical Approach</a>. , Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).</li>
<li>Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.elsevier.ca/ISBN/9780702042263/Bancrofts-Theory-and-Practice-of-Histological-Techniques">Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e</a>. , Elsevier. (2008).</li>
<li>Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/222964817_Bubble_Size_in_Coalescence_Dominant_Regime_of_Turbulent_Air-Water_Flow_Through_Horizontal_Pipes">Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe.</a> J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).</li>
<li>Fukutomi, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/kikaib1979/53/496/53_496_3516/_article">A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field.</a> Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).</li>
<li>Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201500029141">Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation.</a> Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêts, financiers ou autres, sont déclarés par les auteurs.

Nous décrivons ici une nouvelle cryovial plusieurs trous pour la congélation et le stockage de tissus musculaires pour effectuer des évaluations histologiques de la fonction musculaire. L&#39;étape critique dans la modification de ce protocole est que l&#39;échantillon dans le tube cryogénique à trous multiples est immergé directement dans de l&#39;azote liquide. À notre connaissance, c&#39;est la façon la plus simple et rapidest pour obtenir d&#39;excellents échantillons congelés pour cryosectioning musculaire parmi le...

Le muscle squelettique est le composant le plus précieux d&#39;un animal producteur de viande du point de vue nutritionnel et de traitement. Dans l&#39;industrie de la viande, il y a deux aspects particulièrement critiques: l&#39;efficacité de la croissance musculaire et la qualité de la viande résultant. En tant que composant principal du muscle, les fibres musculaires sont directement liées à la performance de la croissance et la qualité de la viande fraîche chez les animaux 1. Par exemple, le nombre total de fibres (TNF) et la zone transversale des fibres (CSAF) déterminent principalement la masse musculaire et la qualité de la viande; En outre, le type de fibre Composition (FTC) affecte fortement la qualité de la viande fraîche 2. Par conséquent, la manipulation des caractéristiques de la fibre musculaire chez les animaux est une méthode très efficace pour augmenter la rentabilité de base et de la compétitivité des exploitations 1. À ce jour, plusieurs facteurs intrinsèques et extrinsèques ont été identifiés pour manipuler la fibre musculaire caractéristique etics 1. Cette manipulation peut être réalisé par la sélection ciblée des animaux avec des gènes spécifiques, tels que le gène de myostatine chez les bovins 3, le gène Callipyge chez le mouton 4, et les gènes RYR1 et IGF2 chez les porcs 5. En outre, le contrôle de l&#39; alimentation et des traitements avec des hormones spécifiques jouent un rôle important dans les caractéristiques des fibres musculaires 6. Ainsi, une approche qui combine des facteurs génétiques et nutritionnels pourrait être en mesure d&#39;améliorer la teneur en viande maigre et la qualité de la viande. Cependant, des études sur les fibres musculaires sont limitées dans l&#39;industrie de la viande parce que l&#39;élucidation de la structure des fibres musculaires est toujours un défi. les propriétés des fibres musculaires sont identifiés en utilisant des procédés histochimiques, tels que le dosage de l&#39;adénosine triphosphatase de myosine (ATPase). Cette méthode repose sur le fait que les enzymes situé dans des coupes congelées minces (6-8 pm) deles fibres musculaires peuvent être amenés à réagir chimiquement avec certains produits. Cependant, la teneur en eau des muscles est supérieure à 75% chez les porcs, les lapins, les souris et les humains, quelle que soit la position (c. -à- dos, l&#39; abdomen, ou des membres postérieurs) 7. Un tel taux d&#39;humidité élevé dans les muscles provoque un problème fréquemment rencontré - artefacts de congélation - lors de la préparation de coupes cryogéniques, comme décrit précédemment 8, 9. Dans la plupart des cas, il est presque impossible de geler de façon appropriée les tissus musculaires dans une ligne de production d&#39;abattoir, selon notre expérience. Le protocole présenté ici décrit une méthode simple et efficace utilisé dans notre laboratoire pour geler les tissus musculaires pour cryosectioning de manière à haut débit. Le point culminant de cette méthode est une nouvelle cryovial qui est conçu pour les tissus musculaires surgélation dans l&#39;azote liquide. Le flux de travail peut faciliter en même temps que le tissucongélation et de traitement pour un excellent cryosection musculaire, avec un compartiment cytoplasmique clairement visible et l&#39;apposition serré de fibres musculaires au tissu environnant. De plus, ce protocole peut être appliqué à un large éventail d&#39;options pour l&#39;analyse des tissus parce que l&#39;azote liquide ne se mélange pas avec les tissus.

<table><tbody><tr><td>Microtome cryostat</td><td>&nbsp ; </td> Microscope numérique <td>Leica Leica CM1950</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon,</td><td>Nikon DS-U3</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Flacon cryogénique &nbsp ; Film</td><td></td><td></td> plastique <td>Conçu par nous-mêmes</td></tr><tr><td>Azote</td><td></td><td></td> liquide Scalpel <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> utilisé par <td>Commomly</td></tr><tr><td>Pince de 10 cm Pince</td><td></td><td></td> de 25 cm <td>utilisée par Commomly</td></tr><tr><td>Verre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>de sécurité</td> Gants <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>de congélation utilisés par Commomly</td><td>Utilisé en commun</td></tr></tbody></table>

un multi-trous cryovial elimine congélation lorsque les artefacts sont les tissus musculaires directement immergé dans l&#39;azote liquide

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Les études sur la physiologie des muscles squelettiques doivent relever le défi technique du traitement de façon appropriée les échantillons pour obtenir des sections avec des compartiments cytoplasmiques clairement visibles. Un autre obstacle est serré de l&#39;apposition myofibres aux tissus environnants. Du fait que le processus de fixation de tissu et inclusion dans la paraffine conduit à la contraction des fibres musculaires, la congélation est un moyen optimal de durcissement des tissus musculaires pour le sectionnement. Cependant, un problème fréquemment rencontré, la formation de cristaux de glace, se produit lors de la préparation des coupes congelées en raison de la forte teneur en eau du muscle. Le protocole présenté ici d&#39;abord décrit une méthode simple et efficace pour la congélation correctement les tissus musculaires en les plongeant dans de l&#39;azote liquide. Le problème avec l&#39;utilisation de l&#39;azote liquide seul est qu&#39;il provoque la formation d&#39;une barrière de gaz d&#39;azote à côté du tissu, qui agit comme un isolant et empêche le refroidissement des tissus. Pour éviter cet effet « couverture vapeur », un new cryovial a été conçu pour augmenter la vitesse d&#39;écoulement du liquide autour de la surface du tissu. Ceci a été réalisé en découpant un total de 14 trous d&#39;entrée dans la paroi du flacon. Selon la dynamique des bulles, un taux plus élevé de résultats d&#39;écoulement de liquide en bulles plus petites et moins de chances de former une barrière contre les gaz. Lorsque l&#39;azote liquide circule dans le tube cryogénique à travers les trous d&#39;entrée, la vitesse d&#39;écoulement à travers le tissu est suffisamment rapide pour éliminer la barrière de gaz. Par rapport à la méthode de congélation des tissus musculaires en utilisant isopentane prérefroidi, ce protocole est plus simple et plus efficace et peut être utilisé pour geler les muscles de façon débit. De plus, cette méthode est optimale pour les institutions qui n&#39;ont pas accès à isopentane, qui est extrêmement inflammable à la température ambiante.

L&#39;illustration cryovial et l&#39;équipement de laboratoire commun pour la congélation des muscles lors de la préparation des coupes congelées sont présentés à la figure 1. Les cryotubes sont en polypropylène dans une fabrique de moule. Chaque flacon a un total de 14 trous d&#39;entrée: celui-ci est sur le capuchon; un autre est en bas; et les 12 forment quatre lignes parallèles restantes, chacune avec quatre trous à 90 ° l&#39;un de l&#39;autre. Ces trous d&#39;entré...

Ce protocole décrit un procédé pour congeler les tissus musculaires en les plongeant directement dans l&#39;azote liquide. Ce protocole met également en évidence une nouvelle cryovial qui permet d&#39;éviter « l&#39;effet de couverture » de l&#39;azote gazeux lorsque les contacts de l&#39;azote liquide de la surface tissulaire d&#39;un échantillon.

Un multi-trous Cryovial Elimine congélation lorsque les artefacts sont les tissus musculaires directement Immergé dans l&#39;azote liquide

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

L'objectif général de cette procédure est de congeler des tissus musculaires en les plongeant directement dans de l'azote liquide tout en éliminant les artefacts de congélation. Maozhang He, un étudiant de mon laboratoire, démontrera cette procédure avec Yizhong Huang. Commencez par indiquer l'identité de l'échantillon sur chaque flacon cryogénique.Ensuite, préparez le matériel suivant : une cuve d'azote liquide, des lunettes de sécurité ou un écran facial, des gants de congélateur, des pinces de 10 centimètres et des brucelles de 25 centimètres. Préparez également un récipient isolant en polystyrène, du film plastique, un scalpel et des pochettes de reliure PVC au format A4. Pour préparer les échantillons musculaires, commencez par remplir le récipient isolant avec de l'azote liquide.Moins de cinq minutes après l'obtention de l'échantillon, déposez délicatement celui-ci sur une feuille de plastique de reliure au format A4 et observez l'orientation des fibres musculaires. Ensuite, utilisez un scalpel pour effectuer deux incisions parallèles à travers l'échantillon, dans le sens des fibres musculaires, d'environ 3 centimètres de longueur et espacées de 0,6 centimètre. Taillez le muscle incisé en un rectangle d'environ 0,6 centimètre de large, 0,6 centimètre de haut et 1,5 centimètre de long.Ensuite, à l’aide de pinces de dix centimètres, placez délicatement l’échantillon sur un morceau de film plastique, l’axe longitudinal du muscle incisé étant parallèle au bord long du film. Placez le tissu musculaire dans la partie inférieure centrale d’un flacon cryogénique étiqueté, juste entre les trous d’entrée, puis fermez hermétiquement le flacon. Pour congeler l’échantillon de tissu, utilisez une pince de 25 centimètres afin d’immerger rapidement l’ensemble du flacon cryogénique dans de l’azote liquide placé dans un récipient en polystyrène prérefroidi, en attendant que l’azote liquide cesse de bouillir.L'azote liquide doit être suffisant pour immerger entièrement l'ampoule cryogénique, et l'ampoule cryogénique doit se trouver complètement sous le niveau du liquide. Transférez les échantillons musculaires dans un réservoir d'azote liquide ou dans un congélateur à -80 degrés Celsius pour une conservation à long terme. Il est important d'éviter tout contact accidentel entre les muscles congelés et les récipients ou instruments à température ambiante.Pour préparer les lames, prérefroidir un cryostat entre 20 degrés celsius et 22 degrés celsius. Retirer et jeter l'ancienne lame de microtome, puis nettoyer le porte-lame et la plaque anti-rouleau dans le cryostat. Ensuite, installer une nouvelle lame de microtome dans le cryostat et régler l'épaisseur de coupe à huit micromètres.Retirer le flacon cryogénique contenant l'échantillon musculaire du réservoir d'azote liquide ou du congélateur à -80 degrés Celsius, et le placer dans l'azote liquide ou sur de la glace sèche. Ensuite, transférer l'échantillon dans le cryostat et attendre 30 minutes afin que l'échantillon s'équilibre à la température du cryostat. Après avoir utilisé du OCT pour inclure l'échantillon, monter celui-ci dans le porte-échantillon.Ensuite, découpez des sections de huit micromètres. Montez les sections vers le centre d'une lame microscopique à température ambiante. Placez immédiatement la lame dans une boîte à lames.Ensuite, placer la boîte de lames dans un congélateur à -80 °C. Ne pas laisser la lame sécher à température ambiante. Comme on le voit ici, des cristaux de glace se sont formés lorsqu'un échantillon de muscle longissimus dorsi de porc a été placé directement dans un congélateur à -80 °C, provoquant un effet bien connu de « trou de gruyère » sur la cryosection musculaire.Des cristaux de glace se sont également formés lorsque le tissu musculaire a été immergé directement dans de l'azote liquide. En utilisant une autre méthode, de nombreux cristaux de glace en forme d'aiguille se sont formés dans le compartiment cytoplasmique des myofibres lorsque le tissu a été plongé dans du milieu d'incorporation OCT dans l'orientation appropriée, puis rapidement congelé dans une suspension d'isopentane. La congélation du tissu dans la cryovial multipuits permet d'obtenir une excellente intégrité de l'échantillon, avec un compartiment cytoplasmique clairement visible et un alignement étroit des myofibres par rapport au tissu environnant.À l'aide de cette méthode, l'activité ATPase a été analysée dans les fibres musculaires à contraction rapide et à contraction lente. Lorsqu'elles sont soumises à des durées équivalentes, les fibres à contraction rapide apparaissent claires, avec deux degrés, et les fibres à contraction lente apparaissent noires. Dans une méthode de congélation standard illustrée ici, le tissu musculaire a été plongé dans une suspension d'isopentane sans contact direct avec le milieu de montage OCT, toutefois l'état solide de la suspension liquide d'isopentane est difficile à maintenir pendant plus d'une heure, et l'isopentane n'est pas toujours disponible.

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Congélation manuelle par transfert et par immersion d’échantillons biologiques pour la microscopie électronique cryogénique à particule unique

Ce protocole décrit un nouveau modèle de culture tridimensionnel (3D) utilisant un hydrogel d’hyaluronane lié à la tyramine pour encapsuler et cultiver des follicules préantraux à partir de l’ovaire de souris. Nous détaillons également deux approches de la cryoconservation des follicules ovariens par vitrification.

Application d’un nouvel hydrogel d’hyaluronane pour la culture tridimensionnelle de follicules et méthodologie pour la cryoconservation de follicules ovariens de souris

Découvrez une méthode de congélation des tissus musculaires par immersion directe dans l'azote liquide sans artefacts de congélation. Ce protocole utilise un cryovial multi-trous pour éliminer l'effet de couverture gazeuse et préserver l'intégrité des échantillons biologiques.

Un multi-trous Cryovial Elimine congélation lorsque les artefacts sont les tissus musculaires directement Immergé dans lazote liquide (Vidéo) | JoVE Journal

Un multi-trous Cryovial Elimine congélation lorsque les artefacts sont les tissus musculaires directement Immergé dans l'azote liquide

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