Technique laparoscopiques pour la collecte série de noeuds du foie et mésentérique lymphatiques dans macaques

L’objectif global de cette procédure laparoscopique peu invasive est d’améliorer l’évaluation des effets de la translocation microbienne du tractus gastro-intestinal par la collecte de ganglions lymphatiques mésentériques et de biopsies hépatiques à plusieurs moments tout en améliorant le bien-être animal. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du VIH sur les conséquences immunologiques de l’infection et de la translocation microbienne sur les ganglions lymphatiques mésentériques et le foie, ainsi que sur la pathologie de ces tissus. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’échantillonner à plusieurs moments d’une étude avec un impact minimal sur l’animal ou sur les paramètres évalués.

Cette méthode peut fournir des échantillons essentiels à notre compréhension du VIH. Il peut également être appliqué à d’autres modèles où l’inflammation gastro-intestinale et la translocation microbienne sont importantes. La procédure sera effectuée par le Dr Jeremy Smedley et le Dr Cassie Moats, vétérinaires au Centre national de recherche sur les primates de Washington.

Après avoir préparé un macaque pour la chirurgie comme indiqué dans le protocole textuel, couvrez-le d’un champ fenêtré stérile. Ensuite, à l’aide d’un rideau d’appareil photo stérile, couvrez étroitement l’appareil photo numérique et branchez-le sur la tour. Connectez la lunette rigide à la tête de caméra.

Fixez ensuite un câble de lumière stérile à l’endoscope rigide et connectez-le à la source de lumière. Enfin, montez un tube d’insufflation stérile sur l’insufflateur. Pour commencer la laparoscopie, placez une lame de scalpel de 15 centimètres à environ un à deux centimètres à gauche de l’ombilic et faites une incision d’environ 5 millimètres dans la peau qui atteint les muscles abdominaux.

Avec la main non dominante, soulevez la paroi abdominale du côté crânien de la coupure. Puis, à l’aide de l’autre main, introduisez à travers l’incision la pointe d’une aiguille varus inclinée vers la tête de l’animal. Tenez l’aiguille varus par la tige et poussez-la fermement jusqu’à ce qu’elle s’enclenche à travers la paroi abdominale et que la résistance contre l’aiguille diminue dans la cavité abdominale.

Fixez ensuite le tube de l’insufflateur de CO2 à l’aiguille et ouvrez le robinet d’arrêt pour libérer le gaz dans la cavité abdominale. Créez un pneumopéritoine en atteignant une pression allant jusqu’à 10 à 12 millimètres de mercure. Maintenant que l’abdomen est complètement insufflé, placez la lame du scalpel 15 sur l’abdomen crânien gauche, à environ deux à quatre centimètres caudaux jusqu’à la dernière côte, et faites une incision cutanée d’environ cinq à sept millimètres.

Ensuite, insérez dans la coupe un ensemble de canule de trocart de cinq millimètres. Introduisez l’ensemble à une profondeur d’un à deux centimètres, en le dirigeant à environ 45 à 60 degrés caudomédialement. Ensuite, avec un mouvement de rotation, faites glisser la canule vers l’avant atteignant une profondeur de 1,5 à trois centimètres pour visser la canule dans l’abdomen.

Ensuite, retirez le trocart. Débranchez le tube de l’insufflateur de l’aiguille varus et ensuite, fermez le robinet d’arrêt. Connectez le tube à la canule et ouvrez le robinet d’arrêt pour maintenir le pneumopéritoine.

Une fois que vous avez vérifié que la pression est maintenue avec succès, retirez l’aiguille varus. Ensuite, à travers la canule, insérez l’endoscope rigide dans la cavité abdominale. Sous le contrôle de la caméra, approfondissez l’incision cutanée restante après le retrait de l’aiguille varus, en coupant les muscles abdominaux et le péritoine.

Enfin, positionnez l’animal avec les pieds surélevés à environ 15 à 30 degrés au-dessus de la tête. Pour prélever une biopsie du ganglion lymphatique mésentérique, introduisez une sonde solide dans la cavité abdominale à travers l’incision préparée. Positionnez la sonde entre l’épiploon et l’intestin et, avec un léger mouvement de balayage, exposez l’intestin de l’épiploon pour visualiser le mésentère qui est caché en dessous.

Continuez à déplacer la sonde de la direction caudale vers la direction crânienne pour éloigner l’épiploon du champ opératoire. Ensuite, à l’aide de la sonde, déplacez le côlon descendant vers la paroi abdominale. Examinez le mésentère avec la sonde pour localiser les ganglions lymphatiques mésentériques situés le long du côlon et des vaisseaux mésentériques.

Une fois le ganglion lymphatique identifié, remplacez la sonde dans la cavité abdominale à l’aide d’une pince à cliquet Maryland et saisissez le mésentère adjacent au ganglion. Tirez le mésentère vers l’incision et retirez l’endoscope de la canule. Ensuite, éteignez l’insufflateur et laissez le robinet d’arrêt de la canule ouvert pour libérer le gaz de l’abdomen, ce qui facilitera l’extériorisation du mésentère.

Tirez ensuite le mésentère à travers l’incision. Saisissez le mésentère extériorisé à l’aide d’une pince pour assurer l’accès par l’incision. Palpez ou observez le mésentère pour identifier le ganglion lymphatique qui doit apparaître comme un nodule plus ferme ou une zone plus grise.

Ensuite, à l’aide d’hémostats incurvés, faites une ouverture de trois à cinq millimètres dans le mésentère adjacent au nœud et disséquez brutalement toutes les attaches au tissu. Si nécessaire, ligaturez le système vasculaire avec une suture monofilament non résorbable 4-0 et, à l’aide du scalpel, disséquez le ganglion lymphatique. Ensuite, placez la biopsie dans un milieu RPMI 1640 sur de la glace.

Enfin, relâchez le mésentère et insufflez à nouveau l’abdomen pour permettre de ramener le tissu vers la cavité abdominale. Remettez la table en position horizontale. Pour prélever une biopsie du foie, insérez une canule filetée dans la cavité abdominale à travers l’incision utilisée pour le prélèvement des ganglions lymphatiques.

Ensuite, à l’aide de la canule, glissez la lunette rigide dirigée vers la cavité abdominale crânienne pour visualiser le foie. Sous le contrôle de la caméra, introduisez une pince à biopsie à travers la canule précédemment utilisée pour insuffler la cavité abdominale. Placez la pince sous le bord du lobe du foie désigné de manière à ce que leurs mâchoires fassent face au tissu, et ouvrez la pince pour permettre à la marge de tomber dans les mâchoires.

Après avoir ajusté leur position, fermez la pince et maintenez la pression pendant environ 20 à 30 secondes. Retirez ensuite l’échantillon en tirant doucement la pince à travers la canule. Placez la biopsie dans un milieu RPMI sur de la glace.

Enfin, assurez-vous qu’aucune hémorragie n’est observée sur le site de la biopsie et fermez les incisions. On présente ici les rendements cellulaires obtenus à partir de biopsies de ganglions lymphatiques mésentériques et de foies prélevées sur deux mécaques femelles en bonne santé à deux moments différents. Comme prévu, les biopsies des ganglions lymphatiques ont donné un nombre significativement plus élevé de cellules isolées par rapport aux biopsies du foie.

Quel que soit le tissu source, plus de 85 % des cellules isolées étaient viables. Ensuite, les échantillons de cellules isolées ont été analysés pour les populations de CD45+leucocytes et de CD45+CD3+lymphocytes. Les ganglions lymphatiques mésentériques présentaient des fréquences plus élevées de CD45+leucocytes et de CD3+lymphocytes par rapport aux cellules dérivées du foie.

La caractérisation détaillée des populations isolées a montré que les ganglions lymphatiques mésentériques contenaient des proportions significativement plus élevées de lymphocytes T CD3+ et de lymphocytes T CD4+, ainsi qu’un nombre élevé de lymphocytes T CD8+. À l’inverse, le foie était significativement enrichi en CD14+ leucocytes. Les deux organes ont montré des abondances similaires de lymphocytes CD20+B.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 à 40 minutes. Les animaux sont généralement rétablis de l’anesthésie, actifs et mangent en quelques heures, et les incisions sont si petites qu’il peut être difficile de voir du côté de la cage. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de maintenir les animaux dans un état corporel qui facilitera le succès.

Une graisse de mésentère importante peut être un obstacle difficile car elle masque les nœuds et augmente la friture et le saignement. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la phlébotomie, la biopsie des ganglions lymphatiques périphériques, l’endoscopie digestive supérieure et inférieure et la biopsie rectale peuvent être effectuées afin d’évaluer les réponses immunitaires systémiques et muqueuses, l’état des microbes et des barrières épithéliales, ainsi que les charges virales. Après sa mise au point, cette technique a permis aux chercheurs de notre laboratoire d’explorer longitudinalement les populations microbiennes en inflammation dans des tissus de macaques qui n’étaient auparavant disponibles que par nécropsie.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement du VIH, car la translocation microbienne est une cause majeure de l’inflammation qui entraîne la pathogenèse du VIH. L’évaluation en série peut fournir des cibles potentielles et permettre d’évaluer des interventions thérapeutiques. N’oubliez pas que travailler avec des macaques infectés par un virus peut être extrêmement dangereux.

Des précautions telles qu’une formation appropriée pour les risques biologiques, y compris l’herpèsvirus 1 chez le macaquesin, un équipement de protection individuelle approprié, des trousses de morsure et de griffure et un suivi médical approprié doivent être disponibles.