Évaluation primaire Blast effets In Vitro

L’objectif global de cette méthode est de générer des ondes de choc représentatives qui peuvent se produire lors d’événements d’explosion et d’évaluer l’impact de ce choc mécanique sur la viabilité des cellules primaires en culture. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés relatives à la réponse des types de cellules individuelles à des événements de haute énergie tels que l’exposition à une onde de choc. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle nous permet d’évaluer des réponses cellulaires distinctes à une seule onde de choc, par opposition aux réponses au niveau des tissus ou des organes.

Les implications de cette technique s’étendent à l’identification des mécanismes cellulaires modifiés à la suite de lésions primaires dues à l’explosion, qui sont causées par l’exposition à une onde de choc. Bien que cette méthode soit démontrée avec un type de cellule d’intérêt spécifique, toutes les cellules peuvent être cultivées et placées dans la configuration de test pour évaluer les réponses spécifiques des cellules à une onde de choc. Pour commencer, cultivez la lignée cellulaire d’intérêt en culture standard jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de confluence.

Ensuite, aspirez le fluide. Lavez les cellules deux fois avec du PBS et ajoutez deux millilitres de trypsine-EDTA. Incuber-les dans des conditions de culture standard pendant cinq minutes.

Vérifiez brièvement que les cellules se sont bien dissociées du ballon. Ensuite, ajoutez quatre millilitres de milieu de culture contenant du FBS dans le ballon afin de neutraliser la trypsine et de transférer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à 200 fois g pendant quatre minutes pour granuler les cellules.

Ensuite, aspirez lentement le surnageant en prenant soin de ne pas déloger la pastille. Et remettez le granulé en suspension dans cinq millilitres de fluide. Placez trois plats étiquetés de 35 millilitres à l’intérieur d’un plat de 90 millilitres.

Ensuite, ajoutez deux millilitres de milieu à chaque plat et épépinez-les chacun avec 70 mille cellules. Incuber les cellules pendant la nuit pour permettre une fixation adéquate des cellules avant de les exposer à l’onde de choc. Avant de commencer l’assemblage du tube d’amortisseur, enfilez l’équipement de protection individuelle approprié, y compris des bottes de travail à embout d’acier et une blouse de laboratoire.

Commencez par insérer deux barres d’alignement à travers les trous de boulons situés dans le plan horizontal de la bride de sortie. Ensuite, placez une feuille d’étanchéité en caoutchouc nitrile sur l’extrémité des barres d’alignement afin qu’elle se trouve entre la bride de sortie et la plate-forme de culture d’organes ex vivo. Fixez le gréement EVOC à la bride de sortie du tube d’amortisseur en faisant glisser le dispositif sur les barres d’alignement.

Assurez-vous qu’il est correctement orienté de sorte que la section qui maintient la boîte de Pétri soit située à sa base. Ensuite, insérez quatre boulons et rondelles M24 dans les trous restants et fixez fermement les écrous et les boulons séquentiellement de manière symétrique en diagonale, tout en vérifiant visuellement que la plate-forme EVOC et le tube d’amortisseur ont été alignés avec succès. Ensuite, fixez un transducteur de pression à la plate-forme EVOC et connectez-le à la source de courant à l’aide d’un câble de capteur.

De plus, utilisez un câble BNC pour connecter la source de courant à l’oscilloscope. Assurez-vous que toutes les soupapes de décharge et les commandes de débit sur le tube d’amortisseur sont fermées. Ensuite, ouvrez l’air comprimé externe intégré et tournez manuellement le régulateur de pression dans le sens des aiguilles d’une montre pour charger le solénoïde à 2,5 bars.

Ouvrez la bouteille d’air comprimé, puis tournez lentement le régulateur de pression dans le sens des aiguilles d’une montre pour augmenter la pression à environ 15 bars. Ensuite, préparez les diaphragmes en coupant une feuille de plastique de 0,125 millilitre d’épaisseur en carrés de 10 centimètres sur 10 centimètres. Créez des poignées en ruban adhésif et fixez-les en haut et en bas du diaphragme.

Utilisez-les pour positionner soigneusement le diaphragme à côté de la petite bride avant près de la chambre de culasse. Assurez-vous que le diaphragme est droit et correctement positionné avant de fermer la culasse. Ensuite, fixez-le en place à l’aide de quatre boulons et écrous M24.

À l’intérieur de la hotte stérile, préparez des membranes adhésives perméables aux gaz de sorte que chacune soit assez grande pour couvrir le haut d’une boîte de Pétri de 35 millilitres. Ensuite, transférez une boîte de Pétri de 90 millilitres contenant trois échantillons expérimentaux dans la hotte. Aspirez le milieu de l’un des plats et couvrez-le de deux sections de membrane, en veillant à ce qu’il y ait un joint étanche entre la membrane et le bord du plat.

Transférez l’échantillon sur le dispositif EVOC et fixez-le à la base du luminaire de sorte que le haut de la parabole soit aligné avec la base intérieure du tube de choc. À ce stade, mettez des protège-oreilles, des lunettes de protection, des bottes de sécurité et une blouse de laboratoire. Mettez sous pression le système de tube d’amortisseur en tournant le bouton de contrôle de débit du régulateur dans le sens des aiguilles d’une montre.

En bas du panneau de commande, sélectionnez soit l’entrée double culasse pour une onde de choc de courte durée, soit l’entrée du tube pilote pour une durée d’onde plus longue. Ensuite, allumez la source d’alimentation CC et l’oscilloscope pour exiger les données de forme d’onde. Ensuite, allumez les lumières de sécurité à l’aide de l’interrupteur situé sur le mur en face du panneau de commande afin d’avertir les autres chercheurs de ne pas entrer dans la pièce lorsque le tube de choc est en charge.

Sur le boîtier de commande du solénoïde, appuyez sur l’interrupteur pour fermer le solénoïde. Ensuite, sur le panneau de commande, ouvrez lentement le contrôle de débit en tournant le bouton dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour augmenter progressivement la pression à l’intérieur de la chambre de compression. Lorsque la pression d’éclatement du diaphragme est atteinte, le diaphragme se rompt et une détonation se fait entendre.

Une fois que ce bruit se fait entendre, fermez rapidement le bouton de contrôle de débit. Ensuite, ouvrez le solénoïde en éteignant l’interrupteur sur le boîtier de commande du solénoïde et éteignez le voyant de sécurité. Transférez l’échantillon de cellule dans le capot stérile.

Là, retirez la membrane adhésive perméable aux gaz et remplissez le plat de deux millilitres de milieu de croissance frais. Ajoutez 200 microlitres de réactif indicateur redox dans chaque plat expérimental directement après les avoir remplis de deux millilitres de milieu de croissance frais. Ensuite, transférez le plat dans un incubateur standard pendant quatre heures.

Après l’incubation, transférez deux aliquotes de 100 microlitres de chaque plat dans une plaque appropriée à 96 puits. Lisez la plaque sur un lecteur de plaques à fluorescence, puis exportez et enregistrez les données. Pour l’imagerie fluorescente de cellules vivantes et mortes, les cellules doivent être initialement plaquées sur une plaque de verre à l’intérieur des plaques de culture de 35 millilitres.

Après le traitement par ondes de choc, aspirez le milieu et lavez les cellules deux fois dans un millilitre de PBS. Ensuite, transférez 100 microlitres du réactif mort vivant du kit d’imagerie à chaque échantillon. Et incubez les cellules et le réactif à température ambiante, protégez-le de la lumière pendant 15 minutes.

Après l’incubation, retirez le réactif et lavez les cellules une fois avec un millilitre de PBS. À l’aide d’une pince à pointe fine, retirez délicatement la lamelle du récipient de 35 millilitres et placez-la face vers le bas sur une lame de microscopie en verre. Acquérez des images pour chaque échantillon à l’aide d’un microscope fluorescent équipé d’un objectif 5X ayant une ouverture numérique de 0,25.

Ensuite, utilisez un logiciel d’analyse d’images pour compter manuellement ou automatiquement le nombre de cellules vertes vivantes et de cellules mortes rouges sur chaque image. En utilisant la méthode décrite ici, des cellules cultivées dans une monocouche ont été exposées à des ondes de choc générées par un tube de choc. Des capteurs dans le tube de choc affichent les profils de pression observés à différents endroits le long du tube.

À l’aide d’un test d’indication redox, il a été constaté que l’application d’une onde de choc de 127 kilopascals était capable de réduire considérablement la viabilité des cellules de la papille dermique par rapport aux témoins après 24 heures de culture. L’application de 72 kilopascals ou moins d’une onde de choc n’a pas réduit la viabilité. Pour étayer ces observations, un test sur les cellules mortes vivantes a également démontré une réduction de la viabilité cellulaire chez les personnes exposées à l’onde de choc de 127 kilopascals par rapport au témoin.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée plus ou moins rapidement à une cadence de 60 échantillons par heure. Le tube de choc peut être utilisé pour générer des ondes de choc afin d’explorer une gamme de blessures primaires dues à l’explosion. Ceux-ci peuvent aller de l’explosif pulmonaire à l’ossification hétérotopique, qui est la formation inappropriée d’os dans les tissus mous du corps.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler les risques encourus lors du travail avec des gaz comprimés et des ondes de choc à haute énergie, et de toujours suivre les directives de sécurité correctes. Des modifications mineures dans un tube de choc peuvent nous permettre de modifier l’onde de choc. Nous pouvons ensuite évaluer la réponse cellulaire à différents profils de pression et intensités, qui représentent différents scénarios d’explosion.

À la suite de cette procédure, un séquençage de nouvelle génération peut être effectué pour répondre à des questions de recherche supplémentaires, telles que : Comment l’exposition à une onde de choc modifie-t-elle notre inscription naturelle dans les cellules ?