L'analyse des rétinoïque induite par l'acide Neuro-Différenciation de cellules souches embryonnaires de souris en deux et trois dimensions corps embryoïdes

L’objectif global de cette procédure est d’analyser l’expression et la production de gènes et de marqueurs protéiques, respectivement, de la différenciation neurale des cellules souches embryonnaires de souris. Cette méthode peut aider à déterminer le mécanisme responsable de l’inhibition de la différenciation neurale par l’âge brut des DPA, et conduire à de meilleurs protocoles pour différencier les cellules souches en neurones à des fins thérapeutiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle facilite le suivi du processus de différenciation neuronale au niveau de l’émérine et de la protéine, y compris par microscopie optique.

La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Junning Yang, un associé de recherche dans mon laboratoire. Commencez la formation du corps embryoïde en récoltant des cellules souches embryonnaires avec 0,25 % de trypsine-EDTA pendant deux à cinq minutes à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Ajoutez du milieu Dulbecco’s modifié d’Iscove, ou IMDM, avec 15 % de FBS dans les cellules qui se détachent, et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres.

Centrifuger à 160 x G pendant cinq minutes à température ambiante. Comptez ensuite les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et préparez une suspension de cinq x 10 à cinq cellules par millilitre dans de l’IMDM avec 0,5 micromolaire d’acide rétinoïque. Ensuite, utilisez une pipette à huit canaux et des pointes de 200 microlitres pour plaquer des gouttes de 120 microlitres par boîte de Pétri de 100 millimètres.

Retournez le plat et remplissez le couvercle inversé de PBS pour éviter que les gouttes suspendues ne sèchent. Culture à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant trois à quatre jours. Utilisez des pointes de pipette de 200 microlitres pour récolter les corps embryoïdes suspendus cultivés pendant trois jours.

Touchez un corps embryoïde avec une pointe de pipette et transférez-le sur une lamelle recouverte de fibredectine dans une plaque à 24 puits. Changez de milieu sur les cultures tous les deux à trois jours. Lors du changement de milieu, prélever le milieu utilisé pour l’analyse de la sécrétion de protéines si nécessaire.

Pour détecter les protéines sécrétées dans le milieu, transférez 500 microlitres de milieu de corps embryoïde dans des filtres centrifuges de coupure de 10 kilodaltons, et tournez à 20 000 x G à quatre degrés Celsius. Examinez le fluide restant à l’intérieur des filtres centrifuges toutes les 15 à 20 minutes pour éviter un enrichissement excessif. Arrêtez la centrifugation lorsque le volume du fluide restant est tombé à 25 microlitres.

Retournez le filtre et faites-le tourner à 160 x G à quatre degrés Celsius, puis récupérez le reste du milieu concentré en suivant les instructions du fabricant. Pour une culture 3D, récoltez les corps embryoïdes cultivés pendant quatre jours sous forme de gouttes suspendues avec des pointes de pipette de 200 microlitres, comme auparavant. Transférez 30 corps embryoïdes dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre, puis préparez une solution de gel de collagène en diluant les volumes appropriés de solution de collagène et de DMEM 5X, en ajoutant la solution de neutralisation et en mélangeant immédiatement bien.

Placez le gel de collagène sur de la glace. Ensuite, pipetez un volume approprié de solution de collagène réfrigérée dans le tube contenant les corps embryoïdes, puis pipetez doucement la suspension de corps embryoïde dans les puits d’une plaque à six puits sans créer de bulles. Transférez immédiatement la plaque à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant 60 minutes pour initier la polymérisation du collagène.

Après les 60 minutes, superposez la plaque contenant les corps embryoïdes avec de l’IMDM. Pour la dissociation du corps embryoïde, collectez à nouveau les corps embryoïdes suspendus de quatre jours avec des pointes de pipette de 200 microlitres. Cette fois, transférez-les dans une boîte de Pétri bactériologique non adhésive contenant de l’IMDM avec 15 % de FBS et une culture à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone, pendant quatre jours supplémentaires.

Vérifiez les corps embryoïdes deux fois par jour pour vous assurer qu’ils ne se fixent pas au fond. Secouez doucement le plat pour éviter l’attachement du corps embryoïde. Après quatre jours, transférez les corps embryoïdes dans un tube à centrifuger et centrifugez à 185 x G pendant cinq minutes à température ambiante.

Après la centrifugation, retirez le surnageant. Le volume de la palette ne doit pas dépasser 100 microlitres. Ensuite, pipetez un millilitre de collagénase de type I à 0,25 %, complété par 20 % de FBS dans du PBS dans le tube des corps embryoïdes.

Incuber le mélange pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Pipetez doucement la suspension à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre toutes les 20 minutes. Après l’incubation, lavez doucement les cellules trois fois avec du PBS.

Si des agrégats cellulaires sont présents, utilisez une passoire cellulaire avec un maillage de 100 microns pour les éliminer. Plaquez les cellules sur des lamelles recouvertes de gélatine dans de l’IMDM, puis incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Lavez les corps embryoïdes 2D ou 3D dissociés avec du PBS.

Fixez ensuite avec quatre pour cent de paraformaldéhyde et de PBS pendant 30 minutes à température ambiante. Après avoir lavé les cellules fixes trois fois avec du PBS pour éliminer les débris cellulaires flottants, ajoutez 1 % de triton X-100 dans du PBS pour perméabiliser les cellules pendant 20 minutes à température ambiante. Après le lavage comme précédemment, retirez le dernier lavage et bloquez avec 5 % BSA dans PBS pendant 30 minutes.

Vers la fin de l’incubation, préparer une dillution primaire d’anticorps dans 1 % de BSA dans du PBS complété par 0,03 % de triton X-100. Lorsque les 30 minutes se sont écoulées, remplacez la solution bloquante par la solution d’anticorps primaires. Incuber pendant trois heures à température ambiante, ou toute la nuit, à quatre degrés Celsius.

Après le lavage, appliquez un anticorps secondaire dans du PBS et incubez pendant une heure à température ambiante. Enfin, montez les lamelles sur des lames de verre avec un milieu anti-décoloration pour la microscopie optique. Cette image montre l’émergence d’une pousse à partir d’un corps embryoïde généré à partir de CSE, positif pour deux copies du gène Syx, qui code pour un facteur d’échange de guanine qui active la GTPase RhoA.

L’image a été prise après six jours de culture 3D. Ce corps embryoïde formé à partir d’ESC Syx KnockOut présente une augmentation de la germination après le même temps en culture. Ici, des images de phase des bords du corps embryoïde en 2D montrent que les cellules se sont développées plus rapidement à partir de Syx KnockOuts qu’à partir de Syx de type sauvage.

Ces images d’immunofluorescence illustrent que le marqueur de différenciation neurale, Nestin, représenté en rouge, était plus abondant dans les cellules en expansion à partir de corps embryoïdes 2D6 KnockOut de six jours que de leurs homologues de type sauvage Syx. Ici, les images d’immunofluorescence montrent que les marqueurs de différenciation neurale Nestin et bêta III Tubuline étaient plus abondants dans les cellules dissociées des corps embryoïdes 3D6 KnockOut de 13 jours que dans leurs homologues de type sauvage Syx. Il s’agit d’une procédure qui prend du temps en raison de la durée de la croissance et de la différenciation du corps embryoïde.

Cela nécessite non seulement au moins huit jours, mais dans certains cas, nous suivons la différenciation jusqu’à 24 jours. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de limiter la viabilité du diamètre du corps embryoïde pour assurer des taux de différenciation similaires le long des corps embryoïdes.