Name: LERLIC-MS / MS pour la caractérisation en profondeur et Quantification de Glutamine et asparagine désamidation dans Shotgun Proteomics (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Découvrez la méthode LERLIC-MS/MS pour caractériser et quantifier les isoformes de désamidation de la glutamine et de l'asparagine en protéomique shotgun. Cette technique améliore la séparation des isomères sur colonne capillaire.

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Ce travail a été en partie financé par des subventions du ministère singapourien de l&#39;éducation (Niveau 2: Grant ARC9 / 15), Conseil national de recherches médicales de Singapour (NMRC-DE-IRG-0003-2016) et NTU-LPN vieillissement Subvention de recherche ( Grant ARG / 14017). Nous tenons à exprimer notre gratitude et ses remerciements les plus sincères au Dr Andrew Alpert et de l&#39;équipe PolyLC pour nous a gentiment fourni les matériaux d&#39;emballage qui ont rendu possible cette étude.

1. Emballage Fanion-échange de grande longueur (LAX) Colonne Capillaire (Note: Bien que la colonne LAX peut être emballé à domicile que nous décrivons dans ce protocole, les colonnes LAX sont disponibles dans le commerce, voir également le tableau des matériaux et des réactifs pour plus de détails). <ol><li> Suspension de 50 mg de matériau de garnissage échangeur d&#39;anions faible dans 3,5 ml de tampon d&#39; emballage (tableau 1) pour préparer la suspension. </li><li> Assembler l&#39;extrémité de la colonne capillaire (longueur 50 cm - tube 200 um de diamètre intérieur (ID)) en utilisant un raccord femelle-femelle, une virole et un écrou femelle. Placez un écran 1/16&quot; OD de 1 micron taille des pores à l&#39;intérieur du raccord femelle-femelle (Note:. L&#39;écran utilisé ici doit avoir plus petite taille des pores de la taille des particules du matériau d&#39;emballage pour empêcher la fuite de la matière de la colonne). </li><li> Emballer le capillaire avec la suspension à l&#39;aide d&#39;une pompe à pression fonctionnant à 4500 psi. (Remarque: Emballez le column jusqu&#39;à ce que le matériau d&#39;emballage est visible à l&#39;entrée de la colonne). </li><li> Assembler l&#39;autre extrémité de la colonne capillaire, comme décrit au point 1.2. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;échantillon Ce protocole décrit l&#39;application de LERLIC-MS / MS pour analyser les tissus du cerveau humain comme modèle protéome. (Nota: Dans le cas d&#39;utilisation d&#39;autres tissus ou des échantillons protéomiques, il convient d&#39;adapter les procédures de préparation d&#39;échantillon). <ol><li> homogénéisation des tissus: une. Laver les tissus cérébraux (50 à 100 mg) avec une solution de tampon phosphate 1x pendant cinq minutes trois fois. b. Homogénéiser le tissu à 1: 1: 2,5 perles tissu / métal / tampon d&#39;homogénéisation DDC (tableau 2) de rapport (p / p / v) pendant 5 min à 4 ° C dans des tubes en toute sécurité à verrouillage à une intensité maximale à l&#39; aide d&#39; un homogénéisateur de tissus. (Remarque: le tampon d&#39;homogénéisation de la DDC peut inclure des inhibiteurs de protéase comme indiqué précédemment dans 3) c. Centrifuger l&#39;homogénat de tissu obtenu from de l&#39;étape précédente, à 10.000 x g, 4 ° C pendant 10 minutes et recueillir le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. ré. Répétez les étapes bc pour les pastilles restantes et combiner les surnageants autant de fois que nécessaire jusqu&#39;à ce qu&#39;aucune pastille est observée. (Remarque: Si vous devez répéter les étapes bc plus de deux fois, déplacer l&#39;échantillon et les perles à un nouveau tube de verrouillage en toute sécurité pour éviter la perte d&#39;échantillon lors de l&#39;étape de centrifugation). e. Quantifier la concentration en protéines des homogénats obtenus par dosage acide bicinchoninique (BCA) 12. </li><li> Désoxycholate de sodium (DDC) en solution Assistée par digestion tryptique 13 de homogénats du cerveau. une. Ajouter une concentration finale de ( en utilisant la solution de réserve indiquée dans la solution 5 du tableau 3) à l&#39;homogénat obtenu 10 mM de dithiothréitol (DTT) pour initier la réduction des liaisons disulfure de la protéine. b. Incuber l&#39;homogénat pendant 30 min dans un bainpré-réglée à 60 ° C. c. Ajouter à l&#39;homogénat à une concentration finale de 20 mM d&#39; iodoacétamide (IAA) en utilisant la solution mère indiqué dans Solution 7 du tableau 4. ré. Incuber le broyat contenant IAA à la température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 45 min. e. Diluer l&#39;homogénat de cerveau de deux plis à l&#39; aide du tampon de dilution (solution à 6 du tableau 3). F. Incuber l&#39;échantillon pendant une seconde étape de réduction pendant 30 minutes à 37 ° C. g. Ajouter rapport trypsine de qualité séquençage modifié dissous dans la solution 2 du tableau 2 à la protéine-enzyme à 01:50 (p / p). h. Digérer l&#39;homogénat avec de la trypsine par incubation pendant une nuit à 30 ° C. je. Stopper la digestion enzymatique, le lendemain, en ajoutant 0,5% concentration finale d&#39;acide formique (FA). (Note: L&#39;ajout de FA provoque la précipitation des sels de la DDC dans des conditions acides.) j. Vortexer doucement les échantillons contenant de la DDC precipiTates. k. Pellet vers le bas les sels DDC par centrifugation des échantillons à 12 000 x g, 4 ° C pendant 10 min. l. Récupérer le surnageant et transférer le liquide dans un nouveau tube propre. (Remarque: Prenez soin pendant la pipetage de cette étape pour ne pas remettre en suspension et / ou recueillir des sels de la pastille DDC). m. Re-dissoudre le culot dans un tampon DDC de re-dissolution de la DDC (tableau 5) sous vigoureuse agitation par tourbillonnement pendant 1 min. n. Répétez les étapes Jl deux fois pour récupérer des peptides précipités et combinent les surnageants. (Note:. Voir Serra et al 2016 13 pour plus de détails sur la DDC assistée en solution protocole de digestion tryptique adapté ici.) </li><li> Dessalage des échantillons digéré tryptique. une. Effectuer le dessalage des échantillons digérés à l&#39;aide d&#39;une cartouche de 1 g C-18. (Note: l&#39;utilisation d&#39;une grande cartouche de volume (5 ml), indépendamment de la quantité de garanties obtenue de protéine de nettoyage appropriée des sels restants de la DDC dans les échantillons avantà injection LC-MS / MS). b. Effectuer le conditionnement de la cartouche 1 g C-18 avec 5 ml d&#39;acétonitrile (ACN). c. Passer 5 ml de tampon de nettoyage (tableau 6) de la cartouche conditionné 1g C-18 pour éliminer tout solvant organique restant. ré. Charger l&#39;échantillon à la cartouche 1 g C-18. e. Effectuer 3 - 5 étapes de nettoyage à l&#39;échantillon dans la colonne 1 g C-18 en utilisant 5 ml de tampon de nettoyage chaque étape. F. Éluer les peptides dessalée à partir de la cartouche de 1 g C-18 en utilisant 5 ml de tampon d&#39;élution (tableau 7). g. Sécher les peptides élues dans un concentrateur sous vide. c. Reconstituer l&#39;échantillon séché dans un volume final de 200 ul de tampon d&#39;élution. (Note:. Utilisation vigoureuse et longue (&gt; 10 min) suivie par sonication tourbillonnement subséquente dans un bain de sonication pendant 30 min à complètement remettre en suspension les peptides séchés dans un tampon d&#39;injection) ré. Réglez le volume d&#39;injection de l&#39;échantillon pour LERLIC-MS / MS pour analyser entre 1 à 3 ug de protéine. </li></ol> 3. Une dimension LERLIC-MS / MS séparation <ol><li> conditions de chromatographie liquide: Phases mobiles: A: 0,1% de FA dans l&#39; eau (tableau 8). B: 0,1% dans ACN FA (tableau 9) Débit: 0,4 pi / min Colonne: LAX colonne capillaire (longueur 50 cm - 200 um ID) une. Utiliser les éléments suivants 1200 min-gradient: 95% de B pendant 40 min, 95-85% de B pendant 434 min, 85-70% de B pendant 522 min, 70-35% de B pendant 124 min, 35-3% de B pendant 45 min , isocratique à 3% de B pendant 5 min, 3 - 95% de B pendant 7 min et maintenu isocratique à 95% de B pendant 23 min. b. Effectuer la séparation des peptides à l&#39; aide du capillaire LAX comme indiqué dans Serra &amp; Gallart-Palau et al. 3 en utilisant une Chromatographie liquide à très haute pression. </li><li> Configuration du spectromètre de masse: une. Configurer les détails de l&#39;événement d&#39;analyse pour effectuer l&#39;acquisition de données betwe alternatifen pleine transformée de Fourier-spectrométrie de masse (FT-MS) et la spectrométrie de masse à transformée de Fourier-tandem (FT-MS / MS) avec les paramètres suivants: a.1. mode d&#39;acquisition des données: positif a.2 paramètres FT-MS: Gamme de masse: 350 - 2000 m / z Résolution: 60 000 Microscans: 1 par spectre Commande automatique de gain: 1 × 10 6 a.3 paramètres FT-MS / MS: Mode Fragmentation: haute énergie dissociation collisionnelle (HCD) a.4 plage de masse: 150 - 2000 m / z a.5 Résolution: 30 000 a.6 ions Top N: 10 Microscans: 1 par spectre état de charge:&gt; 2+ largeur d&#39;isolement: 2 Da A.7 commande de gain automatique: 1 × 10 6 b. Effectuer une détection par spectrométrie de masse des peptides , comme indiqué en 3 , en utilisant un spectromètre de masse Orbitrap équipé d&#39;une source d&#39;ions nanoélectrospray travaillant à 1,5 kV. </li></ol> 4. Analyse des données <ol><li> effectuer proteà la recherche de base de données à l&#39;LERLIC-MS / MS obtenu des données en utilisant les paramètres suivants à l&#39; aide d&#39; un logiciel spécifique protéomiques: (Note: Voir 3 pour plus de détails.) une. tolérance Ion: 10 ppm b. Fragment tolérance d&#39;ions: 0,05 Da c. Taux de faux positifs (FDR): 1% ré. Base de données: base de données UniProt humaine e. modifications fixes: Carbamydomethylation à Cys F. modifications variables (le cas échéant par le logiciel): Oxydation (Met), désamidation (Asn et Gln). </li><li> Caractérisation Confiant et la quantification des produits déamidées dans les données isomériques LERLIC-MS / MS: une. base de données Export résultats de la recherche de LERLIC-MS / MS à un logiciel spreedsheet pour analyse. b. Trouver et extraire la liste complète des peptides déamidés et leurs homologues non désamidée. c. Utilisation de la liste des peptides obtenus comme référence, extraire les chromatogrammes d&#39;ions (Xics) de ces peptides à l&#39;aide d&#39;un logiciel correspond le à 5 ppm de la tolérance de masse. (Remarque:Voir 3 pour plus de détails sur le logiciel utilisé pour l&#39;extraction de Xics.) ré. Inspecter visuellement les Xics obtenus pour identifier l&#39;élution à double pic séparé des produits isomériques comme indiqué 3. (Note: les produits de ces peptides isomères identifiés au niveau MS / MS peut être facilement trouvé guidée par la présence de deux temps de rétention différents dans le résultat de la recherche de base de données.) e. quantification relative des produits isomères de chaque site / peptide désamidée doit être effectuée sur la base de l&#39;aire du pic de chaque isomère identifiés dans les Xics obtenus. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Dans cette vidéo-article , nous présentons un protocole étape par étape de LERLIC-MS / MS 3, un procédé pour effectuer une caractérisation en profondeur et de déterminer avec précision l&#39;étendue de la désamidation de la protéine et des procédés enzymatiques impliquées sur cette modification de la protéine. LERLIC-MS / MS est basée sur l&#39;utilisation d&#39;une longue longueur (50 cm) LAX selon le principe de chromatographie d&#39;interaction de répulsion électrostatique hydrophile (Erlic) <...

Désamidation est une modification post - traductionnelle des protéines (PTM) qui introduit une charge négative sur le squelette de la protéine par modification de l&#39; asparagine (Asn) et / ou de la glutamine (Gln) les résidus 1. Cette modification tout en affectant des résidus Asn génère les produits isomères d&#39; acide isoaspartique (isoAsp) et l&#39; acide aspartique (Asp) à un 3 commun: rapport 1 2. Néanmoins, ce rapport peut être modifié par l&#39;intervention de l&#39;enzyme de réparation L-isoaspartyl méthyltransférase (PIMT) 3, 4. De même, la désamidation de résidus Gln génère l&#39;acide gamma-glutamique isomérique (γ-Glu) et des isoformes de l&#39; acide alpha-glutamique (α-Glu) à une escompté 1: 7 Ratio 3, 5, mais ce rapport peut être déplacé par l&#39;action de l&#39;enzyme ubiquitaire transglutaminase 2 et d&#39;autres transglutaminases, y compris transglutaminase 1, enzyme récemment identifié comme étant associées à des vésicules extracellulaire dans le cerveau 6. L&#39;origine de la désamidation peut être soit spontanée ou enzymatique, le premier est particulièrement fréquent sur les résidus Gln dans lequel transglutaminases et d&#39; autres enzymes médient reticulation inter / intra-moléculaire par transamidation (voir 3 pour plus de détails sur Gln transamidation et ses implications dans plusieurs chroniques et maladies humaines fatale). Par conséquent, la désamidation est un PTM qui a une répercussion décisive sur la structure et la fonction des molécules concernées 4, 7, 8 et nécessite une caractérisation chimique en profondeur 3 à la lumière de ses conséquences biochimiques différentes , y compris son service comme horloge moléculaire du vieillissement 9 . Bien que désamidation des résidus Asn a été<html> relativement bien caractérisé par la protéomique fusil de chasse de bas en haut 1, 10, désamidation de résidus Gln n&#39;a toujours pas une méthode de caractérisation approprié au - delà de l&#39;analyse difficile de composés modèles par fragmentation radical électron-11. Nous avons récemment mis au point une nouvelle stratégie de protéomique de fusil de chasse d&#39; une dimension (LERLIC-MS / MS) 3 qui permet la séparation des isoformes et Gln Asn désamidation à partir d&#39; échantillons biologiques complexes et composés modèles en une seule analyse. LERLIC-MS / MS sont basées sur la séparation des peptides digérés à la trypsine en utilisant une grande longueur (50 cm) sur une colonne échangeuse d&#39;ions (LAX) fonctionnant en mode de chromatographie d&#39;interaction de répulsion hydrophile électrostatique (Erlic) et couplée à spectrométrie de masse tandem (LC- MS / MS). Cette nouvelle stratégie d&#39;analyse a été utilisée pour caractériser et relativement quantifier l&#39;étendue de chaque résidu désamidée dans les tissus du cerveau humainf &quot;&gt; 3. Néanmoins, le protocole décrit ici fournira l&#39; imagerie vidéo de LERLIC-MS / MS visant à étudier les particularités de désamidation des protéines dans le contexte biochimique d&#39;intérêt. DÉCLARATION ÉTHIQUE Toutes les procédures de ce protocole ont été approuvés par le comité d&#39;examen institutionnel de l&#39;Université technologique de Nanyang à Singapour et ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles.

<table><tbody><tr><td>PolyCAT 3 et micro ; m 100-& Aring ; (matériau en vrac)</td><td>PolyLC Inc.</td><td>Commande</td><td></td>spéciale</tr><tr><td>Colonne capillaire échangeuse d’ions longue longueur 50 cm - 200 & micro ; m ID</td><td>PolyLC Inc.</td><td>Commande</td><td></td>spéciale</tr><tr><td>Tube PEEKsil 1/16" OD x 200 & micro ; m ID x 50 cm de longueur</td><td>SGE Analytical Science sous Trajan Scientific Australia&nbsp ;</td><td>620050</td><td></td></tr><tr><td>Raccord femelle à femelle pour tube 1/16" OD</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHF-125</td><td></td></tr><tr><td>Écrou femelle pour microférule</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHP-416</td><td></td></tr><tr><td>Microférule</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHF-132</td><td></td></tr><tr><td>Bombe à pression NanoBaume</td><td>Western Fluids Engineering</td><td>SP-400</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu Prominence UFLC système</td><td>Shimadzu</td><td>Prominence UFLC</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à verrouillage sûr</td><td>Eppendorf&nbsp ;</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Perles en acier inoxydable. 0,9 &ndash ; 2,0 mm. 1 lb Non stérile.</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table&nbsp ;</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>Rotina 380 R</td><td></td></tr><tr><td>Bain de circulation numérique chauffé standard, 120VAC</td><td>PolyScience 8006 6L</td><td>8006A11B</td><td></td></tr><tr><td>Sep-pack c18 cartouche de dessalage 50 mg</td><td>Waters</td><td>WAT020805</td><td></td></tr><tr><td>Vacumm concentrateur</td><td>Eppendorf&nbsp ;</td>Système <td></td><td>Concentrateur Plus</td></tr><tr><td>Dionex UltiMate 3000 UHPLC&nbsp ;</td><td>Dionex</td><td>UltiMate 3000 UHPLC&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de masse Orbitrap Elite</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>ORBITRAP ELITE</td><td></td></tr><tr><td>Michrom Thermo CaptiveSpray&nbsp ;</td><td>Michrom-Bruker Inc.</td><td>Incubateur TCSI-SS2</td><td></td></tr><tr><td>INCUCELL&nbsp ;</td><td>MMM Groupe</td><td>INCUCELL111</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine modifiée de qualité séquençage</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Comprimés cocktail inhibiteurs de protéase</td><td>Roche</td><td>11836170001 (ROCHE)</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon de phosphate 10x (diluée à 1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>i6125</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507 (HONEYWELL)</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818 (HONEYWELL)</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile de qualité HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675415</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol Grade HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675431</td><td></td></tr><tr><td>Eau Grade HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14263</td><td></td></tr></tbody></table>

lerlic-ms / ms pour la caractérisation en profondeur et quantification de glutamine et asparagine désamidation dans shotgun proteomics

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

Caractérisation des désamidation des protéines est impératif de déchiffrer le rôle (s) et les potentialités de cette modification post-traductionnelle de protéines (PTM) en pathologie humaine et d&#39;autres contextes biochimiques. Afin d&#39;effectuer la caractérisation des protéines désamidation, nous avons récemment développé une nouvelle spectrométrie de masse de grande longueur d&#39;interaction répulsion hydrophile électrostatique chromatographie en tandem méthode (LERLIC-MS / MS) qui peut séparer la glutamine (Gln) et isoforme asparagine (Asn) produits de désamidation de composés modèles à des échantillons biologiques complexes. LERLIC-MS / MS est, par conséquent, la première stratégie protéomiques de fusil de chasse pour la séparation et la quantification des isoformes de Gln désamidation. Nous démontrons aussi, comme une nouveauté, que le protocole de traitement de l&#39;échantillon décrit ici stabilise l&#39;intermédiaire permettant sa caractérisation succinimide par LERLIC-MS / MS. Application de LERLIC-MS / MS comme indiqué dans cet article vidéo peut aider à élucider le moment Unknown matrices moléculaires de désamidation des protéines. De plus, LERLIC-MS / MS fournit une meilleure compréhension des réactions enzymatiques qui englobent désamidation dans les milieux biologiques distincts.

La désamidation de résidus Gln et Asn est considérée comme une modification de la protéine dégénérative (DPM) impliqués dans plusieurs maladies chroniques et mortelles 14. Il a été démontré que cette PTM peut prédire les états demi-vie et d&#39;anticorps et de dégradation d&#39; autres molécules dans le corps humain et milieux biologiques similaires 1, 15. L&#39;importance de désamidation des protéines, en...

Ici, nous présentons un protocole étape par étape de la spectrométrie de masse de grande longueur d&#39;interaction de répulsion électrostatique chromatographie hydrophile-tandem procédé (LERLIC-MS / MS). Ceci est une nouvelle méthodologie qui permet pour la première quantification et la caractérisation des temps glutamine et l&#39;asparagine isoformes désamidation par protéomiques de fusil de chasse.

LERLIC-MS / MS pour la caractérisation en profondeur et Quantification de Glutamine et asparagine désamidation dans Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser la protéomique en shotgun pour caractériser et quantifier les produits de déamination endogènes de la glutamine et de l'asparagine dans des protéomes complexes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biochimie, comme l'influence des processeurs spontanés et antimatiques sur le produit isométrique gluteo de la déamination de la glutamine et de l'asparagine. Le principal avantage de cette technique réside dans la séparation des isomères de déamination de la glutamine sur une colonne capillaire ionique de grande longueur, maximisant ainsi la capacité à séparer les peptides selon leurs points isoélectriques.Pour commencer la construction de la colonne, suspendez 50 milligrammes de matériau d'empaquetage échangeur d'anions faible dans 3,5 millilitres d'isopropanol à 90 % dans l'eau. Fixez un raccord femelle-femelle, un microferal et un écrou femelle à une extrémité d'un tube peak de 50 centimètres de longueur et de 200 micromètres de diamètre intérieur. Placez un écran de 1/16 de pouce avec des pores d'un micromètre à l'extrémité du tube à l'intérieur du microferal.À l’aide d’une pompe à pression réglée à 4 500 psi, comprimez la résine d’échange anionique dans le capillaire jusqu’à ce que le matériau soit visible au sommet. Fixez un autre raccord femelle-femelle, un microferal et un écrou femelle à l’extrémité supérieure du capillaire compacté, à l’opposé de l’extrémité initiale, afin de terminer l’assemblage de la colonne. Lavez 50 à 100 milligrammes de tissu avec du tampon salin phosphate pendant cinq minutes.Répétez ce lavage deux fois, puis placez le tissu lavé dans des tubes munis de bouchons de sécurité. Ajoutez à chaque tube une quantité équivalente en poids de billes d'acier inoxydable et 2,5 volumes équivalents d'une solution aqueuse de 100 millimolaire d'acétate d'ammonium contenant 1 % de désoxycholate de sodium. Homogénéisez le tissu à intensité maximale pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, centrifuger l'homogénat pendant dix minutes à 10 000 x g et à quatre degrés Celsius. Transférer le surnageant dans un tube de 1,5 millilitre. Poursuivre l'homogénéisation et la centrifugation du culot tissulaire, en combinant les surnageants à chaque fois, jusqu'à ce qu'aucun culot ne soit observé.Quantifiez la concentration en protéines dans les surnageants combinés à l’aide d’un dosage à l’acide bicinchoninique. Ensuite, ajoutez au homogénat une solution monomolaire de dithiothréitol dans de l’acétate d’ammonium 100 millimolaire afin d’obtenir une concentration finale de dithiothréitol de 10 millimolaire dans l’échantillon. Incubez l’homogénat dans un bain-marie à 60 degrés Celsius pendant trente minutes.Ajouter au homogénat une solution monomolaire d'iodoacétamide dans de l'acétate d'ammonium 100 millimolaire afin d'obtenir une concentration d'iodoacétamide de 20 millimolaire dans l'échantillon. Incuber l'homogénat à température ambiante, à l'abri de la lumière, pendant 45 minutes. Ensuite, diluer l'homogénat avec deux volumes équivalents d'une solution de dithiothréitol 10 millimolaire dans de l'acétate d'ammonium 100 millimolaire.Incuber l'homogénat à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajouter à l'homogénat un volume suffisant de trypsine modifiée de qualité séquençage dans de l'acétate d'ammonium 100 millimolaire afin d'obtenir un rapport protéine-enzyme de 1 à 50 en poids dans l'échantillon. Incuber l'échantillon à 30 degrés Celsius toute la nuit pour digérer l'homogénat.Arrêter la digestion en ajoutant 0,5 % du poids de l'échantillon d'acide formique, ce qui précipite les sels de désoxycholate de sodium. Vortexer doucement les échantillons contenant les sels de SDC, puis centrifuger les échantillons pendant dix minutes à 12 000 x g et à quatre degrés Celsius. Verser délicatement le surnageant dans un nouveau tube, en prenant soin de ne pas perturber le culot de sels de SDC.Réhydrater les sels dans une solution aqueuse contenant 0,5 % en volume d’hydroxyde d’ammonium, en vortexant vigoureusement. Conditionner une cartouche d’adsorbant C-18 d’un gramme avec 5 millilitres d’acétonitrile, suivis de cinq millilitres d’acide trifluoroacétique à 0,1 % dans l’eau. Ensuite, charger l’échantillon digéré sur la cartouche.Lavez les échantillons trois à cinq fois avec des portions de cinq millilitres de TFA à 0,1 %. Ensuite, diluez les peptides avec cinq millilitres d'une solution aqueuse contenant 75 % d'acétonitrile et 0,1 % d'acide formique. Séchez le liquide dans un concentreur sous vide.Ajouter 200 microlitres d'acétonitrile à 75 % contenant 0,1 % d'acide formique au résidu. Vortexer le mélange pendant au moins dix minutes, puis soumettre le mélange à une sonication pendant au moins 30 minutes afin de reconstituer les peptides secs. Diluer l'échantillon selon les besoins, de sorte que l'échantillon injecté contienne un à trois microgrammes de protéine.Reliez la colonne capillaire LAX à un instrument de chromatographie liquide à ultra-haute pression. Préparez des solutions d'acide formique 0,1 % dans l'eau et l'acétonitrile. Réglez le débit à 0,4 microlitre par minute et configurez une rampe de gradient de 1 200 minutes.Configurer les événements de balayage du spectromètre de masse pour alterner l'acquisition de données entre la spectrométrie de masse en transformée de Fourier complète et la spectrométrie de masse tandem en transformée de Fourier. Réaliser la MS/MS LERLIC afin de séparer et de caractériser les peptides. Utiliser les données obtenues et un logiciel protéomique pour effectuer une recherche dans une base de données protéiques.Exporter les résultats de recherche dans la base de données vers un logiciel de feuille de calcul. Identifier et extraire la liste des peptides déamidés et des peptides non déamidés correspondants. Extraire les chromatogrammes d'ions de chacun de ces peptides avec une tolérance de masse de cinq parties par million.Examinez les chromatogrammes d'ions extraits pour détecter l'illusion de double pic séparé due aux produits isomériques. À l'aide de la spectrométrie de masse LERLIC en mode MS/MS, les isoformes désamidées de la glutamine et de l'asparagine ont été séparées et identifiées à partir d'un échantillon protéique à deux temps de rétention différents. Des résidus intermédiaires de glutamine modifiés enzymatiquement lors de la transamidation, présentant un rapport gamma alpha glutamyle inversé, ont été identifiés.L'intermédiaire succinimide dans les résidus d'asparagine a également été identifié à l'aide de cette méthode. Étant donné que les conditions de traitement des échantillons légèrement acides stabilisent l'intermédiaire succinimide, cela suggère que la technique de spectrométrie de masse/fragmentation LERLIC peut être appliquée à l'étude à l'échelle du protéome des intermédiaires succinimide.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en biochimie pour caractériser la déamination des protéines dans des contextes allant de l'archéologie à la recherche biomédicale.

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Découvrez la méthode LERLIC-MS/MS pour caractériser et quantifier les isoformes de désamidation de la glutamine et de l'asparagine en protéomique shotgun. Cette technique améliore la séparation des isomères sur colonne capillaire.

LERLIC-MS / MS pour la caractérisation en profondeur et Quantification de Glutamine et asparagine désamidation dans Shotgun Proteomics (Vidéo) | JoVE Journal

LERLIC-MS / MS pour la caractérisation en profondeur et Quantification de Glutamine et asparagine désamidation dans Shotgun Proteomics

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