LERLIC-MS / MS pour la caractérisation en profondeur et Quantification de Glutamine et asparagine désamidation dans Shotgun Proteomics

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser la protéomique de chasse pour caractériser et quantifier les produits de désamidation endogènes de la glutamine et de l’asparagine dans les protéomes complexes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biochimie, telles que l’influence d’un processeur spontané et antimatique sur le produit isométrique gluteo de la glutamine et de l’asparagime désamination. Le principal avantage de cette technique est que les isomères de désamination de la glutamine sont séparés sur une colonne capillaire à changement ionique de longue longueur, maximisant la capacité de séparer les peptides par les points isomatiques.

Pour commencer la construction de la colonne, suspendez 50 milligrammes de matériau d’emballage à échange d’anions faibles dans 3,5 millilitres d’isopropanol à 90 %, dans l’eau. Fixez un raccord femelle à femelle, un microsauvage et un écrou femelle à une extrémité d’un tube de pointe de 50 centimètres de long avec un diamètre intérieur de 200 micromètres. Installez un écran de 1/16e de pouce avec des pores d’un micromètre à l’extrémité du tube à l’intérieur du microsauvage.

À l’aide d’une pompe à pression réglée à 4 500 psi, emballez l’échange d’anions dans le capillaire jusqu’à ce que le matériau soit visible en haut. Fixez un autre raccord femelle à femelle, un micro-sauvage et un écrou femelle au sommet du capillaire garni à l’extrémité opposée pour terminer l’assemblage de la colonne. Lavez 50 à 100 milligrammes de tissu avec une solution saline tamponnée au phosphate pendant cinq minutes.

Répétez ce lavage deux fois, puis placez le tissu lavé dans des tubes munis de bouchons de sécurité. Ajoutez à chaque tube l’équivalent en poids de billes d’acier inoxydable et 2,5 équivalents en volume d’une solution aqueuse de 100 millimolaires d’acétate d’ammonium avec 1 % de désoxycholate de sodium. Homogénéisez le tissu à l’intensité maximale pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, centrifugez l’homogénat pendant dix minutes à 10 000 x g et quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant dans un tube de 1,5 millilitre. Continuez à homogénéiser et à centrifuger la pastille tissulaire, en combinant les surnageants à chaque fois jusqu’à ce qu’aucune pastille ne soit observée.

Quantifier la concentration en protéines dans les surnageants combinés à l’aide d’un dosage de l’acide bicinchoninique. Ensuite, ajoutez à l’homogénat une solution molaire de dithiothréitol dans de l’acétate d’ammonium de 100 millimolaires pour atteindre une concentration de dithiothréitol de dix millimolaires dans l’échantillon. Incuber l’homogénat dans un bain-marie à 60 degrés Celsius pendant trente minutes.

Ajouter à l’homogénat une solution molaire d’iodoacétamide dans de l’acétate d’ammonium de 100 millimolaires pour obtenir une concentration d’iodoacétamide de 20 millimolaires dans l’échantillon. Incuber l’homogénat à température ambiante en l’absence de lumière pendant 45 minutes. Diluez ensuite l’homogénat avec deux équivalents volumiques d’une solution de dix millimolaires de dithiothréitol dans de l’acétate d’ammonium de 100 millimolaires.

Incuber l’homogénat à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajouter à l’homogénat un volume suffisant de trypsine modifiée de qualité séquençage dans de l’acétate d’ammonium de 100 millimolaires pour obtenir un rapport d’enzymes protéiques de 1 à 50 en poids dans l’échantillon. Incuber l’échantillon à 30 degrés Celsius pendant la nuit pour digérer l’homogénat.

Trempez la digestion avec 0,5 % du poids de l’échantillon d’acide formique, en précipitant les sels de désoxycholate de sodium. Vortex doucement les échantillons contenant des sels SDC, puis centrifugez les échantillons pendant dix minutes à 12 000 x g et quatre degrés Celsius. Décantez le surnageant dans un nouveau tube, en prenant soin de ne pas déranger la pastille de sels SDC.

Redissolvez les sels dans une solution aqueuse à 0,5 % en volume d’hydroxyde d’ammonium, en tourbillonnant vigoureusement. Conditionnez une cartouche de sorbant C-18 d’un gramme avec 5 millilitres d’acétonitrile, suivie de cinq millilitres d’acide trifluoroacétique à 0,1 % dans de l’eau. Ensuite, chargez l’échantillon digéré sur la cartouche.

Lavez les échantillons trois à cinq fois avec des portions de cinq millilitres de TFA à 0,1 %. Diluez ensuite les peptides avec cinq millilitres d’une solution aqueuse de 75 % d’acétonitrile et 0,1 % d’acide formique. Séchez le fluide dans un concentrateur sous vide.

Ajoutez 200 microlitres d’acétonitrile à 75 %, avec 0,1 % d’acide formique au résidu. Agitez le mélange pendant au moins dix minutes, puis sonicez le mélange pendant au moins 30 minutes pour reconstituer les peptides secs. Diluez l’échantillon au besoin, de sorte que l’échantillon injecté contienne un à trois microgrammes de protéines.

Connectez la colonne capillaire LAX à un instrument de chromatographie liquide à ultra haute pression. Préparez des solutions d’acide formique à 0,1 % dans de l’eau et de l’acétonitrile. Réglez le débit à 0,4 microlitre par minute et configurez un gradient de 1 200 minutes.

Configurez les événements de balayage du spectromètre de masse pour alterner l’acquisition de données, entre la spectrométrie de masse à transformée de Fourier complète et la spectrométrie de masse en tandem à transformée de Fourier. Effectuer LERLIC MS/MS pour séparer et caractériser les peptides. Utilisez les données résultantes et le logiciel de protéomique pour effectuer une recherche dans la base de données de protéines.

Exportez les résultats de la recherche dans la base de données vers un tableur. Identifiez et extrayez la liste des peptides désamidés et des peptides non désamidés correspondants. Extrayez les chromatagrammes ioniques de chacun de ces peptides avec une tolérance de masse de cinq parties par million.

Inspectez les chromatagrammes ioniques extraits pour détecter l’illusion de double pic séparé des produits isomères. À l’aide de LERLIC MS/MS, des isoformes désamidées de glutamine et d’asparagine ont été séparées et identifiées d’un échantillon de protéines à deux temps de rétention différents. Des résidus intermédiaires de glutamine modifiés par voie enzymatique montrant un rapport gamma alpha glutamil inversé ont été identifiés.

L’intermédiaire succinimide dans les résidus d’asparagine a également été identifié avec cette méthode. Comme les conditions de traitement des échantillons légèrement acides stabilisent l’intermédiaire succinimide. Cela suggère que la technique LERLIC MS/MS peut être appliquée à l’étude à l’échelle du protéome des intermédiaires succinimides.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en biochimie pour caractériser la désamidation des protéines dans des contextes allant de l’archéologie à la recherche biomédicale.