Name: Dans Ovo Electroporation dans le Brainstem (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Découvrez l'électroporation in ovo pour contrôler l'expression génique dans le tronc cérébral auditif du poulet. Cette méthode permet d'étudier le développement des neurones auditifs et les phénomènes physiopathologiques associés.

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Nous tenons à remercier les Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria et Mme Ximena Optiz-Araya pour une assistance initiale avec la mise en place du protocole et pour la fourniture de plasmides. Ce travail a été soutenu par la subvention NIY / NIDCD DC013841 (JTS).

Toutes les procédures ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université Northwestern et ont été réalisées conformément aux Lignes directrices nationales sur les soins de santé et à l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 1. Manutention des œufs <ol><li> Achetez des œufs fécondés d&#39;un fournisseur local. Conserver les œufs à 13 ° C dans un réfrigérateur pendant plus de 5 jours avant l&#39;incubation. La viabilité des embryons diminue significativement après 1 semaine. </li><li> Éponger chaque oeuf avec 70% d&#39;éthanol avant de mettre dans l&#39;incubateur. </li><li> Réglez 1-2 douzaines d&#39;oeufs sur leurs côtés dans un incubateur avec une température réglée à 38 ° C à ~ 50% d&#39;humidité. Cela garantit un positionnement correct de l&#39;embryon pour l&#39;électroporation et une viabilité optimale, respectivement. REMARQUE: Après 48-52 h d&#39;incubation, les oeufs seront au stade Hamburger-Hamilton (HH) ~ 12-13 et prêts à l&#39;électroporation. </li></ol> 2. Préparation <ol><li> Plasmid MiXing <ol><li> Ajouter 1 μL de 0,1% de vert rapide (0,1% dans H 2 O désionisé 18 MΩ désionisé et distillé pour chaque 7 μl de mélange d&#39;ADN. </li><li> Pour la co-électroporation de plasmides multiples, mélanger les plasmides dans un rapport 1: 1. La concentration finale en ADN devrait être de 5 à 8 μg / μL. </li></ol></li><li> Pipette à injection de remplissage <ol><li> Tirez les pipettes sur un extracteur à micropipettes. Remplissez la pipette avec 1-2 μL de plasmides à l&#39;aide d&#39;une aiguille de seringue 28G. </li><li> Faites passer la pointe de la pipette à 10 à 20 μm à l&#39;aide d&#39;une pince. Utilisez un microscope pour aider à déterminer la taille de la pointe de la pipette cassée. Fixez la pipette sur le porte-pipette du picospritzer. </li></ol></li></ol> 3. Roulant REMARQUE: la procédure de fenêtrage a été publiée avant 13 . Voir la référence 13 pour des informations visuelles supplémentaires. <ol><li> Essuyez tous les instruments et la zone de travail avec 70%L&#39;éthanol. </li><li> Prenez le nombre souhaité d&#39;oeufs fixés hors de l&#39;incubateur (entre 6-10), laissez-vous à température ambiante, et égouttez les oeufs avec 70% d&#39;éthanol à nouveau. Les œufs restent viables pendant au moins 2 h après l&#39;enlèvement de l&#39;incubateur. </li><li> Placez l&#39;oeuf sur un illuminateur lumineux pour identifier le positionnement de l&#39;embryon. Entourez le centre de la zone sombre ( c&#39;est-à-dire l&#39; embryon) avec un crayon. </li><li> En utilisant une aiguille 19G, piquez un trou dans l&#39;extrémité émoussée de l&#39;œuf. </li><li> Poussez un autre trou près du cercle dessiné sur le côté pointu de l&#39;oeuf. Retirez un petit morceau de coquille d&#39;oeuf extérieur (environ 16 mm 2 ) avec l&#39;aiguille 19G, puis enlevez une petite partie de la coquille d&#39;oeufs interne (environ 8 mm 2 ) avec une pince. </li><li> Avec une seringue de 3 mL munie d&#39;une aiguille 19G, retirez 1,5 à 2,5 ml d&#39;albumine de l&#39;oeuf à travers le trou à extrémités franches. Assurez-vous d&#39;incliner l&#39;aiguille à 45 °. </li><li> Couvrez le trou à extrémités franches avec un petit morceau de ruban adhésif (1 cm x 1 cm). Couvrez le cercle tiré etD le deuxième trou avec un ruban adhésif (2,5 cm x 4 cm). </li><li> Avec des ciseaux courbes (tranchant = 2,5 cm), couper une fenêtre dans le cercle. Les ciseaux doivent être parallèles à la coquille d&#39;oeuf et le diamètre de la fenêtre doit être inférieur à 2 cm. </li></ol> 4. Injection de plasmide <ol><li> Allumez le picospritzer. Réglez la pression à 18 psi et la durée à 5 μs. Allumez le réservoir d&#39;air et la lampe pour le microscope à dissection. </li><li> Faire une solution stock de 30 ml d&#39;une dilution 1:10 d&#39;une encre indienne achetée en magasin mélangée à une solution salée stérile tamponnée au phosphate (PBS). Conserver à 4 ° C. L&#39;injection d&#39;encre indienne est une étape importante pour obtenir une meilleure visualisation de l&#39;embryon de poulet. <ol><li> Remplissez une seringue de 1 ml avec la solution diluée d&#39;encre indienne. Fixez une aiguille 27G et élevez toutes les bulles qui sont présentes dans la seringue. </li><li> Insérez l&#39;aiguille juste sous la membrane de jaune ~ 2 - 3 mm de l&#39;embryon et injectez doucement 0,2 ml d&#39;encre indienne sous l&#39;embryon. FaireNe pas injecter plus de 0,5 ml de l&#39;encre indienne, car cela pourrait diminuer la survie des embryons. </li></ol></li><li> Placez l&#39;oeuf fenêtré sur un porte-oeufs sous le microscope à dissection. Utilisez le grossissement le plus élevé pour une meilleure visualisation du site d&#39;injection de plasmide. </li><li> À l&#39;aide d&#39;une pince, retirez la membrane sur la zone d&#39;injection. Les régions d&#39;intérêt auditives du tronc cérébral ( c.-à-d . NM et NL) proviennent de Rhombomeres 5 et 6 (R5 / R6). R5 / R6 sont situés à côté des otocystes (une structure embryonnaire chez les vertébrés qui se développent dans l&#39;oreille interne) qui servent de repères pour les injections de plasmides R5 / R6. </li><li> Abaissez la pipette remplie d&#39;ADN dans le tube neural recouvrant la région R5 / R6 et entre les otocystes à l&#39;aide du micromanipulateur. Un schéma de placement idéal est illustré à la figure 1A . </li><li> Appliquer la pression d&#39;air (18 psi, 5 μs de durée) du picospritzer pour éjecter l&#39;ADN dans le tube neural. </li></ol> 5. Electroporation <ol><li> Allumez tLe stimulateur courant / tension. </li><li> Remplissez une seringue de 3 mL avec du PBS et fixez le filtre à seringue. Ajouter 1-2 gouttes de PBS sur l&#39;embryon. </li><li> Abaisser l&#39;électrode bipolaire à l&#39;embryon en utilisant le micromanipulateur avec l&#39;électrode négative au-dessus du site d&#39;injection (médiale) et l&#39;électrode positive latérale au R5 / R6 ( Figure 1A ). Évitez le contact direct avec l&#39;embryon. Utilisez des électrodes bipolaires où le matériau de l&#39;électrode est de l&#39;iridium platine. Ajustez l&#39;espacement entre les pointes à 0,5 mm avec une pince. </li><li> En utilisant un stimulateur courant / tension, appuyez 20 fois à 50 V pendant 1 ms à intervalles de 1 s. </li><li> Après l&#39;électroporation, ajouter une goutte de PBS sur la zone exposée. Retirez doucement l&#39;électrode et nettoyez-la avec un tissu de laboratoire et 70% d&#39;éthanol. Fermez la fenêtre en exposant l&#39;embryon avec du ruban adhésif. </li><li> Étiqueter la coquille d&#39;oeuf avec le type de plasmide injecté et la date d&#39;éclosion. </li><li> Placez les œufs dans l&#39;incubateur avec le côté fenêtre vers le haut. Incuber à 38 ° C avec 50% D&#39;humidité jusqu&#39;à ce que le stade de développement souhaité soit atteint. </li><li> Si un vecteur tet-on est électroporé pour le contrôle temporel de l&#39;expression des gènes, appliquer Doxycycline (Dox) toutes les 24 h pour induire l&#39;expression du gène (voir la Section 6). </li></ol> 6. Système Tet-on pour le contrôle temporel de l&#39;expression génétique <ol><li> Utilisez les plasmides suivants: PCAGGS-T2TP: un plasmide exprimant la transposase. PT2K-CAGGS-rtTA-M2: un plasmide qui exprime de manière stable la protéine de liaison Dox. PT2K-BI-TRE-EGFP: un plasmide qui contient une expression efficace du promoteur tet-on bidirectionnel (TRE) du journaliste EGFP et un second gène d&#39;intérêt. NOTE: Les trois plasmides ci-dessus doivent être co-électroporés dans un rapport 1: 1: 1. </li><li> Préparation de la solution stock: <ol><li> Dissoudre Dox dans du PBS stérile pour produire une solution mère de 1 mg / ml. Stocker à -20 ° C. </li></ol></li><li> Application Dox: <ol><li> Pour induire l&#39;expressioN du gène d&#39;intérêt pendant certaines étapes de développement, appliquer Dox toutes les 24 h. </li><li> Lorsque vous appliquez Dox, prenez l&#39;œuf, ouvrez la fenêtre, faites pipeter 50 μL de Dox sur la membrane chorioallointoïque, fermez la fenêtre et remettez l&#39;oeuf dans l&#39;incubateur. </li></ol></li></ol> 7. Préparation de la zone de dissection pour les tranches de tronc cérébral REMARQUE: Les sections suivantes (7 à 9) et les procédures ont été publiées avant 14 . Veuillez consulter ces références pour des informations visuelles supplémentaires. <ol><li> Préparez une solution d&#39;agar (40 mg / ml d&#39;agarose, soit 4% dans ddH 2 O). Versez la solution d&#39;agar dans une boîte de Petri et laissez-la solidifier à température ambiante. Stocker la plaque de gélose couverte dans le réfrigérateur pour une utilisation ultérieure pendant le tranchage du tissu cervical. </li><li> Fluide rachidien cérébral artificiel à bulles continues (ACSF) avec 95% d&#39;O 2 et 5% de CO 2 (pH 7,2-7,4 et osmolarité: 295-310 mOsm / L).</li><li> Nettoyez la zone de travail et vibratome avec 70% d&#39;EtOH et rincez la lame avec de l&#39;eau distillée. </li><li> Placez un tampon d&#39;absorption de fluide propre sur la zone de travail avec des outils de dissection appropriés. </li><li> Retirez la plaque de gélose du réfrigérateur, coupez un petit cube d&#39;agar (10 mm x 10 mm x 8 mm). Collez le bloc d&#39;agar jusqu&#39;à la phase d&#39;une chambre à vibration avec une superglue disponible dans le commerce. </li></ol> 8. Isolation du tronc cérébral auditif du poulet <ol><li> Ouvrez l&#39;oeuf au site de la fenêtre écrite. Percez le sac de membrane avec un scalpel et retirez la tête de l&#39;embryon de poulet. </li><li> Décapiter le poulet avec des ciseaux tranchants. </li><li> Placez la pointe de la lame de rasoir légèrement postérieure aux yeux. Incise à travers le crâne à la ligne médiane rostrale-caudale. Appliquer une légère pression en fonction de l&#39;âge de l&#39;embryon. Les embryons plus âgés nécessitent plus de pression. </li><li> Retirez doucement la peau et les plumes pour exposer le crâne et vérifiez la coupe de la ligne médiane. </li><li> Application sTrong pression, couper la partie rostrale du crâne avec une lame de rasoir. Placez immédiatement la lame postérieure aux yeux et coupez tout le crâne et le tissu cérébral. </li><li> Effectuez des incisions médian-latérales avec des ciseaux dans la région caudale du crâne, légèrement antérieur aux muscles du cou des deux côtés de la tête. Exposez le cerveau et le cervelet en retirant le crâne et l&#39;excès de tissu. </li><li> Couper les tissus attachés au tronc cérébral avec des ciseaux et enlever le tronc cérébral, qui se détache librement du crâne. </li></ol> 9. Préparation des tranches de contre-cœur pour l&#39;électrophysiologie ou l&#39;imagerie In Vivo <ol><li> Enrouler le tronc cérébral à travers la technologie optique. </li><li> Retirez le cervelet en coupant les pédicules avec des ciseaux, en exposant le plancher du quatrième ventricule. </li><li> À l&#39;aide de pincettes, enlever tout tissu membranaire et les vaisseaux sanguins de la surface du tronc cérébral. </li><li> Pour bloquer le tronc cérébral, faites une coupe horizontale à l&#39;extrémité plus rose du plancher des quatreVentricule, juste caudal au cortex. Faire des coupures latérales perpendiculaires à travers la technologie optique pour isoler le tronc cérébral. </li><li> Placez une petite quantité de super-colle sur le stade vibratome directement devant le bloc d&#39;agar. </li><li> Soulevez le tronc cérébral à la moelle épinière à l&#39;aide de pincettes et placez-le sur la super-colle avec le côté rostral vers le bas et le côté dorsal vers la lame vibratome. Retirer l&#39;excès de colle avec un papier de laboratoire ou un papier filtre. </li><li> Versez l&#39;ACSF oxygéné dans le stade vibratome. Réglez la lame vibratome à un angle de 20 à 22 °. Démarrez vibratome à une oscillation à amplitude maximale. Déplacez la platine vers la lame afin que le haut du tissu soit parallèle à la lame. </li><li> Déplacez rapidement la lame vers le tissu du tronc cérébral. Ralentissez considérablement la lame avant le contact de la lame avec les tissus. </li><li> Tranchez les tissus avec la vitesse d&#39;avancement la plus lente possible. Une fois que la lame est traversée dans toute la section du tissu coronal, retirez doucement la tranche à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert. &lt;/ Li&gt; <li> Abaisser le stade 200-300 μm et découper à nouveau. Répétez jusqu&#39;à ce que les points de repère anatomiques des noyaux auditifs deviennent visibles, par exemple, la région distincte de neuropil dorsale / ventrale de NL et l&#39;emplacement médian de NM par rapport à NL. </li><li> Gardez soigneusement les tranches dans ACFS. Cela peut être effectué à température ambiante (22 ° C) ou à proximité de conditions physiologiques (~ 41 ° C) à l&#39;aide d&#39;un bain d&#39;eau chaude. Notez l&#39;ordre de découpe. La première tranche correspond à la région la plus caudale du tissu et la dernière tranche correspond à la région la plus montante. Cela représente à peu près l&#39;organisation tonotopique du tronc cérébral auditif, respectivement des régions codantes de faible à haute fréquence. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Dans ovo, l&#39; électroporation est une méthode d&#39;expression ou de suppression des gènes d&#39;intérêt afin d&#39;analyser la fonction de gène in vivo 8 , 9 . Dans l&#39;embryon de poulet, il s&#39;agit d&#39;une méthode innovante pour exprimer des gènes encapsulés en plasmides dans différentes régions du tronçonnage auditif 8 . Pour assurer une expression optimale, plusieurs étapes critiques sont requises. Tout d&#...

Le codage neural rapide du son est essentiel pour les fonctions auditives normales. Ceux-ci comprennent les capacités de localisation du son 1 , la discographie dans la discrimination de bruit 2 et la compréhension d&#39;autres signaux de communication pertinents au comportement 3 . Les neurones analogues situés dans le tronc cérébral auditif des oiseaux et des mammifères sont hautement spécialisés pour un codage neural rapide 4 . Ceux-ci incluent le noyau de poulet magnocellularis (NM), le noyau laminaris (NL) et leurs analogues de mammifères, le noyau cochléaire antéroventral (AVCN) et l&#39;olive supérieure médiale (MSO), respectivement 5 . Cependant, les mécanismes de développement régulant le codage rapide des neurones sont mal compris dans le tronc cérébral auditif. Par conséquent, il est avantageux d&#39;étudier des gènes spécifiques qui sont responsables de l&#39;encodage neural rapide afin de mieux comprendre leur expression, leur régulation et leur fonction au seinDéveloppement de l&#39;école. L&#39;embryon de poulet en développement est un outil de recherche efficace et bien établi pour étudier les questions biologiques fondamentales du développement du système auditif 6 , 7 . Des avancées moléculaires récentes ont abordé ces questions biologiques dans l&#39;embryon de poulet en développement en exprimant ou en abaissant les gènes d&#39;intérêt afin d&#39;analyser la fonction de gène in vivo 8 , 9 . L&#39;étude du rôle réglementaire des gènes spécifiques est un progrès important dans la compréhension des pathologies associées aux déficits auditifs. Ici, nous présentons dans l&#39; électroporation ovo de gènes codés par plasmide dans le tronc cérébral auditif de poulet où un codage neural rapide du son se produit 10 . En ciblant les régions de progéniteurs neuronaux auditifs associés aux rhombomères 5 et 6 11 , 12 (R5 /R6), nous montrons un contrôle spatial de la transfection du plasmide dans NM et NL. En outre, nous montrons une régulation temporelle de l&#39;expression en adoptant un système vectoriel tet-on. Il s&#39;agit d&#39;une procédure induite par un médicament qui exprime les gènes d&#39;intérêt en présence de doxycycline (Dox) 8 .

<table><tbody><tr><td>Œufs de poule leghorn blanc fécondés</td><td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III, stimulateur de courant/tension à un ou deux canaux</td></tr><tr><td></td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>SD9 Aiguilles</td></tr> de <tr><td>seringue Microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td>Calibre 28, 67 mm de long, (paquet de 5)</td></tr><tr><td>Porte-électrode</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1280</td><td>MP Series : Non-Electrical Pressure Applications</td></tr><tr><td>Microélectrode</td><td>stimulante FHC</td><td>PBSA1075</td><td>PBSA1075</td></tr><tr><td>Réservoir d’air/régulateur</td><td>NU Laboratory Services</td><td></td><td>Air dry 300 CF</td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>F7258-25G</td></tr><tr><td>Ruban en plastique transparent</td><td>Scotch</td><td>191</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Réfrigérateur à oeufs</td><td>Vissani Cave à</td><td></td> vin <td>13.3 - 16.1 &deg ; C (56-61° ; F)</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Hova-Bator</td><td></td><td>38 &deg ; C (100 &deg ; F), ~50 % d’humidité</td></tr><tr><td>Lunette de dissection</td><td>Zeiss</td><td>4.35E+15</td><td>SteREO Discovery, Microscope V8, 50.4X</td></tr><tr><td>Source de lumière froide</td><td>Zeiss</td><td>4.36E+15</td><td>CL6000</td></tr><tr><td>Micromanipulateurs</td> LED <td>Narishige Japon</td><td>Modèle : MM-3</td><td>2 Micromanipulateurs</td></tr><tr><td>Tubes capillaires</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10</td><td>Borosilicate à paroi épaisse (dimensions)</td></tr><tr><td>Seringues</td><td></td><td></td><td>1 mL, 3 mL</td></tr><tr><td>Aiguilles</td><td>BD Precision Glide&nbsp ;</td><td></td><td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td></tr><tr><td>Pince</td><td>Stoelting</td><td></td><td>No. 5 Super Fine Dumont</td></tr><tr><td>Egg Holder</td> La base en argile <td>sur mesure</td><td></td><td>fonctionne aussi bien Extracteur</td></tr> de <tr><td>micropipette</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>Model P-97</td></tr><tr><td>Filtre à seringue</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-358811</td><td>PVDF 0.22 &mu ; L</td></tr></tbody></table>

dans ovo electroporation dans le brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

L&#39;électroporation est une méthode qui introduit des gènes d&#39;intérêt dans des organismes biologiquement importants comme l&#39;embryon de poulet. Il est établi depuis longtemps que l&#39;embryon de poulet est un modèle de recherche efficace pour l&#39;étude des fonctions biologiques de base du développement du système auditif. Plus récemment, l&#39;embryon de poulet est devenu particulièrement utile dans l&#39;étude de l&#39;expression des gènes, de la régulation et de la fonction associée à l&#39;ouïe. L&#39; électroporation in ovo peut être utilisée pour cibler les régions auditives du tronçon vertébral responsables de fonctions auditives hautement spécialisées. Ces régions comprennent le noyau de poulet magnocellularis (NM) et le noyau laminaris (NL). Les neurones NM et NL proviennent de précurseurs distincts des rhombomères 5 et 6 (R5 / R6). Ici, nous présentons dans l&#39;ovo l&#39; électroporation de gènes codés par un plasmide pour étudier les propriétés liées aux gènes dans ces régions. Nous montrons une méthode de contrôle spatial et temporel de l&#39;expression des gènes qui favorise soit le gain, soit la perte de phénotypes fonctionnelsEs. En ciblant les régions de progéniteurs neuronaux auditifs associés à R5 / R6, nous montrons une transfection de plasmide dans NM et NL. La régulation temporelle de l&#39;expression des gènes peut être réalisée en adoptant un système vectoriel tet-on. Il s&#39;agit d&#39;une procédure induite par un médicament qui exprime les gènes d&#39;intérêt en présence de doxycycline (Dox). La technique d&#39;électroporation in ovo - avec des analyses fonctionnelles biochimiques, pharmacologiques ou in vivo - offre une approche innovante pour étudier le développement des neurones auditifs et les phénomènes pathophysiologiques associés.

Nous montrons ici que, dans ovo, l&#39; électroporation permet l&#39;expression des gènes dans un système biologique normalement développé. Les gènes codés par un plasmide sont injectés de manière focalisée dans le tube neural recouvrant R5 / R6. Un exemple schématique des emplacements des électrodes et des pipettes par rapport aux marqueurs anatomiques importants est illustré à la figure 1A . L&#39;emplacement correct de l&#39;injection de plasmide est confirmé...

Les neurones auditifs du tronc cérébral des oiseaux et des mammifères sont spécialisés pour l&#39;encodage neuronal rapide, un processus fondamental pour les fonctions auditives normales. Ces neurones proviennent de précurseurs distincts du cerveau postérieur embryonnaire. Nous présentons des techniques utilisant l&#39;électroporation pour exprimer des gènes dans le cerveau postérieur d&#39;embryons de poulet pour étudier la fonction des gènes pendant le développement auditif.

Dans Ovo Electroporation dans le Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

L'objectif général de cette procédure est de contrôler spatialement et temporellement l'expression génique dans le tronc cérébral auditif du poulet. L'utilisation de l'électroporation in ovo offre une approche innovante pour étudier le développement des neurones auditifs ainsi que les phénomènes pathophysiologiques associés. Cette procédure permet de répondre à des questions clés dans le domaine du développement neuronal auditif, telles que la manière dont le contrôle de l'expression génique favorise soit un gain soit une perte de phénotype nécessaires au développement normal du tronc cérébral auditif.Le Dr Ting Lu, chercheur postdoctoral de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer, préparez les solutions de plasmide en ajoutant un microlitre de solution de vert rapide pour chaque sept microlitres de mélange d'ADN. Ensuite, mélangez les solutions d'ADN selon un rapport de un à un pour l'électroporation simultanée de plusieurs plasmides.Une fois la solution de plasmide préparée, fabriquez des pipettes à l’aide d’un étireur de micropipettes. Ensuite, utilisez une aiguille de seringue de calibre 28 pour remplir la pipette avec un à deux microlitres de la solution de plasmide. À l’aide de pinces, cassez l’extrémité de la pipette à une longueur de 10 à 20 microns et déterminez la taille de l’extrémité cassée au microscope, puis reliez la pipette à un picospritzer via un support de pipette.Avant la procédure, conserver les œufs achetés auprès d'un fournisseur local pendant un maximum de cinq jours dans un réfrigérateur à 13 degrés Celsius. Pour commencer, désinfecter l'œuf avec de l'éthanol à 70 %, puis, afin d'obtenir un positionnement adéquat de l'embryon, incuber l'œuf sur le côté à 38 degrés Celsius et à une humidité d'environ 50 % pour assurer une viabilité optimale. Après 48 à 52 heures d'incubation, lorsque l'œuf atteint le stade Hamburger-Hamilton d'environ 12 à 13, désinfecter le poste de travail et tous les instruments avec de l'éthanol à 70 %.Ensuite, retirez l'œuf de l'incubateur, laissez-le à température ambiante et essuyez-le avec de l'éthanol à 70 % une deuxième fois. À l’aide d’un éclairage transversal, repérez la position de l’embryon, visible comme une zone sombre, puis marquez-la au crayon en traçant un cercle autour de son centre. Percez un trou à l’extrémité émoussée de l’œuf à l’aide d’une aiguille de calibre 19, puis faites un deuxième trou près du cercle tracé à l’extrémité effilée de l’œuf.Utilisez une aiguille de 19&nbsp;gauge pour retirer un petit morceau de la coquille externe, puis retirez un petit morceau de la membrane interne de la coquille à l’aide d’une pince. Ensuite, insérez une aiguille de 19&nbsp;gauge fixée à une seringue de trois&nbsp;mL par le trou situé à l’extrémité émoussée de l’œuf, et aspirez 1,5 à 2,5&nbsp;mL d’albumen. Recouvrez le trou situé à l’extrémité émoussée de l’œuf avec un morceau de ruban adhésif d’un centimètre sur un centimètre, puis recouvrez le cercle tracé et le second trou avec un morceau de ruban adhésif de 2,5&nbsp;centimètres sur quatre&nbsp;centimètres.À l’aide de ciseaux courbes dotés d’un bord tranchant de 2,5 centimètres et en les maintenant parallèles à la coquille de l’œuf, découper une fenêtre à l’intérieur du cercle marqué. Pour injecter le plasmide, allumer le picospritzer et régler l’appareil afin d’appliquer une pression de 18 PSI pendant cinq microsecondes, puis activer le réservoir d’air et la lampe du microscope de dissection. Ensuite, préparer 30 millilitres d’une solution mère d’encre de Chine commerciale dans du PBS stérile.Aspirez la solution d’encre de Chine dans une seringue d’un millilitre, puis fixez une aiguille de 27 gauge et éliminez toutes les bulles présentes dans la seringue. Pour visualiser l’embryon, insérez l’aiguille juste sous la membrane du vitellus, à environ deux à trois millimètres de l’embryon, et injectez environ 0,2 millilitre d’encre de Chine. Ensuite, transférez l’œuf ouvert vers un support à œufs placé sous le microscope stéréoscopique, puis passez au grossissement maximal afin d’obtenir la meilleure vue possible du site d’injection du plasmide.Retirer la membrane recouvrant la zone d'injection à l'aide d'une pince. Repérer les otocystes et les utiliser comme repères anatomiques pour identifier les rhombomères cinq et six, situés à proximité, à partir desquels émergent le noyau magnocellulaire et le noyau laminaire. À l'aide d'un micromanipulateur, positionner la pipette contenant l'ADN dans le tube neural qui recouvre la région R5-R6, située entre les otocystes.Projetez l'ADN dans le tube neural à l'aide du picospritzer. Pour commencer l'électroporation, allumez le stimulateur de tension, puis fixez un filtre de seringue de 0,22 micron à une seringue de trois millilitres préalablement remplie de PBS, et ajoutez une à deux gouttes de PBS filtré sur l'embryon. Ensuite, approchez une électrode bipolaire de l'embryon à l'aide du micromanipulateur, placez l'électrode négative au-dessus du site d'injection, tout en maintenant l'électrode positive en position latérale par rapport aux segments R5-R6.À l’aide du stimulateur de tension, appliquez 20 impulsions de 50 volts pendant un milliseconde à des intervalles d’une seconde. Vous verrez des bulles apparaître près de l’extrémité de l’électrode. Après électroporation, ajoutez une goutte de PBS sur la zone exposée, retirez délicatement l’électrode et nettoyez-la avec un mouchoir de laboratoire et de l’éthanol à 70 %, puis recouvrez la fenêtre située au-dessus de l’embryon avec du ruban adhésif.Enfin, notez le type de plasmide injecté et la date d'éclosion sur la coquille, puis placez l'œuf dans l'incubateur avec la face de la fenêtre orientée vers le haut. Incubez les œufs à 38 degrés Celsius avec une humidité de 50 %, jusqu'à l'atteinte du stade de développement souhaité. Vingt-quatre heures après l'électroporation, retirez l'œuf de l'incubateur, ouvrez la fenêtre et, à l'aide d'un microscope stéréo, vérifiez l'emplacement correct de l'injection du plasmide ciblé.Si des vecteurs tet-on ont été utilisés, pipetez 50 microlitres de doxycycline dans la membrane chorioallantoïdienne, refermez la fenêtre et replacez l'œuf dans l'incubateur. Voici des photographies d'une coupe de tronc cérébral préparée à partir d'un poulet d'embryon au jour 12, prises en éclairage de contraste interférentiel différentiel et en éclairage fluorescent. Le noyau magnocellulaire et le noyau laminaire peuvent être reconnus au sein de la coupe de tronc cérébral.Sous éclairage fluorescent, les deux structures révèlent l'expression de la protéine fluorescente jaune, confirmant une expression spatiale efficace des gènes électroporés. L'expression du gène électroporé peut également être observée dans une coupe de tronc cérébral comprenant le noyau magnocellulaire, obtenue à partir d'un poulet d'embryon au 18e jour. Lorsqu'elle est agrandie 80 fois, la présence classique de corps cellulaires adendritiques est visible sous éclairage en contraste interférentiel différentiel.Les corps cellulaires des dendrites révèlent une expression de la protéine fluorescente jaune, démontrant ainsi davantage que l'électroporation in ovo peut induire l'expression génique dans des régions spécifiques du tronc cérébral auditif pour des études sur le développement des neurones auditifs. Une fois maîtrisée et si elle est correctement réalisée, cette technique peut être exécutée en deux à trois heures pour environ 12 œufs viables. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que des analyses biochimiques, pharmacologiques et des tests fonctionnels in vitro-in vivo peuvent être mises en œuvre afin de répondre à des questions supplémentaires sur la manière dont les phénotypes d'expression génique régulent le développement normal du tronc cérébral auditif.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de contrôler spatialement et temporellement l'expression génique dans le tronc cérébral auditif du poulet. L'électroporation in ovo permet un contrôle génétique des spécialisations anatomiques et physiologiques, ainsi que des périodes temporelles bien définies du développement du tronc cérébral auditif.

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Research

Recherche

JoVE Journal

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Dans Ovo Electroporation dans le Brainstem

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