Tirer parti du phénotype de population latérale déclenchée par l'ADN pour détecter et purifier les cellules souches du cancer à partir d'échantillons biologiques

L'objectif général de cette procédure est de détecter des populations cellulaires de cellules souches cancéreuses présumées dans des échantillons biologiques, en se basant sur la capacité d'expulsion de colorant des cellules de la population latérale. Cette méthode répond à une question essentielle dans la recherche sur les cellules souches cancéreuses, à savoir la mise au point de moyens fiables pour la détection et la purification des cellules souches cancéreuses à partir d'échantillons biologiques. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation de marqueurs fonctionnels, offrant ainsi une meilleure résolution.

En outre, l'expression de ces transporteurs ABC de médicaments est fortement conservée parmi les cellules souches cancéreuses, et nous pouvons donc utiliser cette technique pour de nombreuses entités cancéreuses différentes. Les implications de cette technique s'étendent à la découverte de thérapeutiques ciblant les cellules souches cancéreuses, car elle facilite des analyses en aval telles que le profilage de l'expression génique et la validation de cibles dans des cellules cancéreuses hautement purifiées. Cette méthode peut donc fournir des informations sur les caractéristiques des cellules souches cancéreuses.

Nous pouvons également utiliser cette méthode pour caractériser des systèmes composés de populations exprimant des transporteurs de médicaments ABC, comme la moelle osseuse. La procédure sera démontrée par Elisabeth Hoflehner, technicienne de mon laboratoire. Pour commencer, cultivez la lignée cellulaire cancéreuse humaine souhaitée à 37 degrés Celsius dans 10 à 30 millilitres de milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10 % de FBS, 2 millimètres de L-glutamine et des antibiotiques.

Lorsque les cellules atteignent une confluence d'environ 70 à 90 %, retirez le milieu et ajoutez deux millilitres de trypsine-EDTA à 0,05 % pour détacher les cellules de la surface de la boîte de culture. Ensuite, lavez les cellules avec 10 millilitres de milieu de culture, transférez la suspension dans un tube propre de 15 millilitres et centrifugez à 250 ×g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Une fois les cellules en pellet, jetez le surnageant et resuspendez le culot dans un millilitre de milieu de culture.

Mélangez un petit aliquot de la suspension cellulaire avec une solution de bleu de trypan et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Pour préparer les échantillons de test, suspendez les cellules dans un milieu de culture frais afin d’obtenir une suspension cellulaire contenant un fois dix puissance six cellules par millilitre. Après avoir ajusté la densité cellulaire, transférez trois millilitres de l’échantillon dans un tube conique de 15 millilitres étiqueté comme étant le tube de test.

Ensuite, ajouter 10 micromolaire de colorant violet à l'échantillon et mélanger doucement la suspension par vortex. Préparer ensuite les témoins d'inhibition en transférant 500 microlitres de la suspension cellulaire contenant le colorant dans deux tubes de cytométrie en flux étiquetés comme témoins. Ajouter 50 micromolaire de vérapamil au premier.

Et 20 micromolaire de Fumitremorgin C dans le deuxième tube. Mélanger les solutions en pipetant doucement. Boucher tous les tubes et les incuber à 37 degrés Celsius à l’obscurité pendant 90 minutes.

Agiter doucement les échantillons toutes les 15 minutes. Une fois la coloration terminée, laver les contrôles d'inhibition avec trois à quatre millilitres de PBS glacé. Préparer des aliquotes de l'échantillon test pour une coloration double ultérieure avec des anticorps.

Effectuez également le lavage de ces aliquotes et filtrez tous les échantillons à l’aide de tamis de 70 microns pour éliminer les agrégats cellulaires éventuels. Ensuite, centrifugez les suspensions à 250 × g à 4 °C pendant cinq minutes. Après avoir resuspendu le culot obtenu dans 100 µL de PBS, maintenez les cellules sur glace, à l’abri de la lumière.

Ensuite, ajoutez un panel approprié d'anticorps conjugués à des fluorochromes sur les cellules préalablement colorées avec le colorant violet. Vortexez les suspensions et incubez-les à quatre degrés Celsius, à l'abri de la lumière, pendant 20 à 30 minutes. Après l'incubation, lavez les cellules avec trois à quatre millilitres de PBS glacé, filtrez l'échantillon si désiré.

Ensuite, centrifuger à 250 × g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Éliminer le surnageant et resuspendre les cellules en culot dans 100 microlitres de PBS. Enfin, ajouter le 7-AAD aux cellules préalablement marquées avec le colorant violet.

Et incuber les échantillons pendant cinq à 10 minutes à l'abri de la lumière. Pour analyser les cellules à l'aide du cytomètre en flux, sélectionner une population cellulaire appropriée sur un dot plot FSC SSC. Ensuite, à l'aide de différents signaux FSC, exclure de la population sélectionnée tous les agrégats cellulaires.

Exclure les cellules présentant une coloration positive au 7-AAD afin d'obtenir la population de cellules viables. Pour créer un diagramme de dispersion pour les émissions des colorants bleu et rouge, afficher le canal de fluorescence bleue sur l'axe des ordonnées et le canal de fluorescence rouge sur l'axe des abscisses. Passer les deux canaux en mode linéaire et régler la tension du détecteur en conséquence afin que la population latérale se situe dans la partie inférieure gauche du graphique.

Ensuite, sélectionnez la population latérale. Puis arrêtez l'acquisition. Chargez ensuite les témoins d'inhibition et acquérez les données.

Enfin, créez un dot plot affichant la fluorescence rouge du colorant violet sur l'axe des abscisses et un canal de fluorescence approprié sur l'axe des ordonnées, représenté en mode logarithmique. Chargez l'échantillon, puis ajustez les tensions des détecteurs en conséquence et identifiez la fraction des cellules de la population latérale qui expriment la surface étudiée. Ensuite, enregistrez les données.

Des résultats représentatifs de l'analyse de la population latérale réalisée sur des cellules humaines de cancer de l'ovaire sont présentés ici. La population latérale, distinguée par l'analyse de l'émission bleue et rouge-violette, a été identifiée dans le quadrant inférieur gauche du diagramme de dispersion et représentait 0,70 % de l'ensemble de la population analysée. L'utilisation ultérieure d'inhibiteurs d'efflux a entraîné la disparition du signal de fluorescence observé pour les cellules précédemment identifiées, confirmant ainsi leur phénotype de population latérale.

Enfin, les cellules ovariennes humaines ont également été caractérisées en fonction de l'expression de ABCG2. Une coloration positive pour ABCG2 a été observée dans 0,67 % des cellules correspondant à la population latérale identifiée. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en environ deux à trois heures si elle est effectuée correctement.

Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de se rappeler que le phénotype de la population latérale dépend strictement d’un rapport optimal entre la concentration du colorant et la densité cellulaire. L’optimisation de ces deux variables est donc fortement recommandée avant l’expérience. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que le profilage de l’expression génique peuvent être réalisées afin de caractériser davantage les cellules de la population latérale et ainsi identifier de nouvelles cibles spécifiques aux cellules souches cancéreuses pour le développement futur de médicaments.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des cellules souches pour explorer les caractéristiques des cellules souches tissulaires et des cellules souches cancéreuses, tant chez la souris que chez l'homme. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer l'analyse de population latérale déclenchée par un colorant violet et de détecter les cellules souches cancéreuses présumées dans des échantillons biologiques dans votre propre laboratoire. N'oubliez pas que le travail avec des échantillons biologiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l'utilisation d'équipements de protection individuelle (EPI) et de hottes de sécurité biologique doivent être prises lors de l'exécution de cette procédure.