Tirer parti du phénotype de population latérale déclenchée par l'ADN pour détecter et purifier les cellules souches du cancer à partir d'échantillons biologiques

L’objectif global de cette procédure est de détecter les populations de cellules souches cancéreuses présumées dans des échantillons biologiques en fonction de la capacité d’extrusion de colorant des cellules de la population latérale. Cette méthode répond à une question clé de la recherche sur les cellules souches cancéreuses concernant les moyens fiables de détection et de purification des cellules souches cancéreuses à partir d’échantillons biologiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle déploie des marqueurs fonctionnels et donc une meilleure résolution.

De plus, l’expression de ces transporteurs de médicaments ABC est hautement conservée parmi les cellules souches cancéreuses et nous pouvons donc utiliser cette technique pour de nombreuses entités cancéreuses différentes. Les implications de cette technique s’étendent à la découverte de thérapies anticancéreuses à base de cellules souches, car elle facilite l’analyse en aval telle que le profilage de l’expression génique et la validation de cibles dans des cellules cancéreuses hautement purifiées. Cette méthode peut donc donner un aperçu des caractéristiques des cellules souches cancéreuses.

Nous pouvons également utiliser cette méthode pour caractériser en tant que systèmes comprenant des transporteurs de médicaments ABC exprimant des populations telles que la moelle osseuse. La démonstration de la procédure sera assurée par Elisabeth Hoflehner, une technicienne de mon laboratoire. Pour commencer, cultivez la lignée cellulaire cancéreuse humaine souhaitée à 37 degrés Celsius dans 10 à 30 millilitres de milieu RPMI 1640 complété par 10 % de FBS, deux millimètres de L-glutamine et des antibiotiques.

Lorsque les cellules atteignent environ 70 à 90 % de confluence, retirez le milieu et ajoutez deux millilitres de 0,05 % de trypsine-EDTA pour détacher les cellules de la surface de la boîte de culture. Ensuite, lavez les cellules avec 10 millilitres de milieu de culture, transférez la suspension dans un tube propre de 15 millilitres et faites-la tourner à 250 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Une fois les cellules granulées, jetez le suprénatant et remettez le granulé en suspension dans un millilitre de milieu de culture.

Mélangez une petite partie aliquote de la suspension cellulaire avec une solution de bleu de trypan et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Pour préparer les échantillons d’essai, suspendez les cellules dans un milieu de culture frais pour obtenir une suspension cellulaire d’une fois dix à six cellules par millilitre. Après avoir ajusté la densité de la cellule, transférez trois millilitres de l’échantillon dans un tube à fond rond de 15 millilitres étiqueté comme test.

Ensuite, ajoutez 10 micromolaires de colorant violet à l’échantillon et vortex doucement la suspension. Ensuite, préparez des contrôles d’inhibition en transférant 500 microlitres du colorant contenant une suspension cellulaire dans deux tubes de cytométrie en flux étiquetés comme témoin. Ajoutez 50 micromolaires de Verapamil à la première.

Et 20 micromolaires de Fumitremorgine C dans le deuxième tube. Et mélangez les solutions en pipetant doucement. Couvrez tous les tubes avec des bouchons et incubez-les à 37 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 90 minutes.

Agitez doucement les échantillons toutes les 15 minutes. Une fois la coloration terminée, lavez les contrôles d’inhibition dans trois à quatre millilitres de PBS glacé. Et préparez des aliquotes de l’échantillon de test pour une cocoloration ultérieure avec des anticorps.

Lavez également ces aliquotes et filtrez tous les échantillons à travers des crépines coupées de 70 microns pour éliminer les agrégats cellulaires potentiels. Ensuite, centrifugez les suspensions à 250 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir remis en suspension la pastille obtenue dans 100 microlitres de PBS, maintenez les cellules sur de la glace à l’abri de la lumière.

Ensuite, ajoutez un panel approprié d’anticorps conjugués au flurochrome aux cellules pré-colorées avec un colorant violet. Vortex les suspensions et incubez-les à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant 20 à 30 minutes. Après l’incubation, lavez les cellules dans trois à quatre millilitres de PBS glacé, filtrez l’échantillon si vous le souhaitez.

Et puis centrifuger à 250 fois G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules granulées dans 100 microlitres de PBS. Enfin, ajoutez du 7-AAD aux cellules pré-colorées avec un colorant violet.

Et incubez les échantillons pendant cinq à 10 minutes dans l’obscurité. Pour analyser les cellules à l’aide du cytomètre en flux, repérez une population cellulaire appropriée sur un graphique à points FSC SSC. Ensuite, à l’aide de différents signaux FSC, excluez de la population sélectionnée tous les agrégats de cellules.

Exclure les cellules révélant une coloration positive au 7-AAD pour obtenir la population de cellules viables. Pour créer un diagramme à points pour l’émission de colorants bleus et rouges, affichez le canal fluorescent bleu sur l’axe des y et le canal fluorescent rouge sur l’axe des x. Basculez les deux canaux en mode linéaire et ajustez la tension du détecteur en conséquence de sorte que la population latérale soit située dans la partie inférieure gauche du graphique.

Ensuite, limitez la population latérale. Et arrêter l’acquisition. Ensuite, chargez les commandes d’inhibition et acquérez les données.

Enfin, créez un diagramme à points affichant la fluorescence rouge du colorant violet sur l’axe des x et un canal de fluorescence approprié sur l’axe des y tracé en mode logarithmique. Chargez l’échantillon, puis ajustez les tensions du détecteur en conséquence et identifiez la faction des cellules de population latérales qui expriment la surface étudiée. Ensuite, enregistrez les données.

Voici les résultats représentatifs de l’analyse de la population latérale réalisée dans des cellules cancéreuses de l’ovaire humain. La population latérale distinguée par l’analyse de l’émission bleue et rouge-violet a été identifiée dans le quadrant inférieur gauche du graphique à points et constituait 0,70 % de l’ensemble de la population analysée. L’utilisation ultérieure d’inhibiteurs d’efflux a entraîné la disparition du signal de florescence observé pour les cellules précédemment identifiées, confirmant leur phénotype de population latérale.

Enfin, les cellules ovariennes humaines ont également été caractérisées en termes d’expression d’ABCG2. Une coloration positive à ABCG2 a été observée dans 0,67 % des cellules correspondant à la population latérale identifiée. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être effectuée en environ deux à trois heures si elle est effectuée correctement.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler que le phénotype de la population latérale dépend strictement d’un rapport optimal entre la concentration de colorant et la densité cellulaire. L’hydratation des deux variables est donc fortement recommandée avant l’expérience. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que le profilage de l’expression génique peuvent être effectuées afin de caractériser davantage les cellules de la population latérale et d’identifier de nouvelles cibles spécifiques aux cellules souches cancéreuses pour le développement futur de médicaments.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des cellules souches pour explorer les caractéristiques des cellules souches tissulaires et des cellules souches cancéreuses, tant chez la souris que chez l’homme. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une SA de population latérale déclenchée par un colorant violet et de la façon de détecter les cellules souches cancéreuses présumées dans des échantillons biologiques dans votre propre laboratoire. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons biologiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation d’EPI et d’enceintes de sécurité biologique doivent être prises lors de l’utilisation de cette procédure.