Name: Tirer parti du phénotype de population latérale déclenchée par lADN pour détecter et purifier les cellules souches du cancer à partir déchantillons biologiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Découvrez une méthode de cytométrie en flux pour détecter et isoler les cellules souches cancéreuses via le phénotype de population latérale. Cette technique fonctionnelle utilise un colorant violet et des inhibiteurs d'efflux pour une identification précise.

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Maximilian Boesch est soutenu par une bourse Erwin Schrödinger du FWF FTSA (numéro de délivrance J-3807).

Ce protocole est en pleine conformité avec les lignes directrices de la Commission d&#39;examen éthique institutionnel. Si les tissus humains ou animaux sont étudiés en utilisant le protocole décrit ici, les chercheurs sont obligés d&#39;obtenir l&#39;approbation du comité d&#39;examen pertinent de leur établissement ou de leur pays. Attention: Les précautions standard pour la manipulation sécuritaire des échantillons biologiques s&#39;appliquent à ce protocole. Cela comprend le port de gants et une blouse de laboratoire, et l&#39;exécution du travail dans un coffret de sécurité biologique dans la mesure du possible. 1. Préparation des cellules <ol><li> Lignes cellulaires cancéreuses <ol><li> Culturez une lignée cellulaire cancéreuse humaine ou murine respective à 37 ° C dans 10 à 30 ml de milieu approprié ( p. Ex. , RPMI 1640 additionné de 10% ( v / v ) de FBS, 2 mM de L-glutamine et 1x pénicilline / streptomycine) et de récolte Les cellules à la sous-confluence ( c.-à-d. 70-90%) en utilisant une digestion avec 0,05% de trypsine-EDTA ou un autre de-attProcédure d&#39;entraide. Déterminer le nombre de cellules et vérifier la viabilité en utilisant une chambre de comptage et une coloration au bleu trypan. La fraction de cellules viables devrait dépasser 85%. NOTE: Des exemples de lignées cellulaires cancéreuses humaines hébergeant des compartiments SP incluent MCF7 / HTB-22 et SKBR3 / HTB-30 (cancer du sein), A2780 et SKOV-3 / HTB-77 (cancer des ovaires) et A549 (cancer du poumon) 26 . </li></ol></li><li> Tumeur tumorale ex vivo <ol><li> Prenez un nouvel échantillon de tumeur chirurgicale ou, en variante, récoltez un tissu tumoral à partir d&#39;un modèle de tumeur de souris transplantable ou génétiquement modifiée. Prendre 200-1 000 mg de tissu et générer une seule suspension de cellules par désagrégation mécanique ( p. Ex. , En utilisant des ciseaux ou un scalpel) et une digestion enzymatique ( par exemple , en utilisant un cocktail de collagénase / dispase / DNase). </li><li> Filtrer l&#39;échantillon à travers un filtre de coupe de 70 μm. Déterminer le nombre de cellules et vérifier la viabilité en utilisant une chambre de comptage et trypan blUe coloration. NOTE: Les cocktails de digestion contiennent fréquemment 200 μg / mL de colagénase P, 0,8 U / mL de dispase et 25 μg / mL de DNase I, et les temps d&#39;incubation varient habituellement de 20 à 50 min. Idéalement, la désagrégation des tissus est réalisée selon un protocole optimisé pour le tissu sous enquête 27 , 28 , 29 . </li></ol></li></ol> 2. Échantillons de test <ol><li> Ajuster la concentration cellulaire à 1 x 10 6 cellules / mL dans un milieu de culture frais (un véhicule contenant des nutriments est important car l&#39;extrusion de colorant est un processus actif consommant de l&#39;énergie). Enfin, transférez 1 mL d&#39;échantillon dans un tube à fond rond de cytométrie à flux ordinaire / FACS (étiqueté «test»). REMARQUE: Pour des résultats optimaux, il peut être nécessaire que la concentration cellulaire soit titrée (par exemple, 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2,5 x 10 6 cellules / mL), mais une concentration cellulaire inférieureCède une résolution plus élevée 19 . Seulement pour le tri des applications où un nombre maximum de cellules SP doit être récupéré, il est recommandé d&#39;augmenter la concentration de cellules jusqu&#39;à 1 x 10 7 cellules / mL. </li><li> Ajouter 10 μM de DCV à l&#39;échantillon et bien mélanger, soit par vortex ou rembourrage doux pendant 3-5x. Procéder aux contrôles d&#39;inhibition. NOTE: Les résultats optimaux peuvent dépendre du titrage du colorant déclencheur (par exemple 2.5; 5; 10; 20 μM), mais une concentration de colorant plus élevée donne généralement une résolution plus élevée 19 . </li></ol> 3. Contrôle de l&#39;inhibition <ol><li> Transférer 250 μL de la suspension de cellules contenant du colorant vers une nouvelle cytométrie de flux / tube à fond rond FACS (appelé «contrôle»). Ajouter 50 μM de verapamil ou 20 μM de FTC et bien mélanger par pipettage. REMARQUE: le Verapamil et le FTC sont les inhibiteurs les mieux établis pour l&#39;analyse SP mais ont une spécificité de pompe à effluent différenteY: le Verapamil inhibe plusieurs transporteurs de médicaments ABC dont ABCB1 et ABCB5, alors que le FTC est spécifique à ABCG2 6 , 19 . Si l&#39;état SP d&#39;un échantillon individuel est inconnu, il est donc recommandé d&#39;utiliser à la fois le verapamil et le FTC dans des tubes séparés. </li></ol> 4. Coloration <ol><li> Capuchons les tubes &quot;test&quot; et &quot;contrôle&quot; et les incuber à 37 ° C dans l&#39;obscurité pendant 90 min, avec une agitation douce toutes les 15 min. La majeure partie de l&#39;extrusion de colorant dans les cellules SP se produira dans les premières 45 minutes, mais l&#39;accumulation de colorant dans les cellules non SP (contribuant à la résolution) n&#39;est que maximale après 75-90 min 19 . </li><li> Une fois la coloration terminée, laver les cellules dans 3-4 mL de PBS glacé et ré-endiguer la pastille dans un volume de 100 μL (PBS). Gardez les cellules dans l&#39;obscurité et refroidissez sur de la glace, et procéder à la coloration des marqueurs supplémentaires. Alternativement, effectuez directement des analyses cytténiques de fluxLyse. </li></ol> 5. Coûts pour d&#39;autres marqueurs <ol><li> Ajouter un panel désiré d&#39;anticorps conjugués au fluorochrome aux cellules colorées au DCV, bien mélanger et incuber les cellules à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant 20 à 30 minutes. Lavez les cellules dans 3 à 4 ml de PBS glacé et passez à la discrimination des cellules mortes. REMARQUE: les formats d&#39;anticorps qui sont facilement compatibles avec DCV et pratiquement ne nécessitent pas de compensation incluent PerCP ou PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 et BV786 . Les formats compatibles avec DCV mais nécessitant une compensation incluent FITC, Alexa Fluor 488, PE et BV650. Les formats qui ne sont pratiquement pas compatibles avec DCV incluent BV421, V450 et V500. </li><li> Ajouter 7-AAD (ou PI) aux cellules colorées au DCV à la concentration recommandée par le fabricant en particulier et incuber les échantillons pendant 5 à 10 minutes dans l&#39;obscurité. Filtrer les échantillons à travers des filtres de coupure de 70 μm et procéder à une analyse cytométrique en flux.</li></ol> 6. Analyse cytométrique de flux REMARQUE: Il est recommandé d&#39;allumer l&#39;instrument de cytométrie de flux respectif pendant le processus de coloration déjà afin que tout soit réglé dès que les échantillons sont prêts. Cela inclut également les procédures de maintenance standard telles que le suivi des performances du système et le remplissage des citernes. <ol><li> Acquérir les cellules sur le cytomètre de flux et les placer sur un diagramme de points FSC / SSC bivarié (Figure 1B). Excluez les doublets et les agrégats en comparant les différents signaux de FSC ( c.-à-d. Hauteur, largeur, zone) (figure 1C). <ol><li> Si un marqueur de cellule morte a été inclus, portez sur la fraction de cellule viable ( par exemple , 7-AAD-négatif) ( Figure 1D ). Visualisez les cellules singulet viables sur un diagramme de points bivarié pour les émissions de DCV «bleu» et «rouge». À cette fin, affichez le canal de fluorescence &quot;bleu&quot; sur l&#39;axe des y ( par exemple , 450/50) et le &#39;Canal de fluorescence rouge &#39;sur l&#39;axe des abscisses ( p . Ex. 525/50). </li><li> Commutez les deux canaux en mode linéaire et ajustez les tensions du détecteur de manière correspondante afin que le SP se situe sur le côté de l&#39;intrigue dans le quadrant inférieur gauche. À l&#39;inverse, le non-SP localise le quadrant supérieur droit de la parcelle reflétant la distribution du cycle cellulaire (G1 et G2). Garez le SP et arrêtez l&#39;acquisition ( Figure 1E ). REMARQUE: les cellules SP définies par DCV peuvent être détectées à l&#39;aide d&#39;instruments cytométriques en flux équipés d&#39;une source d&#39;excitation laser violette ( c&#39;est-à-dire d&#39; une ligne laser 405 nm). Il s&#39;agit d&#39;une analyse spécifique de SP que la fluorescence émise est mesurée en mode linéaire et dans deux canaux séparés affichés sur un diagramme de points bivarié. L&#39;émission &quot;bleu&quot; de DCV est mesurée à environ 450 nm ( par exemple , avec un filtre standard 450/40) et l&#39;émission &quot;rouge&quot; de DCV est mesurée à environ 510-555 nm ( par exemple , avec un 510/50, a 525/50 ou un filtre 585/15) 19 . En raison de la chimie particulière du dosage, la séparation entre les cellules SP et non SP est généralement plus élevée dans le canal de fluorescence &quot;rouge&quot; 19 . </li></ol></li><li> Chargez le (s) contrôle (s) d&#39;inhibition et obtenez les données. Les cellules SP ont maintenant disparu ou sont considérablement réduites ( figure 1F ). Si nécessaire, affiner la porte SP en fonction de ces données. </li><li> Pour étudier l&#39;expression du marqueur de surface par les cellules SP, laisser la fluorescence &quot;rouge&quot; de DCV sur l&#39;axe des abscisses et afficher un canal de fluorescence respectif sur l&#39;axe des y en mode logarithmique ( p. Ex . APC). Régler les tensions du détecteur de manière correspondante et laisser tomber la fraction de cellules SP positif pour le (s) marqueur (s) étudié (s) ( Figure 1G ). La co-expression d&#39;un marqueur particulier par des cellules SP donne un signal respectif dans le quadrant supérieur gauche de l&#39;intrigue 30 . </li><li> Enregistrez leDes données et / ou trier les cellules SP. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt à déclarer. Il n&#39;y a pas non plus d&#39;implication non-auteur dans la préparation du manuscrit.

Les progrès dans la gestion clinique du cancer dépendent également du développement de modalités de traitement ciblant les CSC. Les méthodes permettant l&#39;isolement fiable des CSC à partir d&#39;échantillons biologiques accéléreront l&#39;identification des cibles appropriées et sont donc d&#39;une importance cruciale dans cette entreprise. L&#39;analyse SP est une technique établie et précieuse pour identifier les populations du SCC qui expriment les transporteurs de médicaments ABC et la mise en œuvre de DCV a éten...

L&#39;efficacité des thérapies primaires contre le cancer s&#39;est considérablement améliorée au cours de la dernière décennie en raison de progrès convaincants dans la compréhension génétique et moléculaire de la maladie et l&#39;avènement de médicaments ciblés tels que les anticorps thérapeutiques et les inhibiteurs de petites molécules. En revanche, la maladie métastatique et récurrente est encore généralement incurable et la morbidité et la mortalité restent élevées dans ces milieux cliniques. Les CSC représentent une sous-population distincte dans les tumeurs et sont dotés de propriétés canoniques de cellules souches telles que la clonogénicité / tumorigénicité, la résistance aux médicaments multiples et la division cellulaire asymétrique 1 , 2 . Ainsi, les CSC non seulement entraînent une progression métastatique et une hétérogénéité des tumeurs, mais persistent également pendant le traitement pour prédisposer le patient à la rechute. L&#39;élimination thérapeutique du SCC est donc un besoin médical important pour prévenir la récidive de la maladie et permettre un traitement à long terme du cancer 3 </suP&gt;. L&#39;identification des vulnérabilités et l&#39;élucidation des stratégies pour éradiquer les CSC dépend fortement des méthodes qui permettent leur purification à partir d&#39;échantillons biologiques pour le profilage d&#39;expression et / ou l&#39;investigation fonctionnelle subséquente. À leur tour, de telles méthodes reposent sur des marqueurs de surface, intracellulaires ou fonctionnels spécifiques à ces cellules. Les marqueurs de surface spécifiques au CSC incluent, mais sans s&#39;y limiter, CD44, CD133, CD24 et CD90, et ont été utilisés pour identifier les populations de CSC dans une variété d&#39;entités tumorales, y compris le cancer du sein et le cancer du côlon 4 . Un autre marqueur, l&#39;aldéhyde déshydrogénase (ALDH), montre une localisation intracellulaire et peut être détecté fonctionnellement en fournissant un substrat respectif dont la conversion enzymatique produit de la lumière. En utilisant ce test, les populations du SCC ont également été identifiées dans diverses entités tumorales 5 . Une méthode complémentaire, communément appelée analyse SP et représentée ici en m<html> Détail éthodologique, exploite l&#39;efflux de colorant actif par les transporteurs de médicaments ABC pour identifier de petites populations de cellules fluorescentes de type tige faible 6 , 7 , 8 . Pour ce faire, un échantillon donné est incubé en présence d&#39;un fluorophore lipophile qui lient de l&#39;ADN qui pénètre dans toutes les cellules par diffusion passive et cible l&#39;ADN nucléaire et mitochondrial pour la liaison. Les CSC non-dépourvus d&#39;expression du transporteur de drogue ABC accumulent le colorant, ce qui entraîne une fluorescence brillante, tandis que les CSC extrudent activement le colorant qui réduit la fluorescence. L&#39;inhibition pharmacologique de l&#39;activité du transporteur de médicament abroge et confirme fonctionnellement le phénotype SP et doit être utilisée à des fins de contrôle. Les populations du CSC présentant des caractéristiques SP ont été révélées, entre autres, dans le cancer de l&#39;ovaire 9 , 10 , le cancer de la prostate 11 ,&gt; 12, cancer du sein 13 , cancer du poumon 14 , cancer de l&#39;endomètre 15 , gliome 16 , 17 et sarcome de l&#39;os 18 . Il est important de noter que le dosage SP est compatible avec les lignées cellulaires cancéreuses et les tissus tumoraux primaires, même si le matériau primaire pose des défis supplémentaires tels que l&#39;exigence d&#39;une stratégie spécifique de discrimination de cellules tumorales (certaines populations de cellules hôtes peuvent également présenter des caractéristiques de SP) 19 , 20 . Les deux transporteurs de médicaments les plus reconnus sont les ABCB1 / P-glycoprotein / MDR1 / CD243 et ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Cependant, d&#39;autres transporteurs de médicaments peuvent également être un déterminant moléculaire du phénotype SP ( p. Ex . ABCB5) 22 . ABCB1Peut être bloqué efficacement avec le verapamil, alors que l&#39;activité de l&#39;ABCG2 peut être abrogée spécifiquement avec la fumétémorgin C (FTC) 6 , 19 . Une force particulière de l&#39;analyse SP est qu&#39;elle peut être combinée avec d&#39;autres taches ( p. Ex. , Marqueurs de surface et ALDH) et qu&#39;elle permet une récupération de cellules vivantes ainsi compatible avec les recherches fonctionnelles en aval. De plus, la détection de SP est largement applicable en raison de la grande conservation des transporteurs de médicaments ABC parmi les populations du SCC 9,23. À l&#39;origine, la détection de SP a été effectuée en utilisant le Hoechst 33342 comme colorant de déclenchement 24 . Ce colorant atteint une excellente résolution mais nécessite une excitation laser ultraviolet; De sorte que son applicabilité est naturellement limitée aux instruments cytométriques de flux haut de gamme. L&#39;avènement de DyeCycle Violet (DCV) 25 a ouvert une nouvelle avenueEs pour l&#39;analyse SP et a étendu l&#39;applicabilité de cette méthode aux instruments cytométriques à flux standard dépourvus d&#39;une source laser ultraviolette (une source laser violette suffit pour résoudre les cellules DCV-SP). Fait important, Hoechst 33342 et DCV partagent des spécificités communes de la pompe, indiquant que l&#39;un ou l&#39;autre colorant devrait identifier les mêmes populations de cellules. Ici, nous fournissons un protocole expérimental détaillé de l&#39;analyse SP à base de DCV pour une reproduction rapide et facile dans les laboratoires indépendants. Nous percevons donc notre article comme une ressource pour les chercheurs du SCC qui devrait contribuer à l&#39;optimisation et à la normalisation de cette méthode biologique cellulaire utile.

<table><tbody><tr><td>Vybrant DyeCycle Violet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>V35003</td><td>Prêt à l’emploi</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de vérapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td>Dissous dans l’éthanol</td></tr><tr><td>Fumitremorgine C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9054</td><td>Dissous dans le DMSO</td></tr><tr><td>7-AAD (ou iodure de propidium - PI)</td><td>BioLegend</td><td>420403</td><td>Prêt à l’emploi</td></tr><tr><td>Réactifs de culture cellulaire standard ( par exemple , milieu, FBS, L-glutamine, antibiotiques, PBS, trypsine-EDTA, etc.)Différents</td> <td>fournisseurs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Échantillon/cellules d’intérêt (par exemple , lignée cellulaire cancéreuse humaine ou murine, tissu tumoral humain ou murin)Différents</td> <td>fournisseurs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrument de cytométrie en flux (FACS ; analyseur ou trieur de cellules)</td><td>Différents fournisseurs</td><td></td><td>Source laser violette requise</td></tr><tr><td>Tubes FACS (à fond rond)</td><td>Différents fournisseurs</td><td></td><td>Tubes avec capuchon recommandés</td></tr><tr><td>70 & micro ; Filtres de coupure</td><td>Fournisseurs différents Facultatif</td><td></td><td>mais recommandé</td></tr><tr><td>Mélange d’enzymes de digestion ( par exemple , collagénase/dispase/Dnase)</td><td>Différents fournisseurs</td><td></td><td>Uniquement pertinent pour la dissociation tissulaire</td></tr><tr><td>Anticorps conjugués au flurochrome contre les marqueurs de surface d’intérêt</td><td>Différents fournisseurs</td><td></td> Kit <td></td></tr><tr><td>ALDEFLUOR</td> en option <td>Technologies STEMCELL</td><td>01700</td><td>En option</td></tr></tbody></table>

tirer parti du phénotype de population latérale déclenchée par l&#39;adn pour détecter et purifier les cellules souches du cancer à partir d&#39;échantillons biologiques

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Le cancer est une maladie à base de cellules souches et l&#39;éradication de ces cellules est devenue un objectif thérapeutique majeur. La déchiffrement des vulnérabilités des cellules souches cancéreuses (CSC) et l&#39;identification de cibles moléculaires appropriées reposent sur des méthodes permettant leur discrimination spécifique dans des échantillons hétérogènes tels que les lignées cellulaires et le tissu tumoral ex vivo . La cytométrie de flux / FACS est une technologie puissante pour disséquer de manière paramétrique des échantillons biologiques au niveau de la cellule unique et date de la méthode de choix pour récupérer les cellules vivantes pour les analyses en aval. Les marqueurs de surface tels que CD44 et CD133 ainsi que la détection de l&#39;activité enzymatique de l&#39;aldéhyde déshydrogénase ont souvent été utilisés pour définir et trier les CSC à partir d&#39;échantillons de tumeurs par FACS. Une approche complémentaire, illustrée ici en détail méthodologique, utilise l&#39;extrusion fonctionnelle de colorant par les transporteurs de médicaments ABC, qui identifie une population distincte de cellules fluorescentes-dim communément appelées population latérale (SP). SP; Les cellules cancéreuses présentent des caractéristiques canoniques de cellules souches et peuvent être abrogées et confirmées fonctionnellement en utilisant des agents qui inhibent le transporteur de médicament extrudant de colorant (le plus souvent ABCB1 / P-glycoprotein / MDR1 / CD243 et ABCG2 / Bcrp1 / CD338). En outre, le test SP est compatible avec d&#39;autres évaluations cytométriques en flux telles que la coloration des antigènes de surface, la détection des aldéhydes déshydrogénases et la discrimination des cellules mortes ( p. Ex . Avec 7-AAD ou iodure de propidium (PI)). Ainsi, nous décrivons une méthode valable et largement applicable pour l&#39;identification, l&#39;isolement et la sous-caractérisation CSC mécaniquement basée sur un paramètre fonctionnel, plutôt que phénotypique. Bien que, initialement, exécuté avec Hoechst 33342 en tant que colorant déclencheur, nous nous concentrons ici sur le phénotype SP Violet à base de colorant plus récent qui résolue sur tout cytomètre de flux équipé d&#39;une source laser violette.

L&#39;invention concerne une analyse SP représentative des cellules A2780, une lignée cellulaire de cancer de l&#39;ovaire humaine précédemment présentée pour abriter un SP représentant moins de 1% des cellules 9 . Les cellules ont été cultivées à 37 ° C dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10% ( v / v ) de FBS, 2 mM de L-glutamine et 1x pénicilline / streptomycine et récolté à 85% de confluence en utilisant un traitement avec 0,05% de trypsine-EDTA. Les ce...

Les méthodes permettant la caractérisation et l&#39;isolement des populations de cellules souches à partir d&#39;échantillons biologiques sont essentielles pour l&#39;avancement des traitements ciblés par les cellules souches dans le cancer et au-delà. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l&#39;isolement des cellules souches du cancer en utilisant le phénotype de la population latérale déclenchée par le colorant.

Tirer parti du phénotype de population latérale déclenchée par l&#39;ADN pour détecter et purifier les cellules souches du cancer à partir d&#39;échantillons biologiques

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

L'objectif général de cette procédure est de détecter des populations cellulaires de cellules souches cancéreuses présumées dans des échantillons biologiques, en se basant sur la capacité d'expulsion de colorant des cellules de la population latérale. Cette méthode répond à une question essentielle dans la recherche sur les cellules souches cancéreuses, à savoir la mise au point de moyens fiables pour la détection et la purification des cellules souches cancéreuses à partir d'échantillons biologiques. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation de marqueurs fonctionnels, offrant ainsi une meilleure résolution.En outre, l'expression de ces transporteurs ABC de médicaments est fortement conservée parmi les cellules souches cancéreuses, et nous pouvons donc utiliser cette technique pour de nombreuses entités cancéreuses différentes. Les implications de cette technique s'étendent à la découverte de thérapeutiques ciblant les cellules souches cancéreuses, car elle facilite des analyses en aval telles que le profilage de l'expression génique et la validation de cibles dans des cellules cancéreuses hautement purifiées. Cette méthode peut donc fournir des informations sur les caractéristiques des cellules souches cancéreuses.Nous pouvons également utiliser cette méthode pour caractériser des systèmes composés de populations exprimant des transporteurs de médicaments ABC, comme la moelle osseuse. La procédure sera démontrée par Elisabeth Hoflehner, technicienne de mon laboratoire. Pour commencer, cultivez la lignée cellulaire cancéreuse humaine souhaitée à 37 degrés Celsius dans 10 à 30 millilitres de milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10 % de FBS, 2 millimètres de L-glutamine et des antibiotiques.Lorsque les cellules atteignent une confluence d'environ 70 à 90 %, retirez le milieu et ajoutez deux millilitres de trypsine-EDTA à 0,05 % pour détacher les cellules de la surface de la boîte de culture. Ensuite, lavez les cellules avec 10 millilitres de milieu de culture, transférez la suspension dans un tube propre de 15 millilitres et centrifugez à 250 ×g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Une fois les cellules en pellet, jetez le surnageant et resuspendez le culot dans un millilitre de milieu de culture.Mélangez un petit aliquot de la suspension cellulaire avec une solution de bleu de trypan et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Pour préparer les échantillons de test, suspendez les cellules dans un milieu de culture frais afin d’obtenir une suspension cellulaire contenant un fois dix puissance six cellules par millilitre. Après avoir ajusté la densité cellulaire, transférez trois millilitres de l’échantillon dans un tube conique de 15 millilitres étiqueté comme étant le tube de test.Ensuite, ajouter 10 micromolaire de colorant violet à l'échantillon et mélanger doucement la suspension par vortex. Préparer ensuite les témoins d'inhibition en transférant 500 microlitres de la suspension cellulaire contenant le colorant dans deux tubes de cytométrie en flux étiquetés comme témoins. Ajouter 50 micromolaire de vérapamil au premier.Et 20 micromolaire de Fumitremorgin C dans le deuxième tube. Mélanger les solutions en pipetant doucement. Boucher tous les tubes et les incuber à 37 degrés Celsius à l’obscurité pendant 90 minutes.Agiter doucement les échantillons toutes les 15 minutes. Une fois la coloration terminée, laver les contrôles d'inhibition avec trois à quatre millilitres de PBS glacé. Préparer des aliquotes de l'échantillon test pour une coloration double ultérieure avec des anticorps.Effectuez également le lavage de ces aliquotes et filtrez tous les échantillons à l’aide de tamis de 70 microns pour éliminer les agrégats cellulaires éventuels. Ensuite, centrifugez les suspensions à 250 × g à 4 °C pendant cinq minutes. Après avoir resuspendu le culot obtenu dans 100 µL de PBS, maintenez les cellules sur glace, à l’abri de la lumière.Ensuite, ajoutez un panel approprié d'anticorps conjugués à des fluorochromes sur les cellules préalablement colorées avec le colorant violet. Vortexez les suspensions et incubez-les à quatre degrés Celsius, à l'abri de la lumière, pendant 20 à 30 minutes. Après l'incubation, lavez les cellules avec trois à quatre millilitres de PBS glacé, filtrez l'échantillon si désiré.Ensuite, centrifuger à 250 × g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Éliminer le surnageant et resuspendre les cellules en culot dans 100 microlitres de PBS. Enfin, ajouter le 7-AAD aux cellules préalablement marquées avec le colorant violet.Et incuber les échantillons pendant cinq à 10 minutes à l'abri de la lumière. Pour analyser les cellules à l'aide du cytomètre en flux, sélectionner une population cellulaire appropriée sur un dot plot FSC SSC. Ensuite, à l'aide de différents signaux FSC, exclure de la population sélectionnée tous les agrégats cellulaires.Exclure les cellules présentant une coloration positive au 7-AAD afin d'obtenir la population de cellules viables. Pour créer un diagramme de dispersion pour les émissions des colorants bleu et rouge, afficher le canal de fluorescence bleue sur l'axe des ordonnées et le canal de fluorescence rouge sur l'axe des abscisses. Passer les deux canaux en mode linéaire et régler la tension du détecteur en conséquence afin que la population latérale se situe dans la partie inférieure gauche du graphique.Ensuite, sélectionnez la population latérale. Puis arrêtez l'acquisition. Chargez ensuite les témoins d'inhibition et acquérez les données.Enfin, créez un dot plot affichant la fluorescence rouge du colorant violet sur l'axe des abscisses et un canal de fluorescence approprié sur l'axe des ordonnées, représenté en mode logarithmique. Chargez l'échantillon, puis ajustez les tensions des détecteurs en conséquence et identifiez la fraction des cellules de la population latérale qui expriment la surface étudiée. Ensuite, enregistrez les données.Des résultats représentatifs de l'analyse de la population latérale réalisée sur des cellules humaines de cancer de l'ovaire sont présentés ici. La population latérale, distinguée par l'analyse de l'émission bleue et rouge-violette, a été identifiée dans le quadrant inférieur gauche du diagramme de dispersion et représentait 0,70 % de l'ensemble de la population analysée. L'utilisation ultérieure d'inhibiteurs d'efflux a entraîné la disparition du signal de fluorescence observé pour les cellules précédemment identifiées, confirmant ainsi leur phénotype de population latérale.Enfin, les cellules ovariennes humaines ont également été caractérisées en fonction de l'expression de ABCG2. Une coloration positive pour ABCG2 a été observée dans 0,67 % des cellules correspondant à la population latérale identifiée. Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en environ deux à trois heures si elle est effectuée correctement.Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de se rappeler que le phénotype de la population latérale dépend strictement d’un rapport optimal entre la concentration du colorant et la densité cellulaire. L’optimisation de ces deux variables est donc fortement recommandée avant l’expérience. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que le profilage de l’expression génique peuvent être réalisées afin de caractériser davantage les cellules de la population latérale et ainsi identifier de nouvelles cibles spécifiques aux cellules souches cancéreuses pour le développement futur de médicaments.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des cellules souches pour explorer les caractéristiques des cellules souches tissulaires et des cellules souches cancéreuses, tant chez la souris que chez l'homme. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer l'analyse de population latérale déclenchée par un colorant violet et de détecter les cellules souches cancéreuses présumées dans des échantillons biologiques dans votre propre laboratoire. N'oubliez pas que le travail avec des échantillons biologiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l'utilisation d'équipements de protection individuelle (EPI) et de hottes de sécurité biologique doivent être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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