Name: Évaluation du flux autophagique en mesurant LC3, p62 et LAMP1 Co-localisation à laide de la cytométrie de flux dimagerie multispectrale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Découvrez une méthode quantitative pour mesurer le flux autophagique par cytométrie de flux d'imagerie multispectrale. Cette technique permet d'analyser simultanément la colocalisation de LC3, p62 et LAMP1 dans les cellules Jurkat avec une rigueur statistique objective.

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J&#39;aimerais remercier mes collègues de MilliporeSigma, Philip J. Morrissey et Sherree L. Friend, pour leur soutien et leur orientation au cours des années. Je voudrais également remercier Vidya Venkatachalam et Bryan R. Davidson pour leur aide avec la fonctionnalité BDC3 dans le logiciel IDEAS , Ryan P. Jessup pour l&#39;aide pour l&#39;édition de ce manuscrit, Raymond Kong pour l&#39;aide le jour du tournage et un merci spécial Au maquilleur Cynthia Xamonthiene.

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<li>Phadwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+autophagy+detection+in+primary+cells%3A+Impaired+levels+of+macroautophagy+in+immunosenescent+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells.</a> Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).</li>
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Je suis employé par MilliporeSigma, le fabricant de la marque Amnis ImageStream, qui a été utilisé dans cette étude.

Lorsque vous effectuez cette analyse, il y a quelques points à considérer. Il est important d&#39;avoir des échantillons de contrôle appropriés. Pour cette expérience, deux contrôles différents ont été utilisés: Control and Control + Chloroquine. L&#39;échantillon de contrôle a été utilisé pour définir le seuil pour les régions. Il représente le niveau basal de l&#39;autophagie sans arrêter la dégradation lysosomale et est le contrôle de l&#39;échantillon mort. Cependant, l&#39;échantillon de contrôle n&#39;est pas un contrôle approprié pour comparer avec les résultats de l&#39;échantillon Starved + Chloroquine car la chloroquine influe lui-même sur l&#39;échantillon témoin. Par conséquent, il fallait avoir un échantillon Control + Chloroquine. Avant d&#39;effectuer toute analyse pour l&#39;autophagie, il est important d&#39;analyser uniquement les cellules individuelles qui sont concentrées ( c&#39;est-à-dire un gradient RMS supérieur à 60), car les résultats pourraient être affectés s&#39;il y a plus d&#39;une cellule ou que les images sont flou. Il est crucial que l&#39;autophagosomEs et les lysosomes sont concentrés pour un comptage local correct et une analyse BDC3. Les cellules apoptotiques doivent être enlevées avant l&#39;analyse autophagique, car elles peuvent fausser les résultats et ne doivent pas être incluses. Il devrait y avoir une coloration appropriée pour les trois marqueurs ( c.-à-d., LC3, p62 et LAMP1). Par exemple, les trois marqueurs sont intracellulaires et devraient avoir un signal ponctuel; Si le signal n&#39;est pas ponctuel, ou s&#39;il se trouve à la surface de la cellule, la coloration ne convient pas et l&#39;expérience / la coloration doit être refaite. En outre, pour BDC3 pour être précis, il est essentiel de passer des cellules brillantes pour les trois marqueurs fluorescents d&#39;intérêt. L&#39;activation des événements positifs est nécessaire pour empêcher la mesure de BDC3 sur les liaisons non spécifiques, les artefacts d&#39;image et / ou le bruit. Ceci est crucial, car BDC3 peut potentiellement amplifier des artefacts qui ne sont pas des signaux vrais. Étant donné que BDC3 ne peut être effectué que sur des événements lumineux positifs, de nombreuses cellules peuvent ne pas être incluses dans l&#39;analyse finale; Ceci est especPour les cellules témoins qui n&#39;ont pas d&#39;accumulation de LC3, p62 et / ou LAMP1. Ainsi, une limitation de ce dosage est que BDC3 examine uniquement les cellules positives pour les trois marqueurs, ce qui pourrait ne pas convenir à toutes les expériences d&#39;autophagie. Comme BDS, qui a été précédemment rapporté 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 seul ne tient pas compte du nombre d&#39;organelles autophagiques qui co-localisent, ce qui entraîne un degré élevé De la variabilité du nombre d&#39;autophagosomes. Par conséquent, l&#39;approche bivariée présentée par Rajan et al. était employé. En regardant les parcelles bivariées, on pourrait se demander siLes cellules doivent être positives pour LC3, p62 et LAMP1; Pourquoi y a-t-il tant de cellules qui ont 0 points? Ceci est dû au fait que le signal LC3 pourrait être assez lumineux pour la co-localisation, mais il pourrait ne pas respecter le seuil défini par le masque de crête (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) nécessaire pour être considéré comme un place. Le protocole présenté ici a utilisé MIFC pour compter LC3 puncta et la co-localisation de trois marqueurs autophagiques pour mesurer le flux autophagique. Dans les conditions basales (échantillon témoin), le nombre d&#39;autophagosomes était faible et peu de cellules ont été trouvées avec des &quot;points élevés&quot;. Avec l&#39;addition de la chloroquine, qui inhibe la fusion autophagosomère / lysosome, il y a eu une augmentation du nombre de points LC3. Puisque le lysosome est incapable de décomposer l&#39;autophagosome et le p62, qui réside dans l&#39;autophagone, cela entraîne une augmentation de la co-localisation de l&#39;accumulation d&#39;autolysosomes LC3, P62 et LAMP1. Cet effet a été amplifié sous l&#39;effet de l&#39;étoile en éléments nutritifsIon, ce qui induit l&#39;autophagie. Cependant, sans l&#39;ajout de chloroquine, il n&#39;y a pas eu d&#39;augmentation significative du nombre d&#39;autophagosomes, probablement en raison d&#39;une augmentation du taux de renouvellement autophagique. Lorsque les cellules ont été affamées en présence de chloroquine, il y a eu une augmentation de la localisation et du nombre d&#39;autophagosomes, ce qui permet de conclure que la famine augmente le flux autophagique. EBSS est connu pour être un inducteur puissant d&#39;autophagie. Par conséquent, on s&#39;attend à ce que l&#39;augmentation soit importante. Si une autre méthode, telle que l&#39;induction du médicament, est utilisée pour induire une autophagie, la différence entre le contrôle et les échantillons traités peut être plus subtile. Ce protocole particulier a été conçu pour mesurer l&#39;autophagie dans les lignées cellulaires humaines, mais le dosage pourrait être adapté à d&#39;autres espèces en passant à des anticorps pour cette espèce particulière. De plus, la méthode d&#39;analyse pourrait être utilisée pour toute application intracellulaire nécessitant une co-localisationDe trois sondes / marqueurs.

La macroatophagie, appelée ci-après autophagie, est une voie catabolique dans laquelle des composants endommagés ou dysfonctionnels, des protéines à longue durée de vie et des organites sont dégradés via le lysosome et sont recyclés 1 . Autophagy est un processus dynamique et à plusieurs étapes impliquant la formation d&#39;un autophagosome; La fusion de l&#39;autophagone avec le lysosome, formant l&#39;autolysosome; Et la dégradation du contenu de l&#39;autolysosome 2 . Le marqueur biologique crucial utilisé pour identifier l&#39;autophagie dans les systèmes de mammifères est la protéine 1A / 1B-chaîne légère 3 (LC3) associée aux microtubules, qui constitue la membrane autophagosomale. Au cours de l&#39;autophagie, le LC3-1 cytosolique est conjugué à la phosphatidyléthanolamine pour former LC3-II; LC3-II est ensuite incorporé dans la membrane autophagosomale 3 . Un autre marqueur largement utilisé pour le flux autophagique est le récepteur d&#39;autophagie séquestresome 1 (SQSTM1, p62) qui physiquement liNk freins autophagiques à la membrane autophagique 4 , 5 . Les méthodes traditionnellement utilisées pour mesurer l&#39;autophagie sont Western Blots et microscopie à fluorescence 7 . Cependant, aucune de ces méthodes n&#39;est considérée comme la «norme-or», 2 , 6 car il existe des défis associés à ces deux techniques. Les transferts de Western ne donnent qu&#39;une moyenne parce qu&#39;ils utilisent un échantillon homogénat, de sorte que les observateurs ne peuvent pas voir ce qui se passe dans les cellules individuelles. D&#39;autre part, la microscopie à fluorescence donne une information d&#39;observateur au niveau d&#39;une seule cellule, mais elle manque de capacités de débit, ce qui rend difficile l&#39;obtention d&#39;évaluations objectives et statistiquement rigoureuses. Au cours des dernières années, la mesure de LC3 et p62 par cytométrie de flux d&#39;imagerie multispectrale (MIFC, voir la Table des matériaux ) a été en train de gagner en popuEn raison de son pouvoir quantitatif, de ses capacités élevées, de son potentiel de multiplexage et de sa capacité à imaginer chaque cellule. L&#39;une des méthodes les plus utilisées pour mesurer l&#39;autophagie à l&#39;aide de MIFC, ainsi que son logiciel d&#39;analyse complémentaire (voir la Table des matières ), est le comptage ponctuel de LC3 puncta ou autophagosomes 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Cependant, une augmentation des autophagosomes ne signifie pas nécessairement une augmentation de l&#39;autophagie, car elle pourrait également représenter un blocage dans le processus 2 . Le renouvellement du LC3-II est un paramètre utile pour mesurer le flux autophagique en analysant les cellules en présence etAbsence d&#39;inhibiteur de dégradation lysosomale, comme la chloroquine. La chloroquine inhibe la fusion de l&#39;autophagosse au lysosome, permettant ainsi la quantification de la formation d&#39;autophagonesome comme mesure du degré d&#39;autophagie en arrêtant le flux autophagique avant que la dégradation lysosomale puisse se produire 18 . En outre, la p62 est dégradée principalement par autophagie, et si la dégradation lysosomale de l&#39;autophagosome et son contenu est bloquée, une accumulation de p62 est attendue 17 , 19 . Autophagy est un processus à plusieurs étapes, et la mesure de LC3 ou de p62 seule ne fournit pas une image complète de ce qui se passe dans les cellules. Des publications récentes ont souligné la nécessité d&#39;examiner la formation simultanée de l&#39;autolysosome 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC estCapable de mesurer de manière unique la formation de l&#39;autolysosome par imagerie de la co-localisation de l&#39;autophagone au lysosome 15 - 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 . En outre, la co-localisation de p62 et LC3 utilisant MIFC a également été explorée pour mesurer le flux autophagique 5 . Dans le logiciel d&#39;analyse référencé, la &quot;fonctionnalité&quot; qui mesure la co-localisation s&#39;appelle &quot;Bright Detail Similarity R3&quot; (BDS) et a été spécialement conçue pour comparer les détails d&#39;image petite et lumineuse de deux images. BDS est le coefficient de corrélation Pearson transformé en log de points lumineux localisés avec un rayon de 3 pixels ou moins; En d&#39;autres termes, BDS calcule le degré deVerlapping pixels à partir de deux canaux fluorescents différents. Les points lumineux sont soit corrélés ( c.-à-d., Même emplacement spatial) ou non corrélés ( c&#39;est-à-dire différents emplacements spatiaux). Par conséquent, le coefficient de corrélation varie entre 0 (non corrélé) et 1 (corrélation parfaite). Le coefficient est log-transformé pour augmenter la portée entre zéro et l&#39;infini 26 , 27 . BDS seul peut ne pas être suffisant; Rajan et al. Ont constaté que l&#39;utilisation uniquement de SDE pourrait entraîner des résultats faussement positifs ou faussement négatifs 21 . BDS évalue la co-localisation de deux marqueurs d&#39;autophagie mais ne considère pas le nombre d&#39;autophagosomes. Pour tenir compte du nombre d&#39;autophagosomes, Rajan et al. Inclus le comptage local de la LC3 puncta 21 . Rajan et al. Proposé en utilisant un diagramme de dispersion bivariée du nombre de points LC3 par rapport aux SDE. À l&#39;aide de ce complot bivarié, deux populationsE identifié pour la première fois: un avec des cellules présentant un niveau élevé de taches de LC3 et une avec des cellules présentant un faible niveau de taches de LC3. La population de points LC3 a été classée en deux populations: les cellules ayant une faible localisation ( c. -à- d. L&#39; accumulation d&#39;autophagosomes) et les cellules ayant une co-localisation élevée ( c. -à- d. L&#39; accumulation d&#39;autolysosomes). Cette parcelle bivariée permet de distinguer les cellules avec très peu d&#39;autophagosomes et de cellules avec une accumulation d&#39;autophagosomes et / ou d&#39;autolysosomes 21 . Jusqu&#39;à présent, la co-localisation simultanée de LC3, p62 et LAMP1 (marqueur lysosomale) n&#39;était pas possible en utilisant un seul «Type d&#39;entité» dans le logiciel d&#39;analyse complémentaire MIFC (voir la Table des matières ). Cependant, une nouvelle fonctionnalité, récemment introduite dans la version 6.1, s&#39;appelle Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 compare les images détaillées lumineuses de chacune des trois images (dans ce cas LC3, p62 et LAMP1) et quantifie la co-localisation des trois sondes ( c.-à-d. LC3, p62 et LAMP1). La fonction BDC3 calcule le coefficient de corrélation de Pearson modifié pour s&#39;étendre à trois images. Étant donné que les points lumineux des trois images sont corrélés ou non corrélés, le coefficient de corrélation varie entre 0 (non corrélé) et 1 (corrélation parfaite). Le coefficient est log-transformé pour augmenter la plage dynamique entre 0 et l&#39;infini. En décalant la fonctionnalité BDS avec la fonctionnalité BDC3, la méthode d&#39;analyse présentée par Rajan et al. Peuvent maintenant incorporer les trois marqueurs les plus utilisés pour mesurer l&#39;autophagie dans un même système en même temps. La capacité de co-localiser ces trois marqueurs d&#39;autophagie dans un seul essai pourrait conduire à de nouvelles idées sur l&#39;induction et la régulation de l&#39;autophagie. Le protocole suivant décrit les étapes pour induire l&#39;autophagie dans les cellules Jurkat; Étiqueter les cellules avec des anticorps LC3, p62 et LAMP1; Acquérir des données sur un multispCytomètre de flux d&#39;imagerie ectral; Et analyser les données pour évaluer le flux autophagique.

<table><tbody><tr><td>Tube à centrifuger 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 étiqueté Âne anti-Souris - IgG&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) d’âne, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr> clone <tr><td>H4A3 de CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>(328607</td><td>de Human Legend. Concentration 400 & micro ; g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>CD45- PE anti-humain&nbsp ;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>Clone HI30.&nbsp ; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>anti-humain CD45-AF647&nbsp ;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>Clone HI30.&nbsp ; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anti-LC3 (Humain) mAb clone 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Clone 4E+12.&nbsp ; Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Anticorps anti-SQSTM1 / p62 [EPR4844] - Marqueur d’autophagosome (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>Clone EPR4844.&nbsp ; Concentration 0,5 mg/mL http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>Sel de diphosphate de chloroquine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyant - Coulter Clenz ;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Remplissez le récipient avec 200 ml de nettoyant https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr> <tr><td>teinture DAPI 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td></td></tr><tr><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741 Debubbler - 70 % Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Remplir le récipient avec 200 mL de débulleur.&nbsp ; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco’s 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&nbsp ; Ca++Mg++ Gratuit&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ Free&nbsp ;</td></tr><tr><td>Earle’s Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde, 10 %, sans méthanol, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>C’est ce qui est utilisé pour le formol à 4 % et 1 %. ATTENTION : Formolo/Formaldéhyde toxique par inhalation et en cas d’ingestion. Irritant pour les yeux, les systèmes respiratoires et la peau. Peut provoquer une sensibilisation par inhalation ou par contact avec la peau. Risque de lésions oculaires graves. Risque potentiel de cancer. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr> <tr><td>Solution saline équilibrée de Hanks 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM Acides aminés non essentiels 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>Une caméra à 2 caméras ImageStreamX Mark II équipée des lasers 405 nm, 488 nm et 642 nm a été utilisée. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>logiciel d’analyse MIFC - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>Le logiciel compagnon du MIFC (ImageStreamX MKII).&nbsp ; Logiciel MIFC IDEAS version 6.2</td></tr><tr><td>- INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>Il s’agit du logiciel qui exécute le MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE anti-humain CD107a (LAMP-1) Clone d’anticorps H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>solution de péniclline/streptomycine/glutamine 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>Rinçage - Eau ultrapure ou eau déminéralisée</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Vous pouvez utiliser n’importe quelle eau ultra-pure ou eau déminéralisée. Remplissez le récipient avec 900 ml de rinçage.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Moyen 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Gaine - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>C’est le même que le Saline tamponné au phosphate 1X de Dulbecco. Ca++MG++ gratuit.&nbsp ; Remplissez le récipient avec 900 mL de gaine.</td></tr><tr><td>Microtubes à centrifuger en polypropylène siliconé</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbran Tubes à centrifuger siliconés à faible rétention 1,5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>solution de pyruvate de sodium (100 mM)</td><td>HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Stérilisateur - 0,4 - 0,7 % Hypochlorite</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>Il s’agit généralement d’un agent de blanchiment Clorox à 10 % qui peut être fabriqué en éluant l’eau de Javel Clorox avec de l’eau. Remplissez le récipient avec 200 ml de stérilisateur.</td></tr><tr><td>Réactif d’étalonnage du système - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>Chaque tube contient ~10 mL.&nbsp ; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&nbsp ;</td></tr><tr><td>Fiole T75</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, détergent PROTEIN GRADE, solution à 10 %,</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>eau, qualité culture cellulaire.</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation du flux autophagique en mesurant lc3, p62 et lamp1 co-localisation à l&#39;aide de la cytométrie de flux d&#39;imagerie multispectrale

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

L&#39;autophagie est une voie catabolique dans laquelle des composants cellulaires normaux ou dysfonctionnels qui s&#39;accumulent pendant la croissance et la différenciation sont dégradés via le lysosome et sont recyclés. Au cours de l&#39;autophagie, la protéine LC3 cytoplasmique est lipidée et recrutée sur les membranes autophagosomales. L&#39;autophagosome se fusionne alors avec le lysosome pour former l&#39;autolysosome, où se produit la décomposition de la vésicule autophagose et son contenu. La protéine associée à l&#39;ubiquitine p62, qui se lie à LC3, est également utilisée pour surveiller le flux autophagique. Les cellules subissant une autophagie devraient démontrer la co-localisation des marqueurs p62, LC3 et lysosomaux. La microscopie contre l&#39;immunofluorescence a été utilisée pour identifier visuellement les molécules LC3 puncta, p62 et / ou les lysosomes par cellule. Cependant, une évaluation objective et statistiquement rigoureuse peut être difficile à obtenir. Pour surmonter ces problèmes, une cytométrie de flux d&#39;imagerie multispectrale a été utilisée avec une caractéristique analytique qui compare le brillant deImages de queue de trois marqueurs d&#39;autophagie (LC3, p62 et LAMP lysosomale) et quantifie leur co-localisation, en combinaison avec le comptage de points LC3 pour mesurer l&#39;autophagie d&#39;une manière objective, quantitative et statistiquement robuste.

Cette méthode d&#39;analyse utilise des fonctionnalités multiples pour évaluer le flux autophagique. Afin de bien comprendre l&#39;intrigue finale bivariée, les caractéristiques d&#39;analyse individuelles doivent d&#39;abord être étudiées. Le comptage des autophagosomes est un moyen logique de mesurer l&#39;autophagie; Cependant, la taille / la forme / la luminosité de LC3 puncta peuvent varier drastiquement entre les cellules. La variation peut rendre difficile la comptabilisation manuelle des autophagosomes ou l&#39;utilisation d&#39;une fonction de prise en compte dans le logiciel d&#39;analyse. Par conséquent, aucune caractéristique de détection spot ne sera parfaite en raison de cette grande variabilité dans les autophagosomes. Cependant, une bonne fonction de compte à vue fonctionnera sur la plupart des cellules 26 . La figure 3 montre des exemples de masquage ponctuel de LC3 puncta dans les cellules Jurkat en utilisant différents masques ponctuels. La fonction de prise en compte sélectionnée pour cet ensemble de données est Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, ce qui signifie que la fonctionnalité spot-count a compté les spots que le peMasque ak identifié dans le masque de canal 11 par défaut (M11) sur le canal 11 (Ch11-LC3-AF647) avec un rapport de fond de 4 couleurs (Bright, 4). La figure 4 montre les histogrammes de compte à vue et les images représentatives pour le nombre moyen de points pour les cellules Control, Control + Chloroquine, Starved et Starved + Chloroquine Jurkat marquées avec anti-LC3-AF647. Le nombre moyen de contrôle et de Starved ne sont pas significativement différents; Avec l&#39;addition de chloroquine, il existe une grande différence dans la moyenne de la Chloroquine Contrôle + par rapport à la Famine + Chloroquine. La prochaine caractéristique à étudier est BDC3. BDC3 est une mesure de la co-localisation de trois marqueurs / sondes, dans ce cas, LC3, p62 et LAMP1. La figure 5A - 5D montre les histogrammes BDC3 pour les cellules Control, Control + Chloroquine, Starved et Starved + Chloroquine Jurkat marquées avec anti-p62-AF488, Anti-LAMP1-PE et anti-LC3-AF647. Il y a un décalage entre le moyen de contrôle par rapport à la moyenne fortifiée, ainsi que la moyenne témoin + Chloroquine à la moyenne de Starved + Chloroquine. Cependant, en regardant les images des cellules à partir des scores BDC3 moyens de la figure 5E - 5H , il y a une différence plus grande entre les échantillons que les histogrammes peuvent conduire à croire. C&#39;est parce que BDC3 ne considère pas le nombre d&#39;organelles autophagiques qui co-localisent, ce qui entraîne une grande variabilité du nombre d&#39;autophagosomes pour le même score BDC3. Dans la plupart des cas, il existe un chevauchement entre les trois sondes car, même au niveau basal, p62, LAMP1 et LC3 devraient, dans une certaine mesure, co-localiser ou résider dans des régions similaires dans les cellules. En contraste, un exemple de trois sondes qui ne doivent pas co-localiser sont les colorants nucléaires anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 et DAPI pour l&#39;échantillon Starved + Chloroquine, montrés à la Figure 6. &lt;/ P&gt; Lorsque la fonctionnalité spot-count et la fonctionnalité BDC3 sont combinées, la présence de différentes sous-populations qui améliorent la capacité de distinguer les différents échantillons / conditions est évidente. La figure 7 montre le graphique bivarié du nombre de points de LC3 par rapport à BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 pour les quatre échantillons: contrôle, contrôle + chloroquine, affamés et affamés + chloroquine. L&#39;échantillon de contrôle a été utilisé pour définir la stratégie de déclenchement pour trois populations: points faibles, points élevés / faible BDC3 et points élevés / BDC3 élevé. Les échantillons témoins ont démontré que plus de 98% des cellules avaient 1 point ou moins. La limite entre les High Spots / Low BDC3 et High Spots / High BDC3 a été réglée sur un score BDC3 de 1, car plus de 91% de l&#39;échantillon Control avait un score BDC3 inférieur à 1. Un résumé des résultats pour les parcelles bivariées Est présenté dans le tableau 1 . Age = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> Figure 1: Paramètre de l&#39;instrument MIFC. Une capture d&#39;écran des paramètres de l&#39;instrument MIFC utilisés pour cette expérience, décrite à l&#39;étape 8 du protocole. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> Figure 2: Stratégie de gestion des logiciels d&#39;analyse. Une capture d&#39;écran du schéma de verrouillage du logiciel d&#39;analyse, décrite à l&#39;étape 9 du protocole. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> Fig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3: masquage de points LC3. Les images et les masques de la cellule Jurkat utilisés pour créer la fonction de prise en compte. On peut voir BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647 , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) et Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1). Le masque qui a fonctionné le mieux pour toutes les cellules montré était Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> Figure 4: Histogrammes LC3 Spot-count. En utilisant la fonction de détection spot Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 et les histogrammes de comptage spot LC3-AF647 pour Control ( A , bleu clair), Control + ChloroquinE ( B , bleu), Starved ( C , rose) et Starved + Chloroquine ( D , rouge). Le point moyen compte pour Control, Control + Chloroquine, Starved et Starved + Chloroquine sont respectivement de 0,07, 1,13, 0,10 et 2,77. BF, LC3-AF647 (rouge), le colorant nucléaire DAPI (bleu) et un composite des images LC3-AF647 et DAPI des cellules représentatives pour le nombre moyen de taches sont indiqués pour Control ( E , 0 spots), Control + Chloroquine ( F , 1 point), Starved ( G , 0 points), et Starved + Chloroquine ( H , 3 points). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> Figure 5: Histogrammes BDC3 de p62 / LAMP1 / LC3. Histogrammes BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 pourR Control ( A , bleu clair), Control + Chloroquine ( B , bleu), Starved ( C , rose) et Starved + Chloroquine ( D , rouge). Le score moyen de BDC3 pour Control, Control + Chloroquine, Starved et Starved + Chloroquine est respectivement de 0,57, 0,82, 0,74 et 0,98. BF; P62-AF488 (vert); LAMP1-PE (jaune); LC3-AF647 (rouge); Et un composite des images p62-AF488, LAMP1-PE et LC3-AF647 de cellules représentatives pour la moyenne BDC3 sont présentés pour Control ( E ), Control + Chloroquine ( F ), Starved ( G ) et Starved + Chloroquine ( H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> Figure 6: Histogrammes BDC3 de p62 / LC3 / DAPI pour l&#39;échantillon Starved + Chloroquine. ( A ) L&#39;histogramme BDC3 p62 / LC3 / DAPI pour l&#39;échantillon Starved + Chloroquine est montré. Le score moyen de BDC3 est de 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (vert); LC3-AF647 (rouge); DAPI (bleu); Et un composite des images p62-AF488, LC3-AF647 et DAPI de cellules représentatives pour le BDC3 moyen est représenté pour l&#39;échantillon Starved + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> Figure 7: parcelles bivariées de LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Placements bivariés du nombre de points LC3 versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 pour les cellules Control, Control + Chloroquine, Starved et Starved + Chloroquine Jurkat. ( B ) BF; P62-AF488 (vert); LAMP1-PE (jaune); LC3-AF647 (rouge); Et un composite des images p62-AF488, LAMP1-PE et LC3-AF647 de trois régions ( c&#39;est-à-dire Low Spots, High Spots / Low BDC3 et High Spots / High BDC3) sont indiqués pour l&#39;échantillon Starved + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Nombre de cellules </td><td> Colocation brillante des détails 3 Moyenne </td><td> Nombre horaire LC3 Mean </td><td> % Low Spot </td><td> % High Spot / Low BDC3 </td><td> % High Spot / High BDC3 </td></tr><tr><td> Contrôle </td><td> 439 </td><td> 0,57 </td><td> 0,07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td> Contrôle + Chloroquine </td><td> 1432 </td><td> 0,82 </td><td> 1.13 </td><td> 68,9 </Td&gt; <td> 19,5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> Affamé </td><td> 1204 </td><td> 0,74 </td><td> 0,10 </td><td> 98.4 </td><td> 0,6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> Faim + Chloroquine </td><td> 1811 </td><td> 0,98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36,9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Résumé de Jurkat LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariée Plot

Ici, la cytométrie de flux d&#39;imagerie multispectrale avec une caractéristique analytique qui compare les images détaillées lumineuses de 3 marqueurs d&#39;autophagie et qui quantifie leur co-localisation, ainsi que le comptage de points LC3, a été utilisée pour mesurer l&#39;autophagie d&#39;une manière objective, quantitative et statistiquement robuste.

Évaluation du flux autophagique en mesurant LC3, p62 et LAMP1 Co-localisation à l&#39;aide de la cytométrie de flux d&#39;imagerie multispectrale

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

L'objectif général de cette expérience est de quantifier la colocalisation de trois marqueurs de l'autophagie en association avec la quantification des points de LC3, afin de mesurer l'autophagie de manière objective, quantitative et statistiquement robuste. Cette méthode permet de mesurer la colocalisation de trois marqueurs de l'autophagie dans un seul test, pouvant ainsi conduire à de nouvelles découvertes sur l'induction et la régulation de l'autophagie. Le principal avantage de cette technique est que trois marqueurs de l'autophagie peuvent être mesurés simultanément de façon objective, quantitative et statistiquement robuste.Commencez par ajouter deux fois 10 à la sixième cellules Jurkat dans des tubes individuels de centrifugation de 15 millilitres étiquetés avec les noms d'échantillons appropriés. Ensuite, ajoutez suffisamment de tampon de lavage à chaque tube pour porter le volume final de chaque échantillon à 15 millilitres, puis faites tomber les échantillons en pellet par centrifugation. Remettez les pellets en suspension dans 100 microlitres de formol à 4 %, puis transférez les échantillons dans des tubes de microcentrifugation en polypropylène silanisé étiquetés.Après 10 minutes à température ambiante, lavez les échantillons dans un millilitre de tampon de lavage frais. Resuspendez les culots dans 100 microlitres du premier anticorps d'intérêt dans le tampon de perméabilisation pour une incubation de 30 minutes à l'obscurité à température ambiante, à l'abri de la lumière. Lavez les cellules marquées et perméabilisées dans un millilitre de tampon de perméabilisation frais et marquez-les avec l'anticorps suivant d'intérêt, comme vient d'être démontré.Une fois tous les échantillons marqués avec l'anticorps final, resuspendre les culots dans une solution de formol à 1 %, puis ajouter 10 microlitres de colorant nucléaire DAPI 10x. Mélanger les cellules par vortexage doux, puis incuber les échantillons pendant 10 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière. À la fin de l'incubation, charger le modèle par défaut sur le cytomètre de flux à imagerie multispectrale et sélectionner les lasers appropriés.Saisissez la puissance laser souhaitée dans la fenêtre située à côté de chaque bouton laser, puis cliquez sur le bouton charger pour placer le tube de 1,5 millilitre dans l'appareil. Créez un diagramme de dispersion M01 en fonction du rapport d'aspect M01 pour l'ensemble de la population, puis dessinez une région autour des cellules. Nommez cette région Cellule.Définissez les paramètres d'acquisition. Spécifiez le dossier de destination et le nom du fichier, puis modifiez le nombre d'événements à 5 000. Sélectionnez ensuite la population cellulaire et cliquez sur acquérir pour enregistrer le fichier et analyser les autres échantillons comme vient de l'être démontré, en utilisant les mêmes réglages laser. Après avoir collecté le fichier, cliquez sur retour pour récupérer le tube d'échantillon.Pour analyser les données de cytométrie d'imagerie multispectrale, cliquez sur Démarrer l'analyse pour exécuter l'assistant d'ouverture de fichier dans le logiciel d'analyse d'image, puis cliquez sur l'icône de l'assistant d'apoptose et sur le bouton Sélectionner l'assistant afin d'ouvrir l'assistant d'apoptose. Une fois que toutes les cellules apoptotiques ont été retirées de l'analyse, créez une région autour des cellules non apoptotiques et étiquetez cette population comme cellules. Ensuite, cliquez sur l'icône des blocs de construction.Sélectionnez les positifs en fluorescence selon une couleur et sélectionnez la population de cellules et l'intensité du canal MC trois. Étiquetez l'axe des X « intensité lampe un » et dessinez une région incluant les cellules dont l'intensité est supérieure à 10 000. Étiquetez cette région « lampe un positif ».Après avoir sélectionné les cellules positives pour P62 et LC3 de la même manière, cliquez sur l'onglet analyse et sélectionnez masque. Cliquez sur nouveau, puis sur fonction. Sous fonction, sélectionnez pic.Sous le masque, sélectionnez M11. Sous le canal, sélectionnez le canal 11. Réglez le rapport spot sur fond cytoplasmique à quatre.Ensuite, cliquez sur OK pour fermer la fenêtre de la fonction de masque définie, puis sur OK pour ajouter le masque à la liste des masques. Cliquez sur Fermer pour quitter le gestionnaire de masques, puis cliquez à nouveau sur l'onglet Analyse et sélectionnez Fonctionnalités. Cliquez sur Nouveau.Sous le type de caractéristique, sélectionnez le nombre de points et choisissez le masque de pics qui vient d'être créé. Saisissez « nombre de points LC3 » comme nom, puis cliquez sur OK. Cliquez à nouveau sur Nouveau.Sous le type de caractéristique, sélectionnez la colocalisation en détail brillant trois ou BDC3. Sous le masque, sélectionnez MC. Sous l'image un, sélectionnez le canal deux pour P62. Sous l'image deux, sélectionnez le canal trois pour lamp un.Sous l'image trois, sélectionnez le canal 11 pour LC3. Saisissez BDC3p62/LAMP1/LC3 comme nom, puis cliquez sur OK et fermez pour quitter le gestionnaire de fonctions. Cliquez sur la nouvelle icône de nuage de points et sélectionnez la population positive pour LAMP1, positive pour p62 et positive pour LC3.Sélectionnez BDC3/p62/LAMP1/LC3 pour l’axe des X et la caractéristique de dénombrement des points LC3 pour l’axe des Y, puis cliquez sur OK. Dans le menu Fichier, sélectionnez Enregistrer le fichier d’analyse de données, puis cliquez sur Enregistrer et Oui pour sauvegarder les données de jeûne plus chloroquine sous forme de fichier d’analyse de données et remplacer la version précédente du fichier. Ouvrez maintenant le fichier témoin et sélectionnez la matrice de compensation appropriée ainsi que le fichier d’analyse de données de jeûne plus chloroquine comme modèle.Cliquez sur OK. Pour créer des régions destinées à l'accumulation des autophagosomes et à l'accumulation des autolysosomes, ouvrez l'échantillon témoin et dessinez une région rectangulaire allant des coordonnées de l'axe des X de 0,1 à 3 et des coordonnées de l'axe des Y de 1,5 à 0,3. Nommez cette région « taches faibles ».Ensuite, dessinez une région allant des coordonnées X de 0,1 à 1 et des coordonnées Y de 17,5 à 1,5, puis nommez cette région « points élevés, faible BDC3 ». Dessinez ensuite une région allant des coordonnées X de 1 à 3 et des coordonnées Y de 17,5 à 1,5, puis nommez cette région « points élevés/fort BDC3 ». Enregistrez le fichier de contrôle afin qu'il puisse être utilisé comme modèle, puis ouvrez les autres fichiers, y compris le fichier « privation plus chloroquine », en utilisant le fichier de contrôle comme modèle, comme illustré précédemment. La taille, la forme et la luminosité des points LC3 peuvent varier considérablement d'une cellule à l'autre, comme observé dans ces masques de points représentant les points LC3 dans des cellules Jurkat, obtenus à l'aide de différents masques de points.Le masque qui a donné les meilleurs résultats pour cette expérience était celui présentant un rapport entre les pics et le fond cytoplasmique de quatre. Dans ces décomptes représentatifs de points fluorescents dans des cellules Jurkat marquées à l'anti-LC3, les nombres moyens de points fluorescents dans les conditions témoin et privées en nutriments ne diffèrent pas de manière significative. Lorsque de la chloroquine est ajoutée, une grande différence apparaît entre la moyenne du groupe témoin plus chloroquine et celle du groupe privé en nutriments plus chloroquine.Dans cette expérience, on observe un décalage entre la moyenne de la colocalisation BDC3 du témoin mesurée et la moyenne en condition de jeûne, ainsi qu'entre la moyenne du témoin avec chloroquine et la moyenne en condition de jeûne avec chloroquine. Le BDC3 ne tient pas compte du nombre d'organites d'autophagie qui colocalisent, ce qui entraîne un degré élevé de variabilité du nombre d'autophagosomes pour un même score BDC3. En effet, dans la plupart des cas, il existe un recouvrement entre les trois sondes, car même aux niveaux Beyza, p62, LAMP1 et LC3 devraient, dans une certaine mesure, colocaliser dans des régions similaires des cellules.À titre de contraste, voici un exemple de la caractéristique BDC3 sur trois sondes qui ne devraient pas être en colocalisation : P62, LC3 et DAPI. Lorsque le nombre de points et les caractéristiques BDC3 sont combinés, la présence des différentes sous-populations, qui améliore la capacité à distinguer entre les divers échantillons et conditions, devient évidente.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ huit heures si elle est effectuée correctement. Toutefois, si une fonctionnalité différente de décompte de taches est requise, un temps d'analyse supplémentaire serait nécessaire. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser les contrôles appropriés.Par exemple, utilisez l'échantillon témoin pour définir les seuils de niveau Beyza et l'échantillon témoin plus chloroquine comme témoin pour l'échantillon privé de nutriments plus chloroquine. Cette procédure peut également être utilisée pour d'autres applications intracellulaires nécessitant la colocalisation de trois marqueurs différents en remplaçant simplement les anticorps appropriés d'intérêt. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étiqueter les cellules avec des marqueurs d'autophagie, d'acquérir des données sur un cytomètre de flux à imagerie multispectrale et d'analyser les données afin d'évaluer le flux autophagique.N'oubliez pas que le travail avec le formol peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port d'équipements de protection individuelle appropriés, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Évaluation du flux autophagique en mesurant LC3, p62 et LAMP1 Co-localisation à laide de la cytométrie de flux dimagerie multispectrale (Vidéo) | JoVE Journal

Évaluation du flux autophagique en mesurant LC3, p62 et LAMP1 Co-localisation à l'aide de la cytométrie de flux d'imagerie multispectrale

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