Name: Dosages de retard de gel dagarose et de protéine-ARNt pour lanalyse de la N 6 -thereylcarbamoyladénosine TcdA Fonction (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Découvrez l'essai de retard sur gel d'agarose pour étudier les interactions protéine-ARN avec TcdA et l'ARNt(UUU). Cette méthode rapide permet de caractériser les complexes protéine-ARN avec de petites quantités d'échantillons.

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Attention: consultez toutes les fiches signalétiques pertinentes (fiche signalétique) avant utilisation. Plusieurs des produits chimiques utilisés dans ce protocole sont toxiques et corrosifs. Utiliser les pratiques appropriées lors de l&#39;extraction de l&#39;ARNt à l&#39;aide de phénol, y compris l&#39;utilisation d&#39;une hotte et d&#39;un équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse de laboratoire, pantalons complets, chaussures fermées, etc. ). Ce protocole utilise une tache d&#39;acide nucléique non toxique. L&#39;utilisation d&#39;autres taches peut nécessiter des précautions supplémentaires et une élimination spécialisée de l&#39;agent de coloration si elles sont toxiques ou cancérogènes ( p . Ex ., Bromure d&#39;éthidium). 1. Préparation du gel d&#39;agarose <ol><li> Peser 2 g d&#39;agarose et l&#39;ajouter à une bouteille en verre pour préparer un gel d&#39;agarose à 2% p / v. </li><li> Ajouter 100 ml d&#39;un tampon de liaison 1x-tris-borate-éthylènediaminetétracétique (EDTA) (TBE) à la bouteille contenant de l&#39;agarose. Faire fondre par chauffage dans un micro-ondes. À intervalles de 30 s, tourbillonner le contenu pour mélangerBien et répétez cette étape jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose soit complètement dissous. Laisser refroidir la solution d&#39;agarose à environ 50-60 ° C. </li><li> Tapez les bords ouverts d&#39;un bac en gel pour créer un moule, placez un peigne approprié pour créer les puits et jeter l&#39;agarose fondu dans celui-ci. Éviter la formation de bulles et laisser la solidifier à température ambiante. </li><li> Une fois solidifié, placer le bac en gel dans une unité d&#39;électrophorèse et le remplir avec un tampon TBE jusqu&#39;à ce que le gel soit complètement recouvert. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;ARNt <ol><li> Express tRNA (UUU) à E. coli <ol><li> Dans la matinée, utiliser un flacon de E. coli BL21 congelé (DE3) transformé avec le vecteur d&#39;expression pET23d-EcUUU 2 (héberge le gène codant pour l&#39;ARNt de E. coli (UUU)), pour obtenir un Luria Broth (LB) à faible teneur en sel, Plaque additionnée de 100 μg / ml d&#39;ampicilline. Inverser la plaque et la placer dans un incubateur de 37 ° C jusqu&#39;à ce que les colonies apparaissent (fin de l&#39;après-midiOon). </li><li> Inoculer une colonie unique cultivée dans 5 ml de LB plus 100 μg / mL d&#39;ampicilline et faire pousser toute une nuit à 220 tr / min à 37 ° C. </li><li> Le lendemain matin, granuler les cellules (6 500 xg pendant 10 min à 4 ° C), remplacer le milieu par 5 mL de LB fraîche plus 100 μg / mL d&#39;ampicilline et réusiner. Utilisez cette suspension pour inoculer 200 mL de LB plus 100 μg / mL d&#39;ampicilline. Cultiver pendant 5 h à 220 tr / min à 37 ° C. </li><li> Lorsque la densité optique de la culture à 590 nm (OD 590 ) a atteint 0,6 - 0,8, ajouter 1 mM d&#39;IPTG à la culture pour déclencher l&#39;expression du gène de l&#39;ARNt (UUU). Incuber à 37 ° C pendant 3 h. </li><li> Récolte les cellules en centrifugant la culture à 6 500 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li></ol></li><li> Lysis and extraction <ol><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans un tampon de lyse de 5 ml (acétate de sodium 0,3 M, EDTA 10 mM). À partir de ce moment-là, utilisez des tampons autoclavés et gardez tous les échantillons contenant de l&#39;ARNt à 4 ° C pour éviter que tDégradation de l&#39;ARN. </li><li> Ajouter 1 volume de phénol acide (pH 4,3) à la pastille de cellules ressuscité dans la hotte. Mélanger pendant 1 min par inversion pour lyser les cellules et centrifuger à 10 000 xg (10 min, 4 ° C). </li><li> Recueillir la phase aqueuse supérieure contenant l&#39;ARNt soluble (UUU) (et des concentrations plus faibles des autres pools d&#39;ARNt) en utilisant une pipette en prenant soin de ne pas aspirer la phase organique (inférieure). Jeter la couche inférieure et la pastille, qui consiste en la phase organique et les débris cellulaires, dans un récipient adéquat. </li><li> Précipiter l&#39;ARNt en mélangeant soigneusement la phase soluble (aqueuse) avec 2,5 volumes d&#39;éthanol à 100% v / v par inversion pendant 1 h à 4 ° C. Centrifuger le mélange à 15 000 xg (30 min, 4 ° C). </li><li> Décanter soigneusement le surnageant et remettre en suspension le culot riche en ARNt dans 4 ml de tampon de filtration sur gel (phosphate de sodium 20 mM ou phosphate de potassium, pH 7,4, EDTA 0,1 mM). Exécuter 5 μL du pool d&#39;ARNt resuspendu sur un gel d&#39;agarose à 2% p / v. REMARQUE:L&#39;ARNt de bonne qualité apparaît comme une bande unique (taille moléculaire comprise entre 50 et 100 pb). </li></ol></li><li> Purification de l&#39;ARNt (UUU) <ol><li> En suivant la pratique chromatographique standard 12 , charger l&#39;ARNt ressuscité (UUU) sur une colonne de filtration sur gel préparative haute résolution (dimensions: 16 x 600 mm, volume du lit: 120 ml, plage de résolution: 1 000 à 70 000 Da) préalablement équilibrée dans un tampon de filtration sur gel (phase mobile). Réglez le débit à 1 mL / min pour éluer les échantillons. REMARQUE: Le sommet de l&#39;ARNt (UUU) élue approximativement à 75,5 ml. Typiquement, on peut obtenir un rendement de 0,5-1,0 mg / L d&#39;ARNt de culture. </li><li> Analyser les échantillons à des volumes d&#39;élution représentatifs par électrophorèse de 5 à 10 μl de chaque échantillon sur un gel d&#39;agarose à 2% p / v. </li></ol></li></ol> 3. Préparation de l&#39;échantillon <ol><li> Exprimer et purifier TcdA selon López-Estepa et al . 2 . REMARQUE: jusqu&#39;à 250 μMTcdA peut être utilisé pour l&#39;étude. </li><li> Pipettez la quantité correspondante de TcdA selon le tableau 1 dans des tubes de centrifugation de 1,5 mL correctement étiquetés. Ajouter 1,6 mM de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) (concentration finale) et mélanger doucement à l&#39;aide d&#39;une pipette. Fermer le couvercle et incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Ajouter 10 μM de triphosphate d&#39;adénosine (ATP) et 50 mM de MgCl 2 (concentrations finales). Mélanger avec une pipette et incuber le mélange pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter l&#39;ARNt purifié (UUU) (section 2.3) selon le tableau 1 , mélanger avec une pipette et incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Ajouter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu&#39;à 100 μL de volume final. Mélanger correctement et ajouter du glycérol à une concentration finale de 10% v / v. </li><li> Vortez l&#39;échantillon et essorez brièvement le contenu du tube (10 000 xg, 1 min, 4 ° C). </li></ol> 4. Développement de chargement de gel et d&#39;électrophorèse<ol><li> Placez l&#39;unité d&#39;électrophorèse dans un plateau rempli de glace écrasée pour maintenir la chambre à 4 ° C pendant l&#39;opération d&#39;électrophorèse. </li><li> Soigneusement, faites pipeter 5 μL de chaque échantillon dans le puits correspondant. Ajouter un marqueur de taille d&#39;ADN approprié. </li><li> Branchez les électrodes dans les fentes correspondantes de l&#39;unité d&#39;alimentation. Allumez le bloc d&#39;alimentation et réglez la tension à 100 V et faites fonctionner le gel pendant 90 min. </li></ol> 5. Coloration du gel pour observer l&#39;interaction de l&#39;ARNt-protéine <ol><li> Préparer la solution de coloration en mélangeant 50 mL de TBE avec 1x d&#39;une tache d&#39;ADN appropriée. Évitez d&#39;exposer la solution de coloration à la lumière du soleil en recouvrant le récipient de coloration avec du papier d&#39;aluminium. NOTE: Les taches d&#39;ADN sont habituellement stockées sous forme de 10 000 ou 20 000 fois de concentrés. </li><li> Après 90 minutes d&#39;électrophorèse, retirez soigneusement le gel du bac et placez-le dans un récipient avec une solution de coloration. Placez-le sur un bascule à faible vitesse de basculement à la température ambianteUre pendant 30 min. </li><li> Retirez le gel d&#39;agarose du récipient de coloration, tapez-le soigneusement sur un morceau de papier de cellulose ou de filtre pour enlever l&#39;excès de liquide et placez-le directement sur un transilluminateur. Allumez la lumière UV pour visualiser les bandes contenant de l&#39;ARNt. Prenez une photo du gel. </li><li> Coloration des protéines (facultatif). <ol><li> Jeter la solution de coloration à l&#39;ADN en toute sécurité (selon les procédures de sécurité) et la remplacer par une solution de 50 ml de bleu brillant (CBB) de Coomassie. Placez le plateau sur un basculeur à température ambiante et tachez la nuit (&gt; 12 h). Jeter la solution de coloration CBB et la remplacer par 50 ml de PBS pour éliminer l&#39;excès de colorant. Déterminez pendant 1 h sur un rocker. </li></ol></li><li> Visualisez les complexes d&#39;ARNt contenant des protéines sous un transilluminateur léger et prenez des photos du gel pour comparer avec la photo de gel UV de l&#39;ARNt. </li></ol>

<ol><li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gel+retardation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li>
<li>López-Estepa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+and+small-angle+X-ray+analysis+of+CsdL%2FTcdA+reveal+a+new+tRNA+binding+motif+in+the+MoeB%2FE1+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily.</a> Plos One. 10 (4), e0118606(2015).</li>
<li>Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cyclic+form+of+N6-threonylcarbamoyladenosine+as+a+widely+distributed+tRNA+hypermodification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification.</a> Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).</li>
<li>Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+protein-protein+interactions+within+the+Cysteine+Sulfinate+Desulfinase+Fe-S+cluster+biogenesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system.</a> J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).</li>
<li>Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+heteromeric+CsdA-CsdE+cysteine+desulfurase%2C+assisting+Fe-S+cluster+biogenesis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).</li>
<li>Fried, M. G., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+studies+of+the+cyclic+AMP+receptor+protein-DNA+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction.</a> J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).</li>
<li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions%3A+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assays+for+RNA-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).</li>
<li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+mobility+shift+assays+to+detect+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions.</a> Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).</li>
<li>Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+agarose+gel+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+quantitating+protein%3A+RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions.</a> Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).</li>
<li>Hagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-filtration+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gel-filtration chromatography.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 10, Unit 10.9 (2001).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

L&#39;essai de retard de gel de protéine-ARNt d&#39;agarose décrit ici peut être modifié de plusieurs manières. Tout d&#39;abord, le pourcentage d&#39;agarose dans le gel peut être réduit pour permettre la séparation et la visualisation des complexes protéine-ARNt significativement plus importants que ceux analysés ici (120 kDa). Deuxièmement, si la protéine cible est thermolabile, des précautions supplémentaires doivent être prises pour que la température soit maintenue en dessous de la température maximale acceptable ...

<html> Le test de retard de gel 1 (également connu sous le nom de test de déplacement de mobilité électrophorétique, EMSA) est une méthode électrophorétique conçue pour étudier et caractériser les interactions protéines-acides nucléiques. Il permet l&#39;analyse de l&#39;ADN protéique ainsi que des interactions protéine-ARN et, en particulier, des interactions entre les protéines de liaison à l&#39;ARNt et à l&#39;ARNt, en utilisant soit des composants purifiés, soit des mélanges complexes de protéines ( par exemple , des lysats cellulaires) ou des acides nucléiques ( p . Ex . ARNt Piscines). Nous avons appliqué des essais de retard de gel à l&#39;étude de l&#39;interaction entre l&#39;ARNt purifié (UUU) et TcdA, une N 6 -théonylcarbamoyladenosine (t 6 A) déshydratase, qui cyclise la chaîne latérale de thréonylcarbamoyle attachée à A37 dans la boucle de tige anticodon (ASL) Des tRNAs à t 6 cyclique (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA est également connu sous le nom CsdL 3 ,F &quot;&gt; 4. Le gène tcdA / csdL forme une grappe avec les gènes csdA et csdE 5 , qui codent pour la cysteine ​​desulfurase et l&#39;accepteur de soufre du système de désulfinase de cysteine ​​sulfinase (CSD) et est nécessaire pour maintenir la fonction TcdA in vivo 3 . La raison d&#39;être des tests de retard de gel est que, bien que les molécules d&#39;acide nucléique libres migrent rapidement vers l&#39;avant de l&#39;acrylamide ou des gels d&#39;agarose en raison de leur grande charge négative, la mobilité électrophorétique des complexes de protéines des mêmes acides nucléiques est considérablement réduite. La réduction de la mobilité est visualisée comme un «décalage» dans les complexes acide nucléique-protéine, qui se résolvent sous forme de bandes discrètes. Un complexe de protéines d&#39;acide nucléique et de charge positif et plus large montre un déplacement plus important ou une réduction de la mobilité sur un gel. Puisque la neutralisation des charges du complexe est un phénomène universelPour les complexes protéine-acide nucléique, l&#39;essai de retard de gel peut être appliqué à une large gamme de complexes et de types d&#39;acides nucléiques. La méthode est simple, peu coûteuse et peut être effectuée dans des laboratoires avec un équipement minimum. Il ne nécessite que de petites quantités de protéines et d&#39;ARNt. C&#39;est un avantage par rapport à d&#39;autres techniques biophysiques, qui habituellement consomment de plus grandes quantités d&#39;échantillons. Le test de retard de gel a été largement utilisé pour l&#39;étude des facteurs de transcription. Le test a été utilisé pour analyser la cinétique de liaison, la force et la spécificité des facteurs de transcription pour de nombreuses séquences d&#39;ADN différentes. C&#39;est en effet dans ce domaine que l&#39;EMSA a été développée pour la première fois 6 , 7 . Des essais de retard de gel avec des molécules d&#39;ARN 8 , 9 , 10 , 11 et tRNA ont également été utilisés dans la recherche sur les ribosomesEt d&#39;analyser, comme nous le faisons ici, les enzymes qui modifient les nucléosides d&#39;ARNt post-transcriptionnellement. De nombreux paramètres différents affectent le résultat d&#39;un essai de retard de gel tel que la température, la qualité de l&#39;échantillon de protéines et d&#39;ARNt et la force de la liaison. Une planification minutieuse et l&#39;exécution de l&#39;expérience est cruciale pour l&#39;interprétation des résultats de l&#39;acide nucléique et des espèces liées aux protéines. Ici, nous avons utilisé le gène synthétique codant pour l&#39;ARNt (UUU) clone dans un vecteur d&#39;expression dont le promoteur n&#39;a pas le site de liaison au ribosome Shine-Dalgarno, ce qui conduit à la synthèse de grandes quantités d&#39;ARNt 2 . Ce protocole détaillé est destiné à fournir un guide clair pour effectuer des expériences de retard de gel d&#39;ARNt tout en évitant les erreurs courantes.

<table><tbody><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td>Le lysogène <td>Novagen</td><td>70235</td><td>DE3 contient de la polymérase T7 lors de l’induction de l’IPTG.</td></tr><tr><td>pET23d</td><td>Novagen</td><td>69748-3</td><td>pET23d confère une résistance à l’ampicilline ; Promoteur T7.</td></tr><tr><td>Bouillon LB, faible teneur en sel (bouillon Lennox L), granulé</td><td>Melford</td><td>GL1703</td><td>Le bouillon LB conventionnel, à haute teneur en sel, peut également être utilisé.</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10419313</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur (Thermostaté)</td><td>NBS</td><td>Excella E24&nbsp ;</td><td>N’importe quel incubateur à agitateur avec contrôle de la température peut être utilisé.</td></tr><tr><td>Isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99 %</td><td>Acros Organics</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium, anhydre, >99 %</td><td>Melford</td><td>B4017</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), sel disodique, >99 %</td><td>Acros Organics</td><td>AC327205000</td><td>Nocif en cas d’inhalation.</td></tr><tr><td>Centrifugeuse (réfrigérée)</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de centrifugeuse (réfrigérée)</td><td>Eppendorf</td><td>5430/5430P</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Sorvall</td><td>RC5C</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de centrifugeuse</td><td>Sorvall</td><td>SLA-3000</td><td></td></tr><tr><td>Solution phénolique, saturée de tampon de citrate 0,1 M, pH 4,3 &plusmn ; 0,2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>Toxicité aiguë (orale, cutanée, inhalation), corrosive</td></tr><tr><td>Éthanol absolu pour analyse, 100 % v/v</td><td>Merck Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique dihydraté, Na2HPO4, >=99 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de potassium, KH2PO4</td><td>Merck</td><td>48,730,250</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 75&nbsp ;</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>Tris [Tris(hydroxymethyl)aminométhane HCl]</td><td>Melford</td><td>T1513</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Melford</td><td>B0503</td><td></td></tr><tr><td>Micro-ondes</td><td>Haier</td><td>HDA-2070M</td><td></td></tr><tr><td>TCEP [Tris(2-carboxyéthyl)chlorhydrate de phosphine]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td>Corrosif pour les métaux et la peau.</td></tr><tr><td>ATP [adénosine 5&prime ;-triphosphate disodium hydraté], grade I, >=99 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2), anhydre, >=98 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl), >99 %</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl), >99 %</td><td>Melford</td><td>P0515</td><td></td></tr><tr><td>NZYDNA Ladder VI</td><td>NZYtech</td><td>MB8901</td><td></td></tr><tr><td>Bloc d’alimentation</td><td>Consort</td><td>EV261</td><td></td></tr><tr><td>Unité d’électrophorèse</td><td>Real Laboratory</td><td>RELSMINI10</td><td></td></tr><tr><td>Real Safe Coloration des acides nucléiques</td><td>Real Laboratory</td><td>RBMSAFE</td><td>20,000X stock UV</td></tr><tr><td>Transilluminator (G :Box/EF)</td><td>Syngene</td><td>2216498</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Rocker (Gyro-Rocker)</td><td>Stuart</td><td>SSL3</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Vortex&nbsp ;</td><td>13214789</td><td></td> <td>de la marque Fisher</td></tr></tbody></table>

dosages de retard de gel d&#39;agarose et de protéine-arnt pour l&#39;analyse de la<em&gt; n</em<sup&gt; 6</sup&gt; -thereylcarbamoyladénosine tcda fonction

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Nous démontrons des méthodes pour l&#39;expression et la purification de l&#39;ARNt (UUU) dans Escherichia coli et l&#39;analyse par des essais de retard de gel de la liaison de l&#39;ARNt (UUU) à TcdA, une N 6 -théonylcarbamoyladénosine (t 6 A) déshydratase, qui cyclise le thréonylcarbamoyle Chaîne latérale attachée à A37 dans la boucle de tige anticodon (ASL) des tRNAs à t 6 A cyclique (ct 6 A). La transcription du gène synthétique codant pour l&#39;ARNt (UUU) est induite chez E. coli avec 1 mM de ß-D-1-thiogalactopyranoside isopropylique (IPTG) et les cellules contenant de l&#39;ARNt sont récoltées 24 heures après l&#39;induction. La fraction d&#39;ARN est purifiée en utilisant la méthode d&#39;extraction du phénol acide. L&#39;ARNt pur est obtenu par une Chromatographie de filtration sur gel qui sépare efficacement les molécules d&#39;ARNt de petite taille des plus grands acides nucléiques intacts ou fragmentés. Pour analyser la liaison TcdA à l&#39;ARNt (UUU), TcdA est mélangé avec l&#39;ARNt (UUU) et séparé sur un gel d&#39;agarose natif à 4 ° C.L&#39;ARNt libre (UUU) migre plus rapidement, tandis que les complexes TcdA-ARNt (UUU) subissent un retard de mobilité qui peut être observé lors de la coloration du gel. Nous démontrons que TcdA est une enzyme de liaison à l&#39;ARNt (UUU). Ce test de retard de gel peut être utilisé pour étudier les mutants TcdA et les effets des additifs et d&#39;autres protéines sur la liaison.

De grandes quantités d&#39;ARNt (UUU) peuvent être obtenues en exprimant le gène de l&#39;ARNt dans E. coli sous le contrôle d&#39;un promoteur T7 inducible fort. L&#39;ARNt exprimé (UUU) s&#39;accumule dans le cytoplasme et est enrichi sur le pool d&#39;ARNt naturellement abondants. Un procédé de purification en deux étapes consistant en une étape de capture / extraction et une étape de filtration / polissage sur gel a été utilisé pour obtenir l&#39;ARNt EMSA. L&#39;étape de ca...

Un protocole est présenté pour la production de l&#39;ARNt (UUU) et l&#39;analyse de l&#39;ARNt (UUU) en complexe avec l&#39;enzyme TcdA par des essais de retard de gel d&#39;agarose.

Dosages de retard de gel d&#39;agarose et de protéine-ARNt pour l&#39;analyse de la<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -thereylcarbamoyladénosine TcdA Fonction

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer un test de rétention sur gel d'ARN conçu pour la découverte et la caractérisation de protéines liant l'ARN. L'application de ce test permet d'étudier l'interaction entre la TcdA et l'ARN de transfert. La méthode de rétention sur gel d'agarose peut fournir des réponses à des questions clés dans le domaine de la biologie de l'ARN.Par exemple, si une protéine donnée interagit avec l'ARN, si cette interaction est spécifique à la séquence, et quelle est la force de cette interaction. Les principaux avantages de cette technique sont qu'elle utilise de faibles quantités d'échantillons de protéines et d'ARN, et qu'elle fournit très rapidement des résultats très informatifs sur les interactions protéine-ARN. Bien que cette méthode puisse apporter des informations sur les complexes protéine-ARNt, elle peut également être appliquée à de nombreux autres systèmes, tels que l'ARN ribosomique, l'ARN messager, et tout autre type de molécule d'ARN.Le matin, récupérez un flacon d'Escherichia coli BL21 DE3 congelé, transformé avec le vecteur d'expression pET-23D EC triple-U. Effectuez un isolement par striation sur une boîte de gélose nutritive L

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Ce protocole décrit la préparation d'un substrat synthétique pour...

Test in vitro avec la méthylation de l&#39;ADN ARNt avec Entamoeba histolytica et ARNt Dnmt2 méthyltransférase (Ehmeth) Enzyme

télomérase est exprimée dans le cerveau néonatal et également dans des régions distinctes du cerveau adulte. Nous présentons un test TRAP non toxique permettant de gagner du temps pour l’analyse de l’activité de la télomérase dans diverses régions du cerveau de la souris et la détection des différences d’activité de la télomérase entre les cerveaux des souris mâles et femelles.

Activité de la télomérase dans les différentes régions du cerveau de souris: la télomérase non-radioactifs Répétition protocole d&#39;amplification (TRAP) Dosage

Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole et son analogue freebase présentent une faible cytotoxicité cellulaire micromolaire. Ce manuscrit décrit une réaction de transcription d'ARN, l'ARN de formation d'image avec un gel coloré au bromure d'éthidium et l'ARN quantifier avec spectroscopie UV-Vis, afin d'évaluer l'inhibition de la transcription par corroles et illustre une méthode simple d'évaluation des propriétés anticancéreuses candidates.

Une<em&gt; In Vitro</em&gt; Dosage enzymatique pour mesurer l&#39;inhibition de transcription par le gallium (III) et H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorophényl) corroles

Ce protocole décrit NAME, un test qui permet d’identifier rapidement des molécules capables d’inhiber in vitro les activités chaperonnes de la protéine nucléocapside du VIH-1.

Nucléocapside recuit-Mediated électrophorèse (NOM) Assay permet l&#39;identification rapide des VIH-1 inhibiteurs Nucleocapsid

Nous présentons un plan stratégique et un protocole pour identifier les variants génétiques non codants affectant la liaison à l’ADN du facteur de transcription (TF). Un protocole expérimental détaillé est fourni pour l’analyse du test de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) et du test de précipitation d’affinité de l’ADN (DAPA) de la liaison de l’ADN TF dépendant du génotype.

Le dépistage de la fonctionnelle non-codant des variants génétiques utilisant mobilité électrophorétique Maj Assay (EMSA) et l&#39;ADN-affinité Précipitations Assay (DAPA)

La transcriptase inverse de la télomérase humaine (TERT) synthétise non seulement l’ADN télomérique, mais aussi l’ARN bicaténaire par l’activité de l’ARN polymérase ARN-dépendante. Nous décrivons ici un essai nouvellement créé pour détecter l’activité de l’ARN polymérase ARN-dépendante du TERT endogène.

Détection semi-quantitative de l’activité de l’ARN polymérase ARN-dépendante de protéine de Transcriptase inverse de la télomérase humaine

Nous décrivons ici un protocole pour la caractérisation biochimique de l’enzyme de RNA-modification de la levure, Mod5 et discuter de comment ce protocole pourrait être appliqué à d’autres enzymes de modification des RNA.

Un test In Vitro pour détecter l’activité ARNt-isopentényl transférase

Ici, un analyse in vitro sans anticorps pour l'analyse directe de l'activité de méthyltransferase sur l'ARN synthétique ou in vitro transcrit est décrit.

Analyse d'activité sans anticorps pour l'analyse de l'activité de méthyltransferase d'ARN

Nous décrivons l’ingénierie d’une nouvelle ARN polymérase T7 attachée à l’ADN pour réguler les réactions de transcription in vitro. Nous discutons des étapes de la synthèse et de la caractérisation des protéines, validons la régulation transcriptionnelle de la preuve de concept et discutons de ses applications en informatique moléculaire, en diagnostic et en traitement de l’information moléculaire.

ARN polymérase attachée à l’ADN pour la transcription in vitro programmable et le calcul moléculaire

L’interaction d’un remodeleur de chromatine dépendant de l’ATP avec un ligand d’ADN est décrite à l’aide de la spectroscopie CD. Les changements conformationnels induits sur un promoteur de gène analysés par les pics générés peuvent être utilisés pour comprendre le mécanisme de régulation transcriptionnelle.

Spectroscopie CD pour étudier les interactions ADN-protéine

Ici, un protocole pour doser les enzymes métabolisant les acides nucléiques est présenté, à l’aide d’exemples d’enzymes ligase, nucléase et polymérase. Le test utilise des oligonucléotides marqués par fluorescence et non marqués qui peuvent être combinés pour former des duplex imitant les dommages à l’ARN et/ou à l’ADN ou les intermédiaires de voie, permettant la caractérisation du comportement enzymatique.

Utilisation d’oligonucléotides synthétiques modifiés pour doser des enzymes métabolisant des acides nucléiques

Découvrez l'essai de retard sur gel d'agarose pour étudier les interactions protéine-ARN avec TcdA et l'ARNt(UUU). Cette méthode rapide permet de caractériser les complexes protéine-ARN avec de petites quantités d'échantillons.

Dosages de retard de gel d'agarose et de protéine-ARNt pour l'analyse de la

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