In Vitro Croissance des follicules Preantral souris sous microgravité simulée

Croissance in vitro de follicules préantraux de souris sous la microgravité simulée. L’ensemble de la procédure peut être divisé en quatre parties. La première partie consiste à isoler mécaniquement les follicules des ovaires à l’aide d’aiguilles au stéréomicroscope.

Dans la deuxième partie, encapsulez un seul follicule en le pipetant au milieu de chaque perle d’alginate. Dans la troisième partie, transférez les billes d’alginate contenant les follicules uniques dans la gouttelette de milieu de culture dans le système de culture en rotation qui génère la microgravité simulée. Dans la quatrième partie, prélevez des billes d’alginate et décapsulez les follicules des billes d’alginate en les incubant dans un milieu complété par de l’alginate lyase pendant 30 minutes à 37 degrés centigrades.

Isolement et encapsulation des follicules. Prélevez les ovaires dans un milieu de manipulation, puis placez les ovaires dans une plaque à puits centrée. Au stéréomicroscope, les follicules sont isolés des ovaires par deux aiguilles.

Veillez à ne pas altérer la vasomembrane. Préparez un plat avec des gouttelettes de moyen et couvrez-le d’huile. Transférez les follicules dans le plat préparé.

Lavez les follicules dans le nouveau milieu, puis transférez-les dans les gouttelettes du milieu. Une gouttelette de milieu contient un seul follicule. Préparez une boîte de culture centrée, ajoutez la solution d’encapsulation dans le cercle extérieur.

Préparez un flacon de la solution d’alginate virgule huit pour cent. Ajoutez zéro virgule cinq microlitres de solution d’alginate au centre du plat. Ajouter des gouttelettes de la solution d’alginate dans la solution d’encapsulation dans le cercle extérieur de la boîte.

Transférez le follicule dans la solution d’alginate au centre du plat. Rincez les follicules avec la solution d’alginate. Transférez les follicules au milieu de chaque perle d’alginate à travers la surface molle de la solution.

Chaque perle d’alginate contient un seul follicule. Rincez les billes d’alginate avec la solution d’encapsulation pour solidifier les billes. Transférez les billes d’alginate dans un nouveau plat avec un produit de manipulation.

Culture in vitro de follicules encapsulés sous traitement simulé par microgravité. Pour le groupe témoin, ajoutez 150 millilitres de milieu de culture dans un nouveau plat et couvrez-le d’huile. Transvasez trois billes d’alginate dans la gouttelette moyenne.

Incuber la boîte dans un incubateur à dioxyde de carbone pour la culture. Pour un traitement simulé par microgravité, préparez un plat d’huile, retirez le capuchon de l’orifice, ajoutez l’huile dans le récipient par le port ouvert, jusqu’à ce que le récipient soit presque plein. Ajoutez un milieu de culture de 50 millimètres dans l’huile.

Transvasez trois billes d’alginate dans la gouttelette moyenne. Replacez le capuchon du port ouvert. Les bulles d’air dans le récipient doivent être éliminées.

Retirez le capuchon de l’orifice de la seringue. Placez deux seringues avec de l’huile sur l’orifice de la seringue. Manœuvrez les bulles d’air sous l’orifice de la seringue.

Tirez les bulles dans la seringue et injectez le même volume d’huile dans l’autre seringue. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le récipient. Fermez les valves, retirez les seringues et replacez le capuchon de l’orifice de la seringue.

Nous avons déjà préparé quatre récipients avec des billes d’alginate. Il est maintenant temps de fixer les récipients dans la base rotative. Ajustez la vitesse de rotation jusqu’à ce que la gouttelette moyenne soit dans un état d’équilibre.

Transférez les récipients et la base dans un incubateur de dioxyde pour la culture. Changer de support culturel. Retirez le capuchon de l’orifice ouvert, récupérez les billes d’alginate et l’huile dans un nouveau plat.

Trouvez et transférez les billes d’alginate dans un plat avec le fluide de manipulation. Rétablissez le système d’élevage des récipients comme avant. Prélèvement folliculaire.

Retirez le capuchon de l’orifice ouvert, récupérez les billes d’alginate et l’huile dans un nouveau plat. Prélevez les billes d’alginate et les follicules décapsulés des billes d’alginate en les incubant dans un milieu de manipulation, complété par une alginate lyase pendant 30 minutes à 37 degrés centigrades. Résultats. L’essai de viabilité cellulaire a montré que les follicules uniques cultivés dans des conditions de gravité normale ont plus de cellules vivantes et moins de cellules mortes que les follicules cultivés dans des conditions de microgravité simulées.

La taille du follicule a augmenté de manière significative dans les deux conditions de gravité. Conclusion. Notre méthode fournit un modèle pour étudier les mécanismes impliqués dans les processus de développement in vitro des cellules d’ovocytes et de granulosa dans des conditions de microgravité simulées.