In Vitro Croissance des follicules Preantral souris sous microgravité simulée
17 décembre 2017
Une technique très prometteuse pour générer des tissus construit sans aide d’une matrice est aux cellules en culture dans un état de microgravité simulée. À l’aide d’un système rotatif de culture, nous avons examiné la croissance folliculaire ovarienne et la maturation des ovocytes en termes de survie du follicule, morphologie, croissance et fonction d’ovocytes dans les conditions de microgravité simulée.
Culture in vitro de follicules préantraux de souris en microgravité simulée. L'ensemble du protocole peut être divisé en quatre parties. Première partie : isoler mécaniquement les follicules des ovaires à l'aide d'aiguilles sous microscope stéréo.
Deuxième partie, encapsuler un follicule unique en le pipetant au centre de chaque bille d'alginate. Troisième partie, transférer les billes d'alginate contenant les follicules uniques dans la goutte de milieu de culture du système de culture rotatif qui génère une microgravité simulée. Quatrième partie, prélever les billes d'alginate et décapsuler les follicules des billes d'alginate en les incubant dans un milieu supplémenté en alginate lyase pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.
Isolation et encapsulation des follicules. Prélevez les ovaires dans un milieu de manipulation, puis placez-les dans une plaque à puits centrée. Sous un microscope stéréo, isolez les follicules des ovaires à l’aide de deux aiguilles.
Veillez à ne pas endommager la membrane vasculaire. Préparez une boîte contenant des gouttelettes de milieu et recouvrez-la d'huile. Transférez les follicules dans la boîte préparée.
Lavez les follicules dans le nouveau milieu, puis transférez-les dans les gouttes de milieu. Une goutte de milieu contient un seul follicule. Préparez une boîte de culture centrée et ajoutez la solution d'encapsulation dans le cercle extérieur.
Préparez un flacon contenant la solution d'alginate à zéro virgule huit pour cent. Ajoutez zéro virgule cinq microlitre de solution d'alginate au centre de la boîte. Ajoutez des gouttelettes de solution d'alginate dans la solution d'encapsulation située sur le cercle extérieur de la boîte.
Transférez le follicule dans la solution d'alginate au centre de la boîte. Rincez les follicules avec la solution d'alginate. Transférez les follicules au milieu de chaque bille d'alginate à travers la surface molle de la solution.
Chaque bille d'alginate contient un seul follicule. Rincer les billes d'alginate avec la solution d'encapsulation afin de solidifier les billes. Transférer les billes d'alginate dans un nouveau plat contenant le milieu de manipulation.
Culture in vitro de follicules encapsulés sous traitement de microgravité simulée. Pour le groupe témoin, ajouter 150 millilitres de milieu de culture dans une nouvelle boîte et le recouvrir d'huile. Transférer trois billes d'alginate dans la goutte de milieu.
Incuber la boîte dans un incubateur au dioxyde de carbone pour la culture. Pour le traitement en microgravité simulée, préparez une boîte d'huile, retirez le bouchon du port, ajoutez l'huile dans le récipient par l'orifice ouvert jusqu'à ce que le récipient soit presque plein. Ajoutez un milieu de culture de 50 millilitres dans l'huile.
Transférez trois billes d'alginate dans la goutte de milieu. Remplacez le bouchon du port ouvert. Les bulles d'air dans le récipient doivent être éliminées.
Retirer le bouchon du port de seringue. Placer deux seringues contenant de l'huile sur le port de seringue. Déplacer les bulles d'air sous le port de seringue.
Aspirez les bulles dans la seringue et injectez un volume équivalent d'huile par l'autre seringue. Veillez à ce qu'il n'y ait aucune bulle d'air dans le récipient. Fermez les vannes, retirez les seringues et remplacez le bouchon du port de seringue.
Nous avons déjà préparé quatre récipients contenant des billes d'alginate. Il est maintenant temps de fixer les récipients sur la base rotative. Ajustez la vitesse de rotation jusqu'à ce que les gouttelettes de milieu soient en état d'équilibre.
Transférez les deux récipients et la base dans un incubateur au dioxyde de carbone pour la culture. Changement du milieu de culture. Retirez le bouchon du port d'ouverture, puis récupérez les billes d'alginate et l'huile dans un nouveau plat.
Localisez et transférez les billes d'alginate dans une boîte contenant le milieu de manipulation. Rétablissez le système de culture en milieu comme précédemment. Récupération des follicules.
Retirez le bouchon du port ouvert, récupérez les billes d'alginate et l'huile dans un nouveau récipient. Prélèvez les billes d'alginate et les follicules décapsulés à partir des billes d'alginate en les incubant dans un milieu de manipulation, supplémenté avec une alginate lyase pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Résultats. Le test de viabilité cellulaire a montré que les follicules isolés cultivés dans des conditions de gravité normale contenaient davantage de cellules vivantes et moins de cellules mortes que les follicules cultivés dans des conditions de microgravité simulée.
La taille des follicules a augmenté de manière significative dans les deux conditions de gravité. Conclusion. Notre méthode fournit un modèle pour étudier les mécanismes impliqués dans les processus de développement in vitro des ovocytes et des cellules de la granulosa en condition de microgravité simulée.
Aperçu
Cette étude décrit un protocole de culture de follicules préantraux de souris dans des conditions de microgravité simulée à l'aide d'un système de culture rotatif. L'approche consiste à isoler et encapsuler les follicules dans des billes d'alginate, à les cultiver dans des conditions normales et de microgravité simulée, puis à évaluer la survie des follicules, leur croissance et l'ultrastructure de l'ovocyte. Les résultats mettent en évidence l'impact de la microgravité sur la viabilité des follicules et le développement des ovocytes, offrant ainsi un modèle pour approfondir l'étude de la folliculogenèse in vitro sous gravité modifiée.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie de la reproduction
- Biologie du développement
- Génie tissulaire
Contexte
- Les environnements de microgravité peuvent affecter le développement cellulaire et tissulaire.
- La culture in vitro des follicules constitue un outil précieux pour l'étude du développement des ovocytes et des cellules de la granulosa.
- Les systèmes de microgravité simulée permettent d'explorer le rôle de la gravité dans la folliculogenèse.
- L'encapsulation dans l'alginate soutient la culture tridimensionnelle des follicules.
Objectif de l'étude
- Établir un protocole pour la culture de follicules préantraux de souris en conditions de microgravité simulée.
- Comparer la survie et le développement des follicules entre des conditions de gravité normale et de microgravité simulée.
- Évaluer les effets de la microgravité sur le développement de l'ovocyte et des cellules granuleuses.
Méthodes utilisées
- Isolation mécanique de follicules préantraux à partir d'ovaires de souris âgées de 14 jours à l'aide d'aiguilles sous un microscope stéréo.
- Encapsulation de follicules individuels dans des billes d'alginate à 0,8 %.
- Culture de follicules encapsulés dans un système de récipient rotatif afin de simuler la microgravité, avec des cultures témoins parallèles à gravité normale.
- Récupération et désencapsulation des follicules à l'aide d'alginate lyase.
- Évaluation de la survie des follicules, mesure des diamètres des follicules et des ovocytes, et analyse ultrastructurale des ovocytes.
Résultats principaux
- Les follicules cultivés en gravité normale ont montré une viabilité cellulaire plus élevée par rapport à ceux exposés à une microgravité simulée.
- La taille des follicules a augmenté significativement dans les deux conditions de gravité.
- La microgravité simulée a entraîné une diminution de la survie des follicules et une régulation négative de l'antigène nucléaire des cellules en prolifération (PCNA) et de l'expression du facteur de croissance et de différenciation 9 (GDF9).
- Les ovocytes du groupe microgravité présentaient des anomalies ultrastructurales.
Conclusions
- La méthode décrite permet l'étude du développement in vitro des follicules et des ovocytes en conditions de microgravité simulée.
- La microgravité simulée affecte négativement la survie des follicules et la qualité des ovocytes.
- Une optimisation supplémentaire du système de culture est nécessaire pour modéliser plus précisément la folliculogenèse in vitro dans des conditions de gravité modifiée.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La culture en microgravité simulée de follicules préantraux de souris fournit un système contrôlé permettant d'analyser l'impact mécanistique de forces physiques modifiées sur la folliculogenèse précoce. Ce modèle permet une évaluation quantitative de la survie folliculaire, de la croissance de l'ovocyte et des marqueurs moléculaires, renforçant la fiabilité prédictive des études en biologie du développement. Cette approche éclaire les décisions adaptées au risque dans la recherche translationnelle en reproduction et en génie tissulaire.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une détection mécanistique des risques associés au développement des follicules et des ovocytes dans des conditions de gravité modifiée.
- Permet la validation fonctionnelle de marqueurs moléculaires tels que la PCNA et la GDF9 dans la maturation des cellules de la granulosa et des ovocytes.
- Offre une plateforme quantitative pour la vérification d'hypothèses en biologie de la reproduction et en ingénierie tissulaire.
Développement de criblages et de tests
- Établit un système de culture 3D reproductible permettant d'évaluer la viabilité des follicules et les paramètres de croissance.
- Facilite la standardisation de mesures quantitatives, notamment les diamètres des follicules et des ovocytes.
- Permet une analyse comparative de la survie et de l'expression moléculaire dans différentes conditions physiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Offre un modèle pour l'étude des mécanismes liés aux maladies qui affectent la qualité de l'ovocyte et la survie des follicules.
- Permet de corréler les résultats in vitro avec le développement de biomarqueurs translationnels en santé reproductive.
- Éclaire les stratégies précliniques visant à optimiser les systèmes de culture tissulaire dans des environnements non standard.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'intègre dans la continuité découverte-préclinique en permettant des études mécanistiques en phase précoce et le développement d'essais quantitatifs en biologie de la reproduction et en ingénierie tissulaire.
- Biologie de la découverte : Permet l'interrogation fondée sur des hypothèses des effets de la gravité sur la folliculogenèse et la maturation des ovocytes.
- Essais de criblage : Fournit des résultats normalisés et quantitatifs sur la viabilité et la croissance dans des conditions contrôlées.
- Analytique : Fournit des paramètres mesurables tels que les taux de survie, l'expression des marqueurs moléculaires et l'analyse ultrastructurale.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les résultats in vitro et les modèles précliniques en médecine reproductive et régénérative.
- Réutilisation à grande échelle : Met en place une plateforme réutilisable pour des études mécanistiques portant sur divers types de tissus et de cellules.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive dans les modèles de biologie du développement et de biologie de la reproduction.
- Valeur opérationnelle : Favorise la standardisation et la reproductibilité des protocoles de culture 3D et d'évaluation quantitative.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions « aller/ne pas aller » concernant l'avancement des programmes en ingénierie tissulaire et en santé reproductive.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des initiatives de recherche mécanistique et translationnelle.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise dans l'isolement des follicules, l'encapsulation et les techniques de culture en 3D.
- Nécessite un accès à des systèmes de culture rotatifs spécialisés et à une infrastructure analytique pour l'évaluation quantitative.
- Implique une standardisation inter-équipes des tests de viabilité et de l'analyse des marqueurs moléculaires.
- Peut nécessiter des adaptations selon les types de tissus ou les espèces, en fonction de l'objectif de la recherche.
- L'optimisation des paramètres de simulation de microgravité est essentielle pour la fiabilité et la reproductibilité du modèle.
