Actionneur à base de cellules musculaires cardiaques et Biorobot auto-stabilisant - Partie 2

L'objectif général de cette étude est de peupler des dispositifs microfabriqués avec des cellules musculaires cardiaques et de caractériser les propriétés biochimiques et biomécaniques de ces cellules sur les dispositifs, ainsi que leur comportement au fil du temps. La méthode décrite ici peut facilement être modifiée pour d'autres expériences nécessitant une ajout de cellules à haute densité sur des dispositifs microfabriqués. Le principal avantage du bioactionneur développé dans cette vidéo est qu'il peut être facilement adapté pour quantifier les forces de contraction cellulaire de tout autre type cellulaire.

Il peut également être utilisé pour étudier les modifications des caractéristiques biomécaniques des cellules souches lors de leur différenciation. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de semis cellulaire sont difficiles à apprendre uniquement à partir de descriptions textuelles. Elles doivent être réalisées correctement afin de garantir une adhérence confluente des cellules sur les bras en porte-à-faux, ce qui est essentiel pour une fonction biologique adéquate.

La procédure sera démontrée par Neerajha Nagarajan de mon laboratoire. Avec le biorobot, commencez dans le flacon T25. Utilisez un aimant pour le maintenir en place au fond du flacon.

L'aimant n'est pas nécessaire pour les actionneurs biologiques car ils ne se déplaceront pas en raison du poids de la microbille de verre située à la base. Roulez une petite feuille de plastique carrée pour l'utiliser comme entonnoir et placez l'entonnoir stérile au-dessus des actionneurs dans les biorobots. Ajustez le diamètre à l'extrémité la plus large pour qu'il corresponde à l'appareil, ainsi que la hauteur, afin qu'il s'ajuste parfaitement lorsque le bouchon du flacon est vissé.

Utilisez un flacon séparé pour tester et ajuster l'ajustement du cône. Un ajustement étanche du cône garantira qu'il n'y a pas de fuite de cellules dans le reste du milieu, comme mentionné précédemment. Cela est essentiel pour assurer une couverture confluente du bras en porte-à-faux.

Avec le cône en place, resuspendez les cardiomyocytes dans du DMEM complet à une densité de 16 millions de cellules par millilitre et laissez tomber lentement 400 microlitres de la suspension sur les dispositifs à travers chaque cône. Ensuite, replacez lentement les flacons dans l'incubateur sans perturber les dispositifs ni les cônes à l'intérieur. Laissez les cellules s'attacher pendant 24 heures à 37 degrés Celsius.

Après la période d'incubation, retirer lentement l'entonnoir. Laver délicatement les échantillons avec du PBS et remplir chaque flacon avec 10 millilitres de DMEM complet frais. Ensuite, retirer l'aimant du biorobot pour qu'ils flottent, puis replacer les flacons dans l'incubateur.

Installez une caméra équipée d'un objectif zoom dans l'incubateur afin de visualiser les dispositifs en culture. Ensuite, ajoutez une bande lumineuse à LED à utiliser comme source de lumière. Puis, connectez la caméra à un ordinateur et ouvrez le logiciel d'acquisition d'images.

Une fois dans le programme, cliquez sur l'image de la caméra dans l'onglet Fichier pour ouvrir toutes les options de la caméra et sélectionner la caméra connectée. Dans la liste des onglets, choisissez Direct et mettez manuellement l'image au point en ajustant le bouton de mise au point de l'objectif. Ensuite, sélectionnez le recadrage de la région d'intérêt dans le panneau supérieur.

Ensuite, dessinez manuellement un rectangle dans l'image vidéo englobant le dispositif actionneur biologique et les bras en porte-à-faux afin de délimiter la région d'intérêt. Dans le cas des biorobots, capturez tout l'écran afin d'enregistrer le mouvement de nage du dispositif. Ensuite, sélectionnez Paramètres de la caméra et réglez la fréquence d'images en ajustant l'exposition et le rapport pixel de l'image en direct.

Régler la fréquence d'images à environ 30 images par seconde. Enfin, cliquer sur le bouton d'enregistrement pour commencer l'enregistrement des vidéos. Ouvrir le logiciel de programmation en cliquant sur l'icône.

Une fois le logiciel chargé, cliquez sur Fichier, Ouvrir, puis sélectionnez le fichier de script m pour exécuter l'analyse d'image. Assurez-vous que les images TIF enregistrées et leurs versions AVI se trouvent dans le même dossier que le fichier m, puis cliquez sur Exécuter pour lancer le script. Appuyez sur Lecture pour démarrer le programme réel.

Une fois le programme lancé, cliquez sur le bouton Ouvrir et localisez le fichier TIF ou AVI qui va être analysé. Ensuite, cliquez sur le bouton base. Sélectionnez le point où le levier est fixé à la base en haut et appuyez sur Entrée.

Cela placera un marqueur carré sur l'image pour chaque image afin d'indiquer l'emplacement de la base de la console. Ensuite, cliquez sur le bouton d'échelle, puis cliquez manuellement sur un bord de la microbille de verre. Amenez le pointeur de la souris jusqu'au côté opposé de la microbille de verre et appuyez sur Entrée.

Cela tracera une ligne mesurant le diamètre de la perle de verre et mettra en relation ce diamètre avec les pixels affichés. Cliquez sur le bouton Analyser. Ensuite, cliquez le long du levier à une courte distance du premier marqueur carré qui représente la base du levier.

Continuez à cliquer le long du levier, y compris sur la pointe, puis appuyez sur Entrée lorsque vous avez terminé. Cela placera un X sur chaque point cliqué sur le levier. Enfin, vérifiez si le cercle superposé suit correctement le profil du levier.

Si c'est correct, cliquez sur le bouton de l'image suivante. Ceci passera à l'image suivante dans le fichier TIF. Répétez ce processus pour toutes les images.

Une fois que toutes les images ont été traitées, cliquez sur le bouton Exporter. Commencez par ouvrir le logiciel d'analyse d'image et charger le fichier vidéo du biorobot nageur. Ensuite, ouvrez le logiciel de feuille de calcul.

Dans la vidéo du biorobot chargée, repérez une référence de taille, comme la microbille en verre. Utilisez l'outil Droite pour tracer une ligne à travers la microbille en verre. Cliquez ensuite sur Analyser et sélectionnez Définir l'échelle.

Définissez le champ « Distance connue » à 3 000 micromètres et cliquez sur OK. Choisissez un point sur un dispositif qui ne vacille pas entre les images pour servir de marqueur, puis enregistrez les coordonnées X et Y de ce point dans le tableur. Revenez à la fenêtre du logiciel d'analyse d'image et appuyez sur la flèche droite pour passer à l'image suivante. Indiquez à nouveau le marqueur et enregistrez les nouvelles coordonnées X et Y dans le tableur.

Répétez ce processus pour toutes les images et utilisez les données pour analyser le mouvement du biorobot comme décrit dans le protocole accompagnant le texte. Les contraintes statiques et dynamiques de l'actionneur ont été extraites de la contrainte de surface chaque jour. La contrainte statique correspond à la contrainte contractile que les cellules exercent sur la surface à l’état de repos, tandis que la contrainte dynamique est la contrainte générée par les cellules lors de la contraction maximale.

Au fur et à mesure que les cellules maturaient en culture, une augmentation progressive des contraintes statiques et dynamiques a été observée au fil du temps. Elles ont exercé une force de traction cellulaire maximale de 50 millinewtons par mètre et une force de contraction maximale d'environ 165 millinewtons par mètre au sixième jour. Parallèlement aux contraintes statiques et dynamiques, les marqueurs de maturation des cardiomyocytes, de croissance et d'expansion cellulaire, ainsi que de connectivité intercellulaire, augmentent également jusqu'au sixième jour.

Sur la base de l'analyse vidéo, la comparaison de la vitesse moyenne de nage, de la fréquence de battement et de la distance parcourue par coup de nage pour trois biorobots aux profils de nage différents est présentée ici. Bien que les biorobots verticaux aient la fréquence de battement la plus faible, ils présentent la vitesse de nage et la distance parcourue les plus élevées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de semer des cellules musculaires cardiaques sur des dispositifs microfabriqués pouvant fonctionner comme des actionneurs biologiques et des biorobots.

Le processus d'acquisition d'images et d'analyse ultérieure des données décrit dans cette vidéo illustre une méthode pratique pour caractériser le comportement cellulaire ainsi que les performances du dispositif. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que la durée de vie des cardiomyocytes est limitée et que l'activité des cellules atteint un maximum le sixième jour. Après quoi, elle diminue progressivement.