Actionneur à base de cellules musculaires cardiaques et Biorobot auto-stabilisant - Partie 2

L’objectif global de cette étude est de peupler des dispositifs microfabriqués avec des cellules du muscle cardiaque et de caractériser les propriétés biochimiques et biomécaniques des cellules de ces dispositifs ainsi que leur performance au fil du temps. La matière décrite ici peut facilement être modifiée pour d’autres expériences qui nécessitent l’ajout de cellules à haute densité sur des dispositifs microfabriqués. Le principal avantage du bioactionneur développé dans cette vidéo est qu’il peut être facilement adopté pour quantifier les forces de contraction cellulaire de tout autre type de cellule.

Il peut également être utilisé pour étudier les changements dans les caractéristiques biomécaniques des cellules souches lors de leur différenciation. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’ensemencement cellulaire sont difficiles à apprendre avec des descriptions à partir de textes. Ils doivent être effectués correctement pour assurer une fixation confluente des cellules sur les bras en porte-à-faux, ce qui est essentiel pour le bon fonctionnement biologique.

Neerajha Nagarajan de mon laboratoire fera la démonstration de la procédure. Avec le biorobot, commencez dans la fiole T25. Utilisez un aimant pour le maintenir en place au fond de la fiole.

L’aimant n’est pas nécessaire pour les actionneurs biologiques car ils ne bougeront pas en raison du poids de la perle de verre dans la base. Roulez une petite feuille de plastique carrée pour l’utiliser comme entonnoir et placez l’entonnoir stérile sur les actionneurs des biorobots. Ajustez le diamètre à l’extrémité la plus large pour s’adapter à l’appareil et à la hauteur afin qu’il s’adapte parfaitement lorsque le haut de la gourde est serré.

Utilisez une fiole séparée pour tester et ajuster l’ajustement de l’entonnoir. Un bon ajustement de l’entonnoir garantira qu’il n’y a pas de fuite des cellules comme mentionné dans le reste du support. Ceci est essentiel pour fournir une couverture confluente du bras en porte-à-faux.

Une fois l’entonnoir en place, remettez en suspension les cardiomyocytes dans du DMEM complet à une densité de 16 millions de cellules par millilitre et déposez lentement 400 microlitres de suspension sur les dispositifs à travers chaque entonnoir. Ensuite, remettez lentement les flacons dans l’incubateur sans déranger les appareils ou les entonnoirs à l’intérieur. Laissez les cellules se fixer pendant 24 heures à 37 degrés Celsius.

Après la période d’incubation, retirez lentement l’entonnoir. Lavez délicatement les échantillons avec du PBS et remplissez chaque flacon de 10 millilitres de DMEM frais complet. Ensuite, retirez l’aimant du biorobot pour qu’il soit à flot et remettez les flacons dans l’incubateur.

Montez une caméra équipée d’un zoom dans l’incubateur pour visualiser les dispositifs en culture. Ensuite, ajoutez une bande lumineuse LED à utiliser comme source de lumière. Ensuite, connectez l’appareil photo à un ordinateur et ouvrez le programme d’imagerie.

Une fois dans le programme, cliquez sur l’image de la caméra dans l’onglet Fichier pour ouvrir toutes les options de la caméra et choisir la caméra connectée. Dans la liste des onglets, choisissez En direct et mettez manuellement l’image au point en ajustant la molette de l’objectif. Ensuite, sélectionnez recadrage de la région d’intérêt dans le panneau supérieur.

Ensuite, dessinez manuellement un rectangle dans l’image vidéo englobant le dispositif d’actionneur biologique et les bras en porte-à-faux pour marquer la région d’intérêt. Dans le cas des biorobots, capturez tout l’écran afin d’enregistrer le mouvement de nage de l’appareil. Ensuite, sélectionnez Paramètres de l’appareil photo et définissez la fréquence d’images en ajustant l’exposition et le rapport de pixels de l’image en direct.

Réglez les fréquences d’images sur environ 30 images par seconde. Enfin, cliquez sur le bouton d’enregistrement pour commencer à enregistrer les vidéos. Ouvrez le logiciel de programmation en cliquant sur l’icône.

Une fois l’opération chargée, cliquez sur Fichier, Ouvrir et sélectionnez le fichier de script m pour l’exécution de l’analyse d’image. Assurez-vous que les images TIF enregistrées et leurs versions AVI se trouvent dans le même dossier que le fichier m, puis cliquez sur Exécuter pour exécuter le script. Appuyez sur Play pour démarrer le programme proprement dit.

Une fois en cours d’exécution, cliquez sur le bouton Ouvrir et localisez le fichier TIF ou AVI qui va être analysé. Ensuite, cliquez sur le bouton de base. Sélectionnez le point où le porte-à-faux se fixe à la base en haut et appuyez sur Entrée.

Cela placera un marqueur carré sur l’image pour chaque cadre afin d’indiquer l’emplacement de la base en porte-à-faux. Ensuite, cliquez sur le bouton d’échelle, puis cliquez manuellement sur un bord de la perle de verre. Placez le pointeur de la souris sur le côté opposé de la perle de verre et appuyez sur Entrée.

Cela tracera une ligne qui mesure le diamètre de la perle de verre et reliera le diamètre aux pixels affichés. Cliquez sur le bouton Analyser. Ensuite, cliquez le long du porte-à-faux à une courte distance du premier marqueur carré qui représente la base du porte-à-faux.

Continuez à cliquer le long du porte-à-faux, y compris la pointe, et appuyez sur Entrée lorsque vous avez terminé. Cela placera un X sur chaque point cliqué sur le porte-à-faux. Enfin, vérifiez si le cercle superposé trace correctement le profil en porte-à-faux.

Si c’est le cas, cliquez sur le bouton de l’image suivante. Cela passera à l’image suivante dans le fichier TIF. Répétez ce processus pour tous les cadres.

Une fois que tous les cadres ont été traités, cliquez sur le bouton Exporter. Commencez par ouvrir le logiciel d’analyse d’images et charger le fichier vidéo du biorobot nageur. Ensuite, ouvrez le tableur.

Dans la vidéo du biorobot chargée, localisez une référence de taille telle que la perle de verre. Utilisez l’outil Droit pour tracer une ligne sur la perle de verre. Cliquez ensuite sur Analyser et sélectionnez Définir l’échelle.

Définissez le champ Distance connue sur 3 000 micromètres et cliquez sur OK. Choisissez un point sur un appareil qui ne vacille pas entre les images pour servir de marqueur et enregistrez les coordonnées X et Y de ce point sur la feuille de calcul. Revenez à la fenêtre du logiciel d’analyse d’images et appuyez sur la touche fléchée droite pour passer à l’image suivante. Pointez à nouveau sur le marqueur et notez les nouvelles coordonnées X et Y sur la feuille de calcul.

Répétez ce processus pour toutes les images et utilisez les données pour analyser le mouvement du biorobot comme décrit dans le protocole texte ci-joint. Les contraintes statiques et dynamiques de l’actionneur ont été extraites chaque jour des contraintes de surface. Le stress statique est le stress contractile que les cellules présentent à la surface à l’état de repos et le stress dynamique est le stress généré par les cellules à la contraction maximale.

Au fur et à mesure que les cellules mûrissaient en culture, une augmentation progressive des contraintes statiques et dynamiques a été observée au fil du temps. Ils ont montré une force de traction cellulaire maximale de 50 millinewtons par mètre et une force de contraction maximale d’environ 165 millinewtons par mètre le sixième jour. Parallèlement aux stress statiques et dynamiques, les marqueurs de la maturation, de la croissance et de l’étalement des cardiomyocytes, ainsi que de l’interconnectivité cellulaire augmentent également jusqu’au sixième jour.

Sur la base de l’analyse vidéo, la comparaison de la vitesse moyenne de nage, de la fréquence des battements et de la distance parcourue par coup pour trois biorobots avec des profils de nage différents est présentée ici. Bien que les biorobots verticaux aient la plus petite fréquence de battement, ils présentaient la vitesse de nage et la distance parcourues les plus élevées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’ensemencer des cellules musculaires cardiaques sur des dispositifs microfabriqués qui pourraient fonctionner comme des actionneurs biologiques et des biorobots.

Le processus d’acquisition d’images et d’analyse ultérieure des données décrit dans cette vidéo démontre un moyen pratique de caractériser le comportement de la cellule ainsi que les performances du dispositif. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la durée de vie des cardiomyocytes est limitée et que l’activité des cellules atteint son apogée le sixième jour. Après quoi, il diminue avec le temps.