Name: Imagerie en cellules vivantes de la dégranulation et de la sécrétion de plaquettes sous le flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Découvrez l'imagerie en cellules vivantes pour étudier la dégranulation et la sécrétion plaquettaire sous flux. Cette méthode permet d'analyser le contenu subcellulaire des plaquettes en temps réel pour la recherche sur la thrombose et l'hémostase.

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Dans le monde entier, la thrombose est la principale cause de décès et de morbidité, et les plaquettes jouent un rôle central dans son développement. Ce travail décrit une méthode pour l&#39;imagerie des cellules vivantes de la dégranulation des plaquettes sous l&#39;écoulement. On suppose généralement que, lorsque les plaquettes deviennent activées, tout le contenu granulaire est directement rejeté dans la solution. Les résultats qui l&#39;accompagnent suggèrent que ce n&#39;est pas nécessairement le cas. Pendant l&#39...

Les plaquettes sont des cellules anucléaires qui circulent dans la circulation sanguine. Leur principale fonction est de sceller les brèches vasculaires sur les sites de blessures et de prévenir la perte de sang. Chez ces sites de blessure, les fibres de collagène sous-endothéliales sont exposées et sont ensuite couvertes par la protéine multimérique, le facteur von Willebrand (VWF). Le VWF interagit avec les plaquettes en circulation dans un mécanisme qui dépend du complexe glycoprotéine Ibα-IX-V sur la surface cellulaire 1 , ralentissant la vitesse des plaquettes. Ceci est particulièrement important à des taux de cisaillement élevés. Les plaquettes subissent ensuite des changements morphologiques tout en recevant des impulsions d&#39;activation du collagène. Cela conduit à une propagation irréversible et éventuellement à l&#39;agrégation plaquettaire. Les deux processus dépendent de la sécrétion du contenu en granulés pour faciliter la diaphonie plaquettaire-plaquettaire. Entre autres, les granulés α plaquettaires contiennent du fibrinogène et du VWF pour faciliter l&#39;adhérence plaquettaire et le pontLes plaquettes ensemble d&#39;une manière dépendante de l&#39;intégrine. Les granules plaquettes et denses contiennent des composés inorganiques 2 , y compris le diphosphate de calcium et d&#39;adénosine (ADP), qui contribuent à renforcer l&#39;activation des plaquettes. En outre, les plaquettes contiennent des médiateurs de l&#39;inflammation (allergique) 3 , des protéines 4 du contrôle du complément et des facteurs 5 , 6 de l&#39; angiogenèse, ce qui soulève la question de savoir si ces contenus sont diffusés différemment dans des conditions variables. Depuis les années 1980, l&#39;étude de la fonction plaquettaire dans les modèles de flux a été précieuse pour l&#39;étude des mécanismes thrombotiques 7 . Depuis lors, de nombreux progrès techniques ont été réalisés, et les modèles de flux qui incluent la formation de fibrine sont actuellement développés pour évaluer le potentiel hémostatique des concentrés thérapeutiques plaquettaires ex vivo 8 ou àÉtudier l&#39;influence des perturbations dans les taux de cisaillement sur la morphologie du thrombus 9 . Les différences dans les mécanismes moléculaires et biologiques cellulaires qui favorisent une adhérence stable et une formation de thrombus physiologique (hémostase) par rapport à la formation de thrombus pathologique (thrombose) peuvent être très subtiles et motiver le développement de modèles d&#39;écoulement permettant la visualisation en temps réel de ces sous-cellulaires Processus. Un exemple d&#39;un processus pour lequel une telle configuration serait précieuse est la (re) distribution du polyphosphate intracellulaire et le recrutement de facteurs de coagulation pour découvrir l&#39;impact dépendant du temps que cela a sur l&#39;ultrastructure de la fibrine 10 . Les études sont souvent limitées aux analyses finales. L&#39;objectif principal de la méthode décrite est de permettre l&#39;étude visuelle en temps réel des processus subcellulaires dynamiques qui se déroulent lors de l&#39;activation plaquettaire sous flux.

<table><tbody><tr><td>Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES)&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck KGaA</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Merck KGaA</td><td>1.04074</td><td></td></tr><tr><td>Prostacycline&nbsp ;</td><td>Cayman Chemical</td><td>18220</td><td></td></tr><tr><td>Citrate tri-sodique</td><td>Merck KGaA</td><td>1.06448</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique&nbsp ;</td><td>Merck KGaA</td><td>1.00244</td><td></td></tr><tr><td>Lunettes de protection</td><td>Menzel-Gl&auml ; ser</td><td>BBAD02400500#A</td><td>24 x 50 mm, n° 1 = 0,13 - 0,16 mm d’épaisseur.</td></tr><tr><td>Acide chromosulfurique (2 % CrO3)</td><td>Riedel de Haen</td><td>07404</td><td>CAS [65272-70-0].</td></tr><tr><td>Facteur de von Willebrand (VWF)</td><td>Laboratoires de recherche sur</td> l’enzyme de fibrinogène purifié <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>en interne FIB3L</td><td></td></tr><tr><td>Plat à 4 puits, non traité</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique humaine Fraction V</td><td>Haem Technologies Inc.</td><td></td><td></td>823022</tr><tr><td>Tubes de prélèvement sanguin, 9 mL, 9NC Citrate de sodium de coagulation 3,2 %</td>Analyseur <td>de cellules 455322</td><td></td> <td>Greiner Bio-One</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Abbott Diagnostics</td><td>CELL-DYN analyseur</td><td></td>d’hématologie</tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>30525-89-4&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>Harvard apparatus 22</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 10 mL avec 14,5 mm de diamètre</td><td>BD biosciences</td><td>305959</td><td>Seringue Luer-Lok</td></tr><tr><td>Anti-CD63-biotine&nbsp ;</td><td>Abcam&nbsp ;</td><td></td><td></td>AB134331</tr><tr><td>Anti-CD62P-biotine&nbsp ;</td><td>R& D Systems</td><td>Dy137</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-dichlorhydrate de phénylindole (DAPI)</td><td>Polysciences Inc.&nbsp ;</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine, Alexa Fluor 488 conjugué</td><td>Thermo Scientific</td><td>S11223&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Huile d’immersion</td><td>Zeiss</td><td>444963-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Solution détergente</td><td>Unilever, Biotex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>56-40-6&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Alcool polyvinylique</td><td>Sigma</td><td>9002-89-5</td><td>Mowiol 40-88.</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de Tris</td><td>Sigma</td><td>1185-53-1&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)</td><td>Sigma</td><td>280-57-9</td><td></td></tr><tr><td>Mouton Anti-hVWF pAb</td><td>Abcam&nbsp ;</td><td>AB9378</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Film Parafinn</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>Rouleau de 4 po x 125 pi.</td></tr><tr><td>Feuille de silicone non renforcée</td><td>Nagor</td><td>NA 500-1</td><td>200 mm x 150 mm x 0,125 mm.</td></tr><tr><td>Feuille de silicone découpée sur mesure avec canaux de perfusion et de vide</td><td>fabriquée</td><td></td> en interne <td>Fabriqué en feuille de silicone non renforcée (Nagor, NA 500-1)</td></tr><tr><td>Tubes de 1,5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>T9661-1000AE</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>Zeiss Observer Z1&nbsp ;</td><td></td><td>Equipé de lumières d’excitation LED.</td></tr><tr><td>Logiciel de microscope</td><td>Zeiss ZEN 2</td><td>blue edition</td><td></td></tr><tr><td>18 G aiguille (18 G x 1 1/2")</td><td>BD biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Riedel de Haen</td><td>31248375</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>10708976</td><td></td></tr><tr><td>Pipette pasteur en plastique</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>&nbsp ; 7 mL non stérile, gradué jusqu’à 3 mL.</td></tr><tr><td>Tube en silicone</td><td>VWR</td><td>228-0656</td><td>Diamètre intérieur. x Diamètre extérieur x Épaisseur de la paroi = 1,02 x 2,16 x 0,57 mm.</td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Thermo Scientific</td><td>ABAA000001##12E</td><td>76 x 26 x 1 mm, bords rectifiés 45 &deg ;, extrémité givrée.</td></tr></tbody></table>

imagerie en cellules vivantes de la dégranulation et de la sécrétion de plaquettes sous le flux

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Les plaquettes de sang sont des acteurs essentiels de l&#39;hémostase, la formation de thrombi pour sceller les brèches vasculaires. Ils sont également impliqués dans la thrombose, la formation de thrombus qui entouent le système vasculaire et blessent les organes, avec des conséquences potentiellement mortelles. Cela motive la recherche scientifique sur la fonction plaquettaire et le développement de méthodes pour suivre les processus biologiques cellulaires lorsqu&#39;ils se produisent dans des conditions d&#39;écoulement. Une variété de modèles d&#39;écoulement sont disponibles pour l&#39;étude de l&#39;adhésion et de l&#39;agrégation des plaquettes, deux phénomènes clés de la biologie des plaquettes. Ce travail décrit une méthode pour étudier la dégranulation des plaques en temps réel sous l&#39;écoulement pendant l&#39;activation. La méthode utilise une chambre d&#39;écoulement couplée à une installation de pompe à seringue qui est placée sous un microscope à fluorescence à large spectre à base de LED. La configuration décrite ici permet l&#39;excitation simultanée de multiples fluorophores qui sont délivrés par des anticorps marqués par fluorescence ou fluorescDes colorants. Après les expériences d&#39;imagerie des cellules vivantes, les lunettes de couverture peuvent être traitées et analysées à l&#39;aide d&#39;une microscopie statique (microscopie confocale ou microscopie électronique à balayage).

La figure 1 montre les images de la chambre d&#39;écoulement et la configuration expérimentale; La position et les dimensions de la feuille de silicium; Et les connexions de tubes. La figure 2 fournit des détails sur les dimensions de la chambre d&#39;écoulement. La figure 3 et le film 1 montrent une série temporelle d&#39;images d&#39;adhésion et d&#39;étalement des plaquettes sur ...

Ce travail décrit une méthode à base de microscopie à fluorescence pour l&#39;étude de l&#39;adhérence plaquettaire, de la propagation et de la sécrétion sous l&#39;écoulement. Cette plate-forme polyvalente permet l&#39;étude de la fonction plaquettaire pour la recherche mécanistique sur la thrombose et l&#39;hémostase.

Imagerie en cellules vivantes de la dégranulation et de la sécrétion de plaquettes sous le flux

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

L'objectif général de cette expérience est de suivre la dégranulation et la sécrétion des plaquettes sous flux à l'aide de l'imagerie de cellules vivantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des plaquettes. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une investigation polyvalente du contenu des plaquettes au niveau subcellulaire dans des cellules vivantes.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la fonction des plaquettes, elle peut également être appliquée à d'autres types cellulaires, comme les mastocytes. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés en raison de problèmes liés à l'isolement des plaquettes sous une forme de préactivation. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons réalisé que la sécrétion plaquettaire ne pouvait être évaluée qu'aux stades terminaux.Les images en temps réel fournissent des informations sur la cinétique de libération des granules plaquettaires. La procédure d'isolement des plaquettes sera démontrée par Silvia Pignatelli, étudiante dans notre institut. Ensuite, Arjan Barendrecht démontrera les expériences d'imagerie en temps réel.Pour commencer, dégraissez les lamelles en les incubant toute la nuit dans de l'acide chromosulfurique non dilué. Le lendemain, rincez-les à l'eau distillée. Puis placez-les toute la nuit à 60 degrés Celsius dans une étuve pour les sécher.Ensuite, déposez une goutte d'eau sur un plan de travail de laboratoire et appliquez une bande de film de paraffine de 10 centimètres sur 15 centimètres sur la goutte en éliminant l'air entre le plan de travail et le film. Puis, pipetez des gouttes de 80 µL de facteur de von Willebrand à 10 µg/mL ou de fibrinogène à 100 µg/mL sur le film de paraffine. Placez des lamelles sèches sur les gouttes et incubez pendant une heure et demie à température ambiante.Ensuite, ajoutez trois millilitres de tampon de blocage dans chaque puits d'une plaque à quatre puits. Transférez les lamelles avec le côté revêtu vers le haut dans des puits individuels de la plaque. Incubez-les toute la nuit à quatre degrés Celsius.Centrifuger neuf millilitres de sang total citraté pendant 15 minutes à 160 fois g sans interruption. Ensuite, utiliser une pipette Pasteur en plastique pour recueillir le surnageant contenant le plasma riche en plaquettes. Ajouter une part d'acide citrate dextrose à neuf parts de plaquettes en volume afin d'empêcher la préactivation des plaquettes.Ensuite, centrifuger les plaquettes pendant 15 minutes à 400 ×g sans frein. Puis, retirer le surnageant, en laissant un culot de plaquettes. Resuspendre ensuite soigneusement le culot dans du tampon HEPES Tyrode à un pH de 6,5 jusqu'au volume initial de l'échantillon de plaquettes.Ensuite, ajoutez de la prostacycline aux plaquettes resuspendues. Centrifugez immédiatement l'échantillon, puis retirez le surnageant. Resuspendez délicatement le culot dans un tampon HEPES Tyrode à un pH de 7,4.Ensuite, placer les plaquettes lavées dans un analyseur cellulaire et dénombrer le nombre de plaquettes. Ajuster le nombre de plaquettes dans l'échantillon à une concentration de 150 000 plaquettes par microlitre à l'aide de tampon HEPES Tyrode à un pH de 7,4. Après la resuspension, laisser les plaquettes se reposer pendant 30 minutes à température ambiante avant l'expérience.Couvrez la partie supérieure de la chambre d'écoulement avec de l'eau distillée et placez une feuille de silicone personnalisée, côté lisse vers le bas, sur l'eau. Positionnez la feuille en flottation en éliminant l'excès d'eau tout en maintenant la feuille en place. Incubez la chambre d'écoulement pendant une heure à 60 degrés Celsius afin d'évaporer l'eau résiduelle et de fixer fermement la feuille de silicone sur la chambre d'écoulement.Avec la pipette Pasteur en plastique, ajoutez une goutte de tampon HEPES Tyrode à un pH de 7,4 sur le canal d'écoulement. Ensuite, placez le verre de couverture préparé, côté revêtu vers le bas, sur le canal d'écoulement. Allumez la pompe à vide à une pression d'environ 10 kilopascals et reliez la pompe à vide à la connexion de vide de la chambre d'écoulement.Ajouter 10 microgrammes par millilitre de colorant DAPI aux plaquettes lavées, puis envelopper le tube contenant les plaquettes dans du papier d’aluminium. Incuber ensuite pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Pour prévenir l’activation des plaquettes, ajouter de la prostacycline à une concentration finale de 10 nanogrammes par millilitre et centrifuger immédiatement les plaquettes pendant 15 minutes à 400 ×g sans utiliser le frein, afin d’éliminer le DAPI non lié.Resuspendre le culot de plaquettes dans du tampon HEPES Tyrode à un pH de 7,4 jusqu'au volume initial, avec une concentration de 150 000 plaquettes par microlitre. Ensuite, allumer le microscope à fluorescence et charger le logiciel du microscope. Configurer les paramètres d'acquisition d'images comme décrit dans le tableau 1 du protocole texte accompagnant.Bloquez le tube d'entrée en connectant une seringue de 10 millilitres et en aspirant du tampon de blocage dans le tube d'entrée. Incubez 15 minutes à température ambiante, puis rincez le tube d'entrée en aspirant du tampon HEPES Tyrode 7,4 dans le tube d'entrée. Connectez le tube d'entrée bloqué et le tube de sortie non traité respectivement à l'entrée et à la sortie de la chambre.Ensuite, connectez la seringue de 10 millilitres au tube de sortie. Déposez une goutte d'huile à immersion sur un objectif de 100 fois et fixez la chambre sur le microscope avec la surface en verre orientée vers le bas. Puis, placez le tube d'entrée dans un tube contenant du tampon HEPES Tyrode à un pH de 7,4.Tirer manuellement le piston de la seringue reliée au tube de sortie afin de faire passer la solution à travers la chambre et d'éliminer l'air du système. Ensuite, placer la seringue dans la pompe à seringue et faire fonctionner brièvement la pompe pour serrer le piston et assurer un débit stable. Une fois le système d'écoulement prêt, ajouter les anticorps et/ou les colorants à la suspension de plaquettes et mélanger délicatement.Ensuite, pincez le tube d'entrée et déplacez-le du tampon vers le tube contenant les plaquettes marquées. Sélectionnez la visualisation en temps réel dans le logiciel. Mettez au point le microscope sur la surface du coverslip et démarrez la pompe à 484 microlitres par minute.Faites fonctionner la pompe jusqu'à ce que les plaquettes atteignent la chambre d'écoulement. Ensuite, réduisez le débit à 7,5 microlitres par minute. Surveillez la surface du coverslip.Dès qu'un premier plaquette commence à adhérer, focalisez le microscope sur cette plaquette et démarrez l'enregistrement en lançant l'expérience dans le logiciel. Enregistrez pendant 30 minutes, puis arrêtez la pompe à seringue. Enregistrez les fichiers bruts du microscope contenant toutes les métadonnées.Si nécessaire, exporter les vidéos au format MOV H 264 compressé ou AVI non compressé. Enregistrer les images individuelles sous forme de fichiers JPEG ou TIF. Une fois l'acquisition terminée, retirer la chambre du microscope, nettoyer l'huile à immersion du verre, déconnecter le vide et retirer soigneusement le coverslip de la chambre à l’aide d’une aiguille de calibre 18.Placer la lame de couverture avec les cellules orientées vers le haut dans une nouvelle plaque à quatre puits, sur un tampon préhumidifié avec de l'eau distillée. Ensuite, pipeter 750 microlitres de solution fixatrice sur la lame de couverture et incuber pendant une heure à température ambiante à l'abri de la lumière. Si les échantillons ne peuvent pas être analysés directement, les conserver dans du paraformaldéhyde à 0,5 % à quatre degrés Celsius afin d'assurer une fixation stable.Ceci montre la série temporelle de l'adhésion et de l'aplatissement des plaquettes sur des lames de verre revêtues de facteur de von Willebrand immobilisé. En vert, on observe le CD63, une protéine transmembranaire qui est mobilisée à la surface des plaquettes de manière dépendante du temps. De même, en orange, la P-sélectine est également une protéine transmembranaire insérée dans la membrane des granules alpha intracellulaires, qui piègent les plaquettes.Après une expérience de flux, la microscopie à fluorescence confocale peut être utilisée pour produire une série de clichés inclinés de l'adhésion des plaquettes. Ici, on observe que le CD63 se localise principalement au niveau du granulomère central, tandis que la P-sélectine est répartie sur l'ensemble du corps cellulaire et semble concentrée aux bords. Dans ces expériences, les plaquettes, qui ne possèdent pas d'ADN nucléaire, ont été préincubées avec du DAPI, qui apparaît en bleu.Dans ce cas, le DAPI colore les polyphosphates et les granules denses. La coloration verte apparaissant ultérieurement correspond à la mobilisation dépendante du temps du CD63 à la surface des plaquettes. Malgré des signes évidents de libération des granules denses, l'analyse au niveau cellulaire unique montre que le polyphosphate est conservé à l'intérieur ou à l'extérieur de ces plaquettes.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six heures pour quatre expériences d'écoulement individuelles. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'éviter la préactivation des plaquettes, ce qui peut être obtenu par une manipulation soigneuse de la suspension cellulaire.Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la microscopie confocale peuvent être utilisées pour obtenir des informations supplémentaires sur la distribution tridimensionnelle des molécules cibles. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier la fonction des plaquettes sous flux au niveau de la cellule unique.

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