Détermination de l'anticorps-antigène à haute affinité de liaison Kinetics En utilisant quatre plates-formes biocapteurs

L’objectif de cette étude sur les biocapteurs est de comparer la capacité des quatre plateformes de biocapteurs couramment utilisées à fournir des données cinétiques de qualité et de fournir des informations sur les défis techniques et les considérations dans les conceptions expérimentales pour évaluer les interactions anticorps-antigène de haute affinité. Cette étude répond à des questions clés dans le domaine de la découverte de médicaments pour la sélection de plateformes de biocapteurs et de formats de test permettant les résultats les plus fiables lors de l’évaluation des anticorps thérapeutiques candidats. Le principal avantage de cette étude est qu’elle permet une comparaison directe et complète des différentes plateformes de biocapteurs, en ce qui concerne la cohérence des données, la qualité et l’efficacité opérationnelle.

La démonstration vidéo des quatre protocoles est essentielle, car elle aide les nouveaux utilisateurs ayant peu d’expérience pratique à apprendre à mettre en place des expériences sur ces instruments. Pour les mesures cinétiques dans le Biacore T100, cliquez sur Fichier, Ouvrir une nouvelle méthode, puis ouvrez le fichier de méthode. Examinez les paramètres de la méthode.

Dans Types de cycles, réglez le temps de contact sur 220 secondes pour la capture 1 sur le chemin d’écoulement 2, 110 secondes pour la capture 2 sur le chemin d’écoulement 3 et 55 secondes pour la capture 3 sur le chemin d’écoulement 4. Le débit est de 10 microlitres par minute pour tous les cycles de capture. Sélectionnez l’échantillon 1 et vérifiez l’exemple de solution en tant que variable.

Ensuite, réglez le temps de contact sur 600 secondes et le temps de dissociation sur 2 700 secondes sur les voies d’écoulement 1, 2, 3, 4. Le débit est réglé à 30 microlitres par minute. Ensuite, sélectionnez Régénération 1, entrez le HCl de glycine pH 1,5 dans le champ de solution et réglez le temps de contact sur 20 secondes sur le chemin d’écoulement 1, 2, 3, 4.

Dans les paramètres variables, entrez les concentrations de titrage doubles de 100 nanomolaires à 6,25 nanomolaires pour les cycles 1 à 3, de 50 nanomolaires à 3,12 nanomolaires pour les cycles 4 à 8 et de 5 nanomolaires à 0,323 nanomolaires pour les cycles 9 et 10. Dans Setup Run, choisissez le chemin de flux de détection 2-1, 3-1, 4-1, puis cliquez sur Suivant. Vérifiez prime avant d’exécuter, puis cliquez à nouveau sur Suivant.

Sélectionnez Rack d’échantillons et de réactifs 1 et définissez l’emplacement des réactifs. Pipetez les réactifs dans les différents flacons d’échantillon en conséquence et insérez le rack dans l’instrument. Cliquez sur Éjecter le rack pour ouvrir la porte du compartiment du plateau d’échantillons, puis insérez le rack d’échantillons dans l’instrument.

Cliquez ensuite sur Démarrer et entrez le nom d’une expérience à enregistrer pour démarrer l’exécution. Pour les mesures cinétiques dans le ProteOn XPR36, commencez l’immobilisation en sélectionnant Protocoles, puis Échantillons. Définir l’EDC/Sulfo-NHS comme activateur dans les puits H1-H6, la protéine A/G comme ligand dans les puits G1-G6, l’éthanolamine comme désactivateur dans les puits F1-F6, la glycine comme régénératrice dans E1-E6, le PBS-T-EDTA comme blanc dans D1-D6, l’échantillon d’anticorps monoclonal X comme ligand dans C1-C6 et la PCSK9 humaine comme analyte dans les puits B1-B6.

Sélectionnez Étapes, puis double-cliquez sur Immobilisation dans l’éditeur de protocole. Les étapes comprennent trois injections horizontales ultérieures d’EDC/Sulfo-NHS, de protéine A/G et d’une molaire d’éthanolamine. Chaque injection doit avoir un débit de 30 microlitres par minute et un temps de contact de 300 secondes.

Ensuite, cliquez sur Régénérer. Injectez trois impulsions de 18 secondes de glycine à 100 microlitres par minute dans les directions horizontale et verticale. Poursuivez avec deux impulsions de 60 secondes de PBS-T-EDTA à 25 microlitres par minute, également dans les deux sens.

Ensuite, cliquez sur Ligand et injectez l’anticorps monoclonal 1, l’anticorps monoclonal 2 dans le sens vertical, en utilisant un débit de 25 microlitres par minute et un temps de contact de 160 secondes. Après avoir cliqué sur Analyte, injectez simultanément cinq concentrations de PCSK9 humain dans un tampon vide sur six canaux horizontaux. Utiliser 40 microlitres par minute pendant 600 secondes de temps d’association, suivi de 2 700 secondes de temps de dissociation.

Ensuite, cliquez sur Régénérer et injectez deux impulsions de 18 secondes de glycine à 100 microlitres par minute dans les directions horizontale et verticale. Ensuite, préparez les échantillons et les réactifs dans une plaque à 96 puits selon les positions de réactifs définies. Transférez la plaque sur l’instrument, puis cliquez sur l’onglet Exécuter, sélectionnez le protocole, puis cliquez sur Démarrer.

L’injection parallèle à six aiguilles dans l’enregistrement de données expérimentales en direct est démontrée. Pour les mesures cinétiques dans l’Octet RED384, configurez la méthode expérimentale en cliquant d’abord sur Expérience, puis sur Assistant Nouvelle expérience, Nouvelle expérience Cinétique, puis Cinétique de base dans le logiciel d’acquisition de données. Cliquez ensuite sur Modifier les plaques et remplacez 96 Puits par 384 Puits dans les plaques 1 et 2.

Définissez les types d’échantillons et les positions dans la plaque comme décrit dans le protocole texte. Naviguez jusqu’à la définition du test pour définir la configuration expérimentale. Le dispositif expérimental est défini comme un temps de référence de 30 secondes, un temps de régénération de 30 secondes, un temps d’équilibre de 18 secondes, un chargement avec un temps de 200 secondes, un temps d’association de 500 secondes et un temps de dissociation de 1 800 secondes.

La vitesse de secousse est réglée sur 1 000 tr/min. Pour ajouter les étapes à la liste des étapes de test, cliquez d’abord sur une étape, puis cliquez sur les puits situés dans l’échantillon ou la plaque de réactif. Tout d’abord, entrez dans les instructions de régénération d’équilibrage pour préconditionner les capteurs de capture Fc anti-humains par trois cycles de trempettes de 15 secondes dans la glycine alternant avec des baisses de 15 secondes dans 1XKB.

Ensuite, entrez les instructions de chargement pour capturer les échantillons d’anticorps monoclonaux sur les capteurs de capture Fc anti-humains pendant 200 secondes. Ensuite, entrez les instructions de base pour établir le signal d’interférométrie de la biocouche pendant 60 secondes avant l’étape d’association. Entrez l’étape d’association pour plonger les capteurs dans des puits contenant des concentrations variables de PCSK9 humain pendant une période d’association de 500 secondes.

Entrez dans l’étape de dissociation pour plonger les capteurs liés à PCSK9 dans de nouveaux puits de 1XKB pendant une période de dissociation de 1 800 secondes. Enfin, pour l’étape de régénération, plongez les capteurs d’anticorps monoclonaux liés à PCSK9 dans des puits de glycine avec deux impulsions de 18 secondes entre chaque cycle de liaison. Allez dans Examiner les expériences, faites défiler les étapes, puis cliquez sur le bouton vert Ouvrir pour ouvrir le compartiment d’échantillons.

Transférez les plaques d’échantillon dans l’instrument. Accédez à Exécuter des expériences, entrez un délai de 60 secondes et secouez la plaque d’échantillon pendant que vous attendez. Réglez la température de la plaque sur 25 degrés Celsius, entrez le nom de l’expérience, puis appuyez sur Go.Live la collecte de données s’affiche ici.

Pour les mesures cinétiques multicycles dans l’IBIS-MX96, installez la puce du capteur dans le microspotter à flux continu. Ouvrez le logiciel CFM2.0, puis cliquez sur Paramètres de chargement et sur Couple d’amines 96. Placez les deux plaques d’échantillon et de réactif dans l’imprimante CFM.

Pour créer la matrice d’anticorps, appuyez sur Exécuter pour démarrer l’imprimante et délivrez l’EDC/Sulfo-NHS dans la moitié supérieure de la plaque de réactif au capteur à l’aide de 48 microcanaux et faites-les circuler sur la surface du capteur pendant cinq minutes. Livrez les échantillons d’anticorps monoclonaux dans la moitié supérieure de la plaque source au capteur et faites-les circuler sur les surfaces activées pendant 10 minutes. Ensuite, appliquez le tampon d’immobilisation à partir d’un tube conique de 50 millilitres sur la surface de l’anticorps pendant cinq minutes.

Connectez la puce de capteur imprimée à l’instrument. Dans le logiciel de contrôle, cliquez sur Fichier, Ouvrir la mesure, Mesure existante et sélectionnez le fichier de méthode. Transférez la puce du capteur imprimée dans l’instrument.

Dans le menu général, sélectionnez G-System Prime sous Script système complet. Ensuite, sélectionnez G-Quench pour désactiver les surfaces des anticorps monoclonaux en injectant 150 microlitres d’éthanolamine molaire. Dans Analysis Cycle, sélectionnez A-AP Standard Run sous IBIS Scripts.

Réglez 1,0 minute pour la ligne de base, 10,0 minutes pour l’association et 90 pas pour la dissociation à une vitesse de huit microlitres par seconde. À l’intérieur des cycles, injectez de la PCSK9 humaine une concentration à la fois, après cinq injections de tampon. Régénérer les surfaces des anticorps monoclonaux avec de la glycine entre chaque cycle de liaison.

Des capteurs de liaison enregistrés dans des superpositions d’ajustement de modèle cinétique individuel sont montrés pour les anticorps interagissant avec PCSK9 humain dans quatre instruments. Les profils de liaison des anticorps à plusieurs densités sont similaires dans tous les instruments. Même si les constantes de vitesse associées à chacun des anticorps variaient d’un instrument à l’autre, leurs ordres de classement sont restés essentiellement les mêmes.

La reproductibilité et la cohérence des affinités des taux cinétiques sur plusieurs surfaces d’anticorps ont été étudiées. Comme le montre ici, une forte linéarité a été observée pour toutes les constantes de vitesse générées à l’aide du Biacore T100 et du ProteOn XPR36. Cependant, les constantes de vitesse générées par l’octet RED384 étaient moins linéaires en raison des fluctuations de certains des taux désactivés.

Cela a potentiellement été causé par l’évaporation de l’échantillon au fil du temps dans la microplaque. Les constantes de vitesse générées par l’IBIS-MX96 étaient également moins linéaires en raison des fluctuations des hétérogénéités de surface. Les activités de liaison aux anticorps associées à la plupart des systèmes étaient constantes, tandis qu’une activité environ dix fois plus faible a été observée pour la méthode couplée aux amines de l’IBIS-MX96.

Cela était peut-être dû à l’inactivation des anticorps ou à la génération d’orientations d’anticorps qui n’étaient pas conductrices à la liaison de l’antigène. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en place des expériences dans chacune des quatre plates-formes de biocapteurs, et comment sélectionner la technologie de biocapteur appropriée à vos propres fins de recherche. Notre étude comparative montre que chaque plate-forme de biocapteurs a ses propres avantages et inconvénients.

Malgré certaines limitations systématiques inhérentes à l’instrumentation, l’ordre direct des constantes de taux d’association et de dissociation était fortement corrélé entre ces instruments. Aux fins du classement des candidats, en supposant que le nombre d’échantillons et la quantité de matériaux ne sont pas des facteurs limitatifs, n’importe lequel de ces instruments peut être utilisé, car il permet de différencier les anticorps de manière comparable, quel que soit l’instrument importé. Il existe un compromis entre la fiabilité des données et le débit d’échantillons.

Le Biacore T100, suivi du ProteOn XPR36R, a présenté la meilleure qualité et la meilleure cohérence des données. Alors que l’Octet RED384 et l’IBIS-MX96 font preuve d’une flexibilité et d’un débit élevés, avec des compromis en matière de précision et de cohérence des données. Pour les études qui nécessitent une détection sensible et fiable, le Biacore T100 ou le ProteOn XPR36 sont les mieux adaptés.

Pour les études dans lesquelles la vitesse est un facteur critique et où un grand nombre d’échantillons sont impliqués, l’Octet Red384 ou l’IBIS-MX96 est préféré. Les instruments avec le fluide à écoulement continu X fournissent des données de haute qualité pour résoudre les interactions avec des taux de dissociation lents. La principale limitation de l’instrument BRI fluid ex-a-fray est l’évaporation de l’échantillon au fil du temps dans la microplaque, ce qui peut entraîner une dérive vers le haut, compromettant la précision des données.