Name: Détermination de lanticorps-antigène à haute affinité de liaison Kinetics En utilisant quatre plates-formes biocapteurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Apprenez à mesurer la cinétique de liaison anticorps-antigène à haute affinité sur quatre plateformes de biocapteurs. Cette étude compare Biacore T100, ProteOn XPR36, Octet RED384 et IBIS-MX96 pour guider votre choix.

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Les auteurs remercient Noah Ditto et Adam Miles d&#39;assistance technique sur le IBIS MX96.

<ol><li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+biosensors+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Optical biosensors in drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).</li>
<li>Van Regenmortel, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antigen-antibody+interactions+with+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Rec%22%5BJournal%5D)">Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors.</a> J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).</li>
<li>Davidoff, S. N., Ditto, N. T., Brooks, A. E., Eckman, J., Brooks, B. D. Surface Plasmon Resonance for Therapeutic Antibody Characterization. Label-Free Biosensor Methods in Drug Discovery. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3">http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3</a> 35-76 (2015).</li>
<li>Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+screening+of+antibodies+from+crude+hybridoma+samples+using+Biacore%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore.</a> Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).</li>
<li>Katsamba, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+high-affinity+antibody%2Fantigen+interaction+performed+by+multiple+Biacore+users%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users.</a> Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+blocking+assays+using+Octet%2C+ProteOn%2C+and+Biacore+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).</li>
<li>Abdiche, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Epitope+Binning+Assays+on+Label-Free+Array-Based+Biosensors+Can+Yield+Exquisite+Epitope+Discrimination+That+Facilitates+the+Selection+of+Monoclonal+Antibodies+with+Functional+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92451(2014).</li>
<li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+monoclonal+antibody+market%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).</li>
<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-throughput%2C+label-free%2C+real-time+molecular+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li>
<li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ddw-online.com/p-149288">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).</li>
<li>Lad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+kinetic+screening+of+hybridomas+to+identify+high-affinity+antibodies+using+bio-layer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry.</a> J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).</li>
<li>Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s12195-008-0036-4">The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions.</a> Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).</li>
<li>Eddings, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+continuous-flow+print+head+for+micro-array+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Improved continuous-flow print head for micro-array deposition.</a> Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet.</a> Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+ProteOn+XPR36+biosensor+into+a+36-ligand+array+expedites+protein+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis.</a> Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).</li>
<li>Rich, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+benchmark+study+using+affinity-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A global benchmark study using affinity-based biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dataset+of+the+binding+kinetic+rate+constants+of+anti-PCSK9+antibodies+obtained+using+the+Biacore+T100+ProteOn+XPR36%2C+Octet+RED384%2C+and+IBIS+MX96+biosensor+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms.</a> Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).</li>
<li>Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165993614001952">Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC.</a> Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).</li>
</ol>

frais pour la publication de cette vidéo ont été payés par l&#39;article Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.

Notre étude comparative en tête-à-tête montre que chaque plate-forme de biocapteur a ses propres forces et faiblesses. Même si les profils de liaison des anticorps sont similaires par comparaison visuelle (figures 3 - 6), et l&#39;ordre de rang des constantes cinétiques acquises sont très cohérentes à travers les instruments (figure 7), nos résultats montrent que les instruments fondés sur SPR avec fluidique à écoulement continu) sont mieux à la résolution des interactions de haute affinité avec les vitesses de dissociation lente. La dérive vers le haut pendant la phase de dissociation est observée dans les groupes de données (par exemple, 2 mAb, mAb 5, et mAb 9; Figure 5) généré par l&#39;instrument libres fluidique-BLI. Cette constatation peut être attribuée en grande partie à l&#39;évaporation de l&#39;échantillon au fil du temps dans la microplaque, ce qui est une première limite du système. Avec cette limitation inhérente, le temps expérimental est également limitée à moins de 12 h; les expériences ont donc été programmées avec shOrter fois (500 de l&#39;association et de dissociation 30 min) par rapport à celles des autres plates-formes (association de 10 min et 45 min de dissociation). Cependant, ce qui réduit le temps expérimental ne semble pas atténuer l&#39;impact de l&#39; évaporation sur la qualité / la cohérence des données, les constantes de vitesse générées par l&#39;instrument à base de BLI montrent moins la linéarité en raison des fluctuations de certains des hors-taux (figure 8C ). En plus de l&#39;évaporation de l&#39;échantillon, les différences dans les réactifs de capture utilisés peuvent aussi avoir contribué aux différences dans les résultats obtenus. Alors que la protéine A / G a été utilisé dans les trois plates-formes à base fluidiques-SPR, capteurs AHC ont été utilisés dans la plate-forme de BLI non-fluidiques. Étant donné que la protéine A / G est susceptible d&#39;avoir une affinité plus faible pour les mAbs que ne l&#39;AHC, une surface de biocapteur à base d&#39;anticorps, les hors-taux du complexe antigène-anticorps monoclonal à partir des surfaces de protéine A / G peut apparaître artificiellement plus rapidement que celles obtenu à partir de la surface AHC. Cette possibilité est prise en charge by les données expérimentales montrent que les valeurs de taux générés par la plate - forme BLI étaient toujours inférieures à celles obtenues à partir des autres instruments (Figure 7, ligne rouge). Néanmoins, la plate-forme de BLI a des avantages sur les autres plates-formes. Par exemple, il est très flexible en ce qui concerne le choix du capteur et la configuration d&#39;essai en raison des différents capteurs pré-enduit pour une utilisation immédiate. Dans nos expériences, l&#39;utilisation des capteurs AHC a éliminé la nécessité pour les étapes d&#39;immobilisation du ligand, ce qui réduit le temps de préparation. En outre, la plate-forme de BLI nécessite beaucoup moins d&#39;entretien par rapport aux autres plates-formes fluidiques de Spr, qui comportent des tubes et des configurations commutateur de valeur complexe. Cette caractéristique est un avantage pour les expériences sur des échantillons bruts qui peuvent causer des problèmes de colmatage et de contamination. Comme la demande pour l&#39;identification efficace, rapide et précise des candidats thérapeutiques augmente, la nécessité de bile débit de osensor augmente également. Parmi les quatre plateformes de biocapteurs, le débit du biocapteur capable d&#39;imprimer de réseau de 96 ligand est le plus élevé, suivi par le biocapteur couplé à un entrecroisement le format 36-ligand et le biocapteur à base de BLI avec affichage simultané de 16 canaux, ce qui augmente finalement le nombre d&#39;interactions mesurées en un seul cycle de liaison 96, 36 et 16, respectivement. Ces capacités de débit sont nettement supérieure à celle de la plate-forme traditionnelle SPR, qui est limitée par ne comportant que quatre cellules d&#39;écoulement reliées par un seul flux série. Étant donné que nos expériences impliquaient un ensemble d&#39;échantillons relativement faible de 10 anticorps monoclonaux évalués à des densités de surface multiples avec de longs temps de dissociation, les instrumentaux ont joué un débits rôle modéré dans la détermination de l&#39;efficacité des expériences. Il n&#39;y avait pas de différence significative dans les temps expérimentaux des trois plates-formes à haut débit, et dans tous les cas, les expériences ont été réalisées en un jour. D&#39;autre part, les expériences traditionnelles de flux SPR série requis 3 jours pour compléter, en dépit de l&#39;automatisation des rendez-vous loin de l&#39;acquisition de données après l&#39;installation. Dans d&#39; autres études qui impliquent un grand nombre d&#39;échantillons (dans les centaines ou des milliers), à des fins de classement hors taux / dépistage cinétique ou épitope binning, le débit devient un facteur critique. Bien que le débit de l&#39;hôtel Ibis MX96 est des ordres de grandeur supérieure à celle des autres biocapteurs et est donc un choix optimal à ces fins, il a quelques défauts. En particulier, l&#39;impression de la matrice par le CFM montre de grandes incohérences de surface (figure 1) et de reproductibilité des données réduite (Figure 8D et 8E). Pour les mesures cinétiques précises, la quantité de ligand sur la surface de biocapteur est un paramètre critique qui doit être contrôlé pour faire en sorte que les réponses de liaison ne sont pas perturbés par des facteurs secondaires tels quetransfert de masse ou un encombrement stérique. Pour le T100 Biacore et ProteOn XPR36, les niveaux optimaux de R L ont été déterminées sur la base du calcul standard de série R valeurs max tel que décrit dans l&#39;article de recherche 17. D&#39;autre part, pour les Octet RED384 et les plates-formes IBIS MX96, les niveaux de capture de mAb ont été obtenus de manière empirique en utilisant une série de 2 fois en série d&#39;anticorps dilué à des moments constants. Le manque de connaissance ou de contrôle de l&#39;étape de capture a entraîné une surface à haute densité et haute des signaux de réponse de liaison (figure 2) qui peut avoir compromis l&#39;exactitude des constantes de vitesse cinétique. En outre, la séparation de l&#39;imprimante à partir du détecteur présente également un SPR défi lors de la réalisation de multiples mesures du cycle de liaison impliquant régénérations. La seule façon de procéder à la configuration de la cinétique multi-cycle est par couplage d&#39;aminé directe des mAbs, par opposition à saisir par l&#39;intermédiaire du mAb Fc par la protéine A immobilisée / Gsurface dans les trois autres plateformes de biocapteurs. En conséquence, une expérience supplémentaire de reconnaissance de la régénération a été nécessaire pour déterminer les conditions optimales de régénération. Le résultat de cette configuration est liée à une ~ 90% de l&#39; activité observée surface inférieure par rapport à la méthode de capture Fc (figure 9), en plus d&#39;un temps plus long expérimental. Pour exécuter la méthode de capture Fc, une approche cinétique unique cycle alternatif a été adopté. Cette approche implique l&#39;injection séquentielle de l&#39; analyte à des concentrations croissantes sans régénération entre chaque injection (Figure 2). Cette très pratique, mais approche moins souvent appliquée raccourci non seulement le temps expérimental et réduit la consommation de réactif, mais aussi produit des constantes cinétiques très similaires à celles des autres biocapteurs (figure 7). Par conséquent, l&#39;application de cette approche cinétique unique du cycle surmonte la limitation de configuration inhérente de l&#39;instrument et présente unepossibilité d&#39;obtenir des constantes de vitesse cinétique à haute résolution d&#39;une manière à haut débit. Malgré le débit étant une limitation majeure dans le Biacore T100, nos résultats montrent collectivement qu&#39;il a généré les données les plus compatibles avec la plus haute qualité. Cela a été suivi par le ProteOn XPR36, qui a ~ 10 fois un débit plus élevé. Leur capacité à générer des données de haute qualité devient un avantage lors de la caractérisation des interactions anticorps-antigène à haute affinité qui peuvent être techniquement difficile lorsque les limites de détection des instruments sont atteints. Bien que les limites systématiques dans l&#39; instrumentation de l&#39;Octuor RED384 empêchent la mesure précise des constantes de vitesse de dissociation (c. -à- deçà de la sensibilité pour résoudre la décomposition du signal suffisant pour lent hors taux), aussi bien le Biacore T100 et ProteOn XPR36 peut fournir sensible et fiable la détection de la différenciation.

L’acquisition de paramètres cinétiques fiables pour caractériser les interactions anticorps-antigène est une composante essentielle du processus de découverte et de développement de médicaments1. Les biocapteurs par résonance plasmonique de surface optique (SPR), la « référence » pour la détection en temps réel de ces interactions, sont utilisés depuis environ deux décennies pour permettre la sélection précoce de candidats anticorps thérapeutiques répondant aux critères 2,3. En plus de fournir un classement d’affinité des anticorps candidats par le criblage rapide de surnageants bruts 4, et des déterminations rigoureuses de constantes cinétiques des préparations purifiées 5, les biocapteurs peuvent différencier davantage l’activité fonctionnelle des candidats principaux via des études de regroupement d’épitopes 6,7. 
Pour répondre à la demande croissante de produits à base d’anticorps pour diverses indications thérapeutiques8, une grande variété d’instruments de biocapteurs innovants ont été développés ces dernières années pour augmenter l’efficacité de l’identification et de la caractérisation des candidats9,10. Ces instruments diffèrent par la conception de la configuration des canaux microfluidiques et/ou par les principes optiques impliqués dans la détection des interactions biomoléculaires. Plus précisément, les Octet RED38411, ProteOn XPR3612 et IBIS MX967 ont porté le nombre d’interactions mesurées dans un seul cycle de liaison à 16, 36 et 96 respectivement, ce qui représente des améliorations significatives du débit par rapport à la plate-forme Biacore traditionnelle. Bien que ces différentes plateformes de biocapteurs fournissent toutes des données cinétiques essentielles pour caractériser les interactions anticorps-antigène, elles diffèrent par leur configuration expérimentale et leurs procédures opérationnelles en raison de variations dans les configurations instrumentales. Par exemple, dans la plate-forme de réseau d’imagerie SPR de l’IBIS MX96, l’étape d’immobilisation du ligand multiplex est effectuée en mode hors ligne dans un dispositif d’impression externe distinct du détecteur7,13 ; En revanche, les trois autres plates-formes de biocapteurs utilisent une configuration « tout-en-un », où l’ajout d’un composant à la surface du capteur, qu’il s’agisse du réactif d’activation, du ligand ou de l’analyte, est enregistré en temps réel et par le biais de commandes préprogrammées dans un ordre séquentiel. Dans l’Octet RED384, une caractéristique unique de cette plate-forme basée sur l’interférométrie BioLayer (BLI) est la disponibilité de biocapteurs à fibre optique pré-revêtus pour une utilisation immédiate par immersion et lecture 14, éliminant ainsi le besoin de préparation de surface de ligand et d’étapes d’initiation/conditionnement, qui sont souvent nécessaires pour les puces de capteur dans les plates-formes basées sur SPR. La conception sans fluidique de cet instrument simplifie également la mécanique et évite les problèmes de colmatage et de contamination lors du traitement d’échantillons bruts. Grâce à la nouvelle conception fluidique entrecroisée 6 x 6 du ProteOn XPR36, une approche cinétique « one-shot » peut être mise en œuvre en commutant les canaux d’écoulement entre les directions horizontales et verticales pour créer 36 points d’interaction 15. Au lieu d’évaluer la cinétique de liaison une concentration de ligand ou d’analyte à la fois, comme c’est le cas dans la plate-forme traditionnelle Biacore T100 en flux sériel, cette approche offre la possibilité de surveiller jusqu’à 36 interactions différentes simultanément dans un seul cycle de liaison. 
Malgré leurs différences, ces quatre plateformes de biocapteurs sont toutes largement utilisées par de nombreux laboratoires dans le monde. Pour les nouveaux utilisateurs ayant peu d’expérience pratique des biocapteurs, décider quel instrument utiliser peut être une tâche difficile compte tenu des différences de conception instrumentale. Pour déterminer l’instrument le plus approprié à leurs fins de recherche, des facteurs tels que la qualité des données, la cohérence des performances, le débit, la facilité d’utilisation et la consommation de matériaux doivent être pris en compte collectivement. Alors que plusieurs études comparatives ont exploré la variabilité des constantes de vitesse cinétique obtenues à partir de plusieurs laboratoires et biocapteurs5,16, une étude comparative directe récemment publiée aborde davantage les facteurs systématiques qui influencent la fiabilité des données du point de vue de la performance instrumentale 17,18. Les protocoles fournis dans cette vidéo se concentrent sur le dispositif expérimental et les procédures en détail, et sont accompagnés de l’article de recherche intitulé « Comparaison des plateformes de biocapteurs dans l’évaluation de la cinétique de liaison anticorps-antigène de haute affinité"17. Ces protocoles visent non seulement à aider les nouveaux utilisateurs de biocapteurs à mettre en œuvre ces instruments à des fins de recherche, mais aussi à fournir des informations supplémentaires aux utilisateurs actuels de biocapteurs sur les défis techniques et les considérations dans les conceptions expérimentales pour évaluer les interactions anticorps-antigène de haute affinité.

<table><tbody><tr><td>Système Biacore T100</td><td>GE Healthcare</td><td>28975001</td><td>Le système T100 a été mis à niveau vers la puce de capteur T200</td></tr><tr><td>CM5.</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100012</td><td></td></tr><tr><td>BIAevaluation&nbsp ;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Version 4.1</td></tr><tr><td>Logiciel de contrôle Biacore T100</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Le logiciel de contrôle T100 a été mis à niveau vers</td></tr> le <tr><td>kit de couplage d’amines</td> T200 GE <td>Healthcare</td><td>BR100050&nbsp ;</td><td>Il contient : 750 mg de chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC), 115 mg de N-hydroxysuccinimide (NHS), 10,5 mL d’éthanolamine-HCl 1,0 M pH 8,5&nbsp ;</td></tr><tr><td>HBS-EP+ Buffer 10&times ;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100669</td><td>Solution mère concentrée&nbsp ;</td></tr><tr><td>Flacons en plastique, diamètre extérieur 7 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100212&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons en caoutchouc, type 3</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100502</td><td></td></tr><tr><td>Flacons et bouchons en plastique, diamètre extérieur 11 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100214&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Système de réseau d’interaction protéique ProteOn XPR36</td><td>Bio-Rad</td><td>1760100</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel ProteOn Manager&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>1760200</td><td>Version 3.1.0.6</td></tr><tr><td>Puce de capteur GLM</td><td>Kit de</td><td></td> couplage d’amines Bio-Rad 1765012 <td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1762410</td><td>Il comprend EDAC (EDC), sulfo-NHS, éthanolamine HCl&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit et tampons de régénération et de conditionnement</td><td>Bio-Rad</td><td>1762210</td><td>Il comprend 1 tampon de glycine (pH 1,5, 2,0, 2,5, 3,0) et 1 solution de NaOH, SDS, HCl, acide phosphorique, NaCl ; 50 mL de chaque solution.</td></tr><tr><td>2 L de tampon PBS/Tween/EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>1762730</td><td>Comprend une solution saline tamponnée pour hosphète (PBS), pH 7,4, 0,005 % Tween 20, 3 mM EDTA&nbsp ;</td></tr><tr><td>Octet RED384 Système</td><td>Fort&eacute ; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de données</td> biographiques <td>Fort&eacute ; </td><td></td> Bio <td>Version 9.0.0.4</td></tr><tr><td>Tremper et lire Biocapteurs anti-hIgG Fc Capture (AHC)</td><td>Fort&eacute ; Bio</td><td>18-5060</td><td>Un plateau de 96 biocapteurs&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaque inférieure inclinée à 384 puits&nbsp ;</td><td>Fort&eacute ; Bio</td><td>18-5080</td><td></td></tr><tr><td>Distributeur de biocapteurs</td><td>Fort&eacute ; Bio</td><td>18-5016</td><td></td></tr><tr><td>Tampon cinétique 10x</td><td>Fort&eacute ; Bio</td><td>18-1092</td><td>Concentration 10x. Contient ProClin 300.&nbsp ;</td></tr><tr><td>IBIS MX96 SPRi System</td><td>Wasatch Microfluidics Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microspotter à flux continu (CFM) Imprimante</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Version 2.0</td></tr><tr><td>Puce SensEye COOH-G</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>1-09-04-004</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de données</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Version 6.19.3.17</td></tr><tr><td>SPRint Logiciel</td> <td>d’analyse de donnéesWasatch Microfluidics</td><td></td><td>Version 6.15.2.1</td></tr><tr><td>Épurateur 2</td><td>Logiciel</td><td></td> BioLogic <td>Version 2</td></tr><tr><td>Protéine recombinante Pierce A/G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr></tbody></table>

détermination de l&#39;anticorps-antigène à haute affinité de liaison kinetics en utilisant quatre plates-formes biocapteurs

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

biocapteurs optiques sans étiquette sont des outils puissants dans la découverte de médicaments pour la caractérisation des interactions biomoléculaires. Dans cette étude, nous décrivons l&#39;utilisation de quatre plates-formes de biocapteurs utilisées régulièrement dans notre laboratoire pour évaluer l&#39;affinité de liaison et la cinétique de dix anticorps monoclonaux de haute affinité (mAb) contre la pro-protéine convertase subtilisine humaine kexine type 9 (PCSK9). Bien que les deux Biacore T100 et ProteOn XPR36 sont dérivées de la technologie de résonance plasmonique de surface (SPR) bien établie, le premier a quatre cellules d&#39;écoulement connectés selon la configuration d&#39;écoulement en série, tandis que le second présente 36 taches de réaction en parallèle à travers une improvisée 6 x 6 entrecroisé configuration microfluidique du canal. Le IBIS MX96 exploite également basé sur la technologie de capteur SPR, avec un dispositif d&#39;imagerie supplémentaire qui permet la détection de l&#39;orientation spatiale. Cette technique de détection associée à l&#39;écoulement continu Microspotter (CFM) augmente le débit de manière significative par enabling impression de réseau multiplex et la détection de 96 sports de réaction simultanément. En revanche, le RED384 Octet est basé sur le principe optique biocouche interférométrie (BLI), avec des sondes à fibre optique agissant en tant que biocapteur pour détecter motif d&#39;interférence change sur des interactions de liaison à la surface de pointe. Contrairement aux plates-formes SPR, le système de BLI ne repose pas sur fluidiques de flux continu; à la place, les conseils de capteurs recueillent des lectures alors qu&#39;ils sont plongés dans des solutions d&#39;analyte d&#39;une microplaque 384 puits pendant l&#39;agitation orbitale. Chacune de ces plates-formes de biocapteurs a ses propres avantages et inconvénients. Pour fournir une comparaison directe de la capacité de ces instruments de fournir des données cinétiques qualité, les protocoles décrits illustrent des expériences qui utilisent le même format d&#39;essai et les mêmes réactifs de haute qualité pour caractériser la cinétique anticorps-antigène qui correspondent à la 1 simple: 1 modèle d&#39;interaction moléculaire .

La figure 1 montre l&#39;image de la puce à anticorps de la CFM et les niveaux mAb repérés par les deux procédés d&#39;immobilisation, et la figure 2 montre les sensorgrammes de liaison correspondants générés dans le MX96 à partir des mesures cinétiques à cycles multiples cinétique et le cycle unique sur ces réseaux de mAb . Le temps réel de liaison et les courbes cinétiquement ajustées à partir de plusieurs surfaces revêtues d&#39; anticorps générés dans les quatre plateformes de biocapteurs sont représentés sur les figures 3 - 6. La figure 7 montre la comparaison des taux cinétiques finales et les constantes de liaison d&#39;équilibre obtenues à partir de l&#39;analyse globale de ces courbes de liaison. L&#39;association individuelle (K a), de dissociation (K d), et à l&#39; équilibre (K D) les constantes de liaison sont présentés dans le tableau 1. Pour démontrer la variabilité des ensembles de données générés dans le même instrument, <stRong&gt; La figure 8 représente des tracés de k a, k d et K D à différentes densités de surface de mAb, et la figure 9 compare en outre les activités de liaison calculées des surfaces mAb à travers les plateformes de biocapteurs. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> Figure 1. Multiplex Ligand de tableaux couplé Amine (A) et Fc-capturée (B) Anticorps surfaces de l&#39; impression CFM dans le IBIS MX96. Les images des matrices imprimées sont présentées dans les panneaux de gauche, où les zones grises entourées par des carrés rouges indiquent la présence d&#39;anticorps. Les interspots sombres situées entre les points d&#39;anticorps actifs sont utilisés pour la soustraction de référence. Chaque colonne contient un anticorps imprimé aux concentrations de titrage identifiés ci-dessous et à la gauche de l&#39;image. Les quantités des anticorps imprimés quantifiés en calculant la différence en vrac décalages entre les positions actives et de référence sont présentées dans les panneaux de droite. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> Figure 2. Comparaison des temps réel de liaison sensorgrammes de plusieurs cycles (A) et à cycle unique (B) Expériences cinétiques dans l&#39;IBIS MX96. Les injections séquentielles de PCSK9 humain à des concentrations croissantes à travers les 10 x 8 puces à anticorps sont notés ci-dessus de chaque segment de détecteur correspondant. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <strong&gt; Figure 3. Liaison sensorgrammes des anticorps humains avec Captured Interagir PCSK9 et 1: 1 Modèle Kinetic Fit surimpressions dans le Biacore T100. Les interactions sont évalués sur haut (panneaux supérieurs), moyen (panneaux du milieu) et faible (panneaux inférieurs) surfaces de densité. Les lignes noires lisses superposées représentent la forme cinétique des signaux de réponse de liaison à différentes concentrations de l&#39;homme PCSK9 (lignes colorées) à un modèle 1: 1 d&#39;interaction. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> Figure 4. Liaison sensorgrammes des anticorps humains avec Captured Interagir PCSK9 et 1: 1 Modèle Kinetic Fit surimpressions dans le ProteOn XPR36. Les interactions sont évalués sur haut (panneaux supérieurs), médium- (panneaux du milieu) et faible (panneaux inférieurs) surfaces de densité. Les lignes noires lisses superposées représentent la forme cinétique des signaux de réponse de liaison à différentes concentrations de l&#39;homme PCSK9 (lignes colorées) à un modèle 1: 1 d&#39;interaction. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> Figure 5. Liaison sensorgrammes des anticorps humains avec Captured Interagir PCSK9 et 1: 1 Modèle Kinetic Fit Superpositions dans l&#39;Octuor RED384. Les interactions sont évalués sur haut (panneaux supérieurs), moyen (panneaux du milieu) et faible (panneaux inférieurs) surfaces de densité. Les lignes rouges superposées représentent la forme cinétique des signaux de réponse de liaison à différentes concentrations de PCSK9 humaines (lignes colorées) d&#39;un mélange 1:<html> 1 modèle d&#39;interaction. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> Figure 6. La liaison des sensorgrammes couplés Amine (A) et Fc-capturés (B) Interaction avec anticorps humain PCSK9 et 1: 1 modèle cinétique Fit overlays dans le IBIS MX96. Les profils de liaison sont organisées en 10 x 8 panneaux qui suivent le plan de la plaque de matrice sur la figure 1. Les lignes noires représentent les signaux de réponse de liaison enregistrés à différentes concentrations de PCSK9 humains, et les lignes rouges superposées représentent les courbes ajustées. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 7&quot; gurer src = &quot;/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg&quot; /&gt; Figure 7. Comparaison de l&#39;Association k a (A), de dissociation K d (B), et d&#39; équilibre K D (C) la liaison Constantes générée par les plates - formes Four biocapteur. Les paramètres cinétiques sont dérivées de l&#39; analyse globale des courbes de liaison des figures 3 - 6. Les instruments sont représentés comme suit: Biacore T100 (bleu), ProteOn XPR36 (vert), Octuor RED384 (rouge), IBIS MX96, couplé amine (violet), et IBIS MX96, Fc rattrapées (orange). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> Figure 8. Comparaison de la cohérence des taux cinétique Constantes sur plusieurs anticorps de surface dans Densités CCFI<html> minerai T100 (A), ProteOn XPR36 (B), Octet RED384 (C), IBIS MX96, couplé par une amine (D), et IBIS MX96, Fc-capturée (E). Les paramètres cinétiques k a (sous-panneaux supérieurs), k d (sous-panneaux intermédiaires), et K D (sous-panels du bas) sont dérivées de l&#39; analyse de groupe à une densité de surface de l&#39; anticorps particulier. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> Figure 9. Activités de liaison de l&#39;anticorps Surfaces et leurs écarts - types (barres d&#39;erreur) dans les plates - formes Quatre biocapteur. Les valeurs sont calculées en utilisant les équations décrites dans les articles de recherche 17.large.jpg » target = « _ blank »&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> k un </td><td> k d </td><td> K D </td></tr><tr><td> (M -1 s -1) </td><td> (s -1) </td><td> (nM) </td></tr><tr><td> mAb 1 </td><td> 11,7 (7,8) x 10 5 </td><td> 4,89 (4,18) x 10 -5 </td><td> 0,052 (0,05) </td></tr><tr><td> mAb 2 </td><td> 1,53 (0,28) x 10 5 </td><td> 1,30 (1,54) x 10 -5 </td><td> 0,092 (0,12) </td></tr><tr><td> mAb 3 </td><td> 11,4 (8,3) x 10 5 </td><td> 27,6 (11,0) x 10 -5 </td><td> 0,333 (0,20) </td></tr><tr><td> mAb 4 </td><td> 3,61 (1,6) x 10 5 </td><td> 20,1 (12,3) x 10 -5 </td><td> 0,659 (0,54) </td></tr><tr><td> mAb 5 </td><td> 0,59 (0,21) x 10 5 </td><td> 3,46 (2,50) x 10 -5 </td><td> 0,663 (0,46) </td></tr><tr><td> mAb 6 </td><td> 1,19 (0,78) x 10 5 </td><td> 7,21 (3,83) x 10 -5 </td><td> 0,894 (0,64) </td></tr><tr><td> mAb 7 </td><td> 1,29 (0,53) x 10 5 </td><td> 16,4 (5,63) x 10 -5 </td><td> 1,57 (1,02) </td></tr><tr><td> mAb 8 </td><td> 4,02 (2,23) x 10 5 </td><td> 22,8 (10,7) x 10 -5 </td><td> 0,768 (0,68) </td></tr><tr><td> mAb 9 </td><td> 4,20 (2,13) x 10 5 </td><td> 6,67 (4,3) x 10 -5 </td><td> 0,197 (0,16) </td></tr><tr><td> mAb 10 </td><td> 1,20 (0,49) x 10 5 </td><td> 12,5 (7,64) x 10 -5 </td><td> 1,27 (0,80) </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Taux et cinétique d&#39; équilibre de 10 Constantes liaison des anticorps monoclonaux obtenus par montage global des courbes de liaison de quatre biocapteurs Instruments à 1: 1 Modèle d&#39;interaction.

Nous décrivons ici les protocoles pour la mesure de l&#39;affinité de liaison anticorps-antigène et la cinétique en utilisant quatre plates-formes de biocapteurs couramment utilisés.

Détermination de l&#39;anticorps-antigène à haute affinité de liaison Kinetics En utilisant quatre plates-formes biocapteurs

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

L'objectif de cette étude sur les biocapteurs est de comparer la capacité des quatre plates-formes de biocapteurs couramment utilisées à fournir des données cinétiques de qualité et d'apporter des éclairages sur les défis techniques ainsi que sur les considérations liées à la conception expérimentale pour l'évaluation des interactions anticorps-antigène à haute affinité. Cette étude répond à des questions clés dans le domaine de la découverte de médicaments concernant le choix des plates-formes de biocapteurs et des formats d'essai permettant d'obtenir les résultats les plus fiables lors de l'évaluation de candidats anticorps thérapeutiques. Le principal avantage de cette étude réside dans la comparaison directe et exhaustive des différentes plates-formes de biocapteurs en ce qui concerne la cohérence, la qualité des données et l'efficacité opérationnelle.La démonstration vidéo des quatre protocoles est essentielle, car elle aide les nouveaux utilisateurs ayant peu d'expérience pratique à apprendre à configurer des expériences sur ces instruments. Pour les mesures cinétiques sur le Biacore T100, cliquez sur Fichier, Ouvrir une nouvelle méthode, puis ouvrez le fichier de méthode. Examinez les paramètres dans la méthode.Dans Types de cycles, réglez le temps de contact à 220 secondes pour la capture 1 via le trajet d'écoulement 2, à 110 secondes pour la capture 2 via le trajet d'écoulement 3, et à 55 secondes pour la capture 3 via le trajet d'écoulement 4. Le débit est de 10 microlitres par minute pour tous les cycles de capture. Sélectionnez Échantillon 1 et cochez solution d'échantillon comme variable.Ensuite, régler le temps de contact à 600 secondes et le temps de dissociation à 2 700 secondes sur les trajets de flux 1, 2, 3, 4. Le débit est fixé à 30 microlitres par minute. Puis, sélectionner Régénération 1, saisir la solution de glycine HCl pH 1,5 dans le champ solution, et régler le temps de contact à 20 secondes sur les trajets de flux 1, 2, 3, 4.Dans les param&egrave;tres variables, saisissez des concentrations en titration double allant de 100 nanomolaires &agrave; 6,25 nanomolaires pour les cycles 1 &agrave; 3, de 50 nanomolaires &agrave; 3,12 nanomolaires pour les cycles 4 &agrave; 8, et de 5 nanomolaires &agrave; 0,323 nanomolaires pour les cycles 9 &agrave; 10. Dans la configuration de l'essai, choisissez le trajet d'&eacute;coulement de d&eacute;tection 2-1, 3-1, 4-1, puis cliquez sur suivant. Cochez la case amor&ccedil;age avant l'essai, puis cliquez &agrave; nouveau sur suivant.Sélectionnez l'échantillon et le support de réactifs 1, puis définissez l'emplacement des réactifs. Prélevez les réactifs à l'aide d'une pipette et déposez-les dans les vials individuels selon les instructions, puis insérez le support dans l'instrument. Cliquez sur Éjecter le support pour ouvrir la porte du compartiment du plateau d'échantillons, puis insérez le support d'échantillons dans l'instrument.Cliquez ensuite sur Démarrer et saisissez un nom d'expérience à enregistrer pour lancer l'analyse. Pour les mesures cinétiques sur le ProteOn XPR36, commencez l'immobilisation en sélectionnant Protocoles, puis Échantillons. Définissez EDC/Sulfo-NHS comme activateur dans les puits H1-H6, la protéine A/G comme ligand dans G1-G6, l'éthanolamine comme désactivateur dans F1-F6, la glycine comme régénérant dans E1-E6, le PBS-T-EDTA comme témoin dans D1-D6, l'échantillon d'anticorps monoclonal X comme ligand dans C1-C6, et la PCSK9 humaine comme analyte dans les puits B1-B6.Sélectionner Étapes, puis double-cliquer sur Immobilisation dans l'éditeur de protocole. Les étapes comprennent trois injections horizontales successives d'EDC/Sulfo-NHS, de protéine A/G et d'une solution molaire d'éthanolamine. Chaque injection doit être effectuée à un débit de 30 microlitres par minute et avec un temps de contact de 300 secondes.Ensuite, cliquez sur Régénérer. Injectez trois impulsions de 18 secondes de glycine à 100 microlitres par minute, dans les directions horizontale et verticale. Suivez par deux impulsions de 60 secondes de PBS-T-EDTA à 25 microlitres par minute, également dans les deux directions.Ensuite, cliquez sur Ligand et injectez l'anticorps monoclonal 1, l'anticorps monoclonal 2 dans le sens vertical, en utilisant un débit de 25 microlitres par minute et un temps de contact de 160 secondes. Après avoir cliqué sur Analyte, injectez cinq concentrations de PCSK9 humain dans un tampon vide sur six canaux horizontaux simultanément. Utilisez un débit de 40 microlitres par minute pendant 600 secondes de temps d'association, suivi de 2 700 secondes de temps de dissociation.Ensuite, cliquez sur Régénérer et injectez deux impulsions de glycine de 18 secondes à 100 microlitres par minute dans les directions horizontale et verticale. Préparez ensuite les échantillons et les réactifs dans une plaque 96 puits selon les positions définies des réactifs. Transférez la plaque sur l'appareil, cliquez sur l'onglet Exécuter, sélectionnez le protocole, puis cliquez sur Démarrer.L'injection parallèle à six aiguilles lors de l'enregistrement de données expérimentales en direct est démontrée. Pour les mesures cinétiques sur l'Octet RED384, configurez la méthode expérimentale en cliquant d'abord sur Expérience, puis sur Assistant de nouvelle expérience, Nouvelle expérience cinétique, puis Cinétique de base dans le logiciel d'acquisition de données. Cliquez ensuite sur Modifier les plaques et remplacez 96 puits par 384 puits à la fois dans la Plaque 1 et la Plaque 2.Définir les types d'échantillons et leurs positions dans la plaque comme décrit dans le protocole textuel. Accéder à la définition du test pour configurer le dispositif expérimental. Le dispositif expérimental est défini par un temps de ligne de base de 30 secondes, un temps de régénération de 30 secondes, un temps d'équilibration de 18 secondes, un chargement avec une durée de 200 secondes, un temps d'association de 500 secondes et un temps de dissociation de 1 800 secondes.La vitesse d'agitation est réglée à 1 000 tr/min. Pour ajouter les étapes à la liste des étapes du test, cliquez d'abord sur une étape, puis sur les puits situés sur la plaque d'échantillons ou sur la plaque de réactifs. Saisissez d'abord les instructions d'équilibration et de régénération afin de préconditionner les capteurs de détection anti-Fc humain par trois cycles de trempages de 15 secondes dans de la glycine alternés avec des trempages de 15 secondes dans du 1XKB.Ensuite, saisissez les instructions de chargement pour capturer les échantillons d'anticorps monoclonaux sur les capteurs anti-Fc humain pendant 200 secondes. Puis, saisissez les instructions de ligne de base afin d'établir le signal de la interférométrie en couche biologique pendant 60 secondes avant l'étape d'association. Saisissez l'étape d'association pour plonger les capteurs dans des puits contenant des concentrations variables de PCSK9 humain pendant une période d'association de 500 secondes.Effectuez l'étape de dissociation en immergeant les capteurs liés à la PCSK9 dans de nouveaux puits contenant du KB 1X pendant une période de dissociation de 1 800 secondes. Enfin, pour l'étape de régénération, immergez les capteurs liés à l'anticorps monoclonal PCSK9 dans des puits contenant de la glycine, avec deux impulsions de 18 secondes entre chaque cycle de liaison. Accédez à Review Experiments, faites défiler les étapes, puis cliquez sur le bouton vert ouvert pour ouvrir le compartiment d'échantillonnage.Transférez les plaques d'échantillons dans l'appareil. Accédez à Exécuter des expériences, saisissez un délai de 60 secondes et agitez la plaque d'échantillons en attendant. Réglez la température de la plaque à 25 degrés Celsius, saisissez le nom de l'expérience, puis appuyez sur Démarrer. La collecte de données en temps réel est affichée ici.Pour les mesures cinétiques multi-cycle sur l'IBIS-MX96, installez la puce de détection dans le microdispenseur à flux continu. Ouvrez le logiciel CFM2.0, puis cliquez sur Charger les paramètres, puis sur 96 Amine Couple. Placez les deux plaques d'échantillons et de réactifs dans l'imprimante CFM.Pour créer le réseau d'anticorps, appuyez sur Exécuter pour démarrer l'imprimante et acheminer le EDC/Sulfo-NHS situé dans la moitié supérieure de la plaque de réactifs vers le capteur à l’aide de 48 microcanaux, puis faites-le circuler sur la surface du capteur pendant cinq minutes. Acheminez les échantillons d'anticorps monoclonaux présents dans la moitié supérieure de la plaque source vers le capteur, et faites-les circuler sur les surfaces activées pendant 10 minutes. Ensuite, acheminez le tampon d'immobilisation provenant d’un tube conique de 50 millilitres sur la surface des anticorps pendant cinq minutes.Insérez la puce de capteur imprimée dans l'appareil. Dans le logiciel de contrôle, cliquez sur Fichier, Ouvrir une mesure, Mesure existante, puis sélectionnez le fichier de méthode. Transférez la puce de capteur imprimée dans l'appareil.Dans le menu général, sélectionnez G-System Prime sous Script du système complet. Ensuite, sélectionnez G-Quench pour désactiver les surfaces d'anticorps monoclonaux en injectant 150 microlitres d'éthanolamine à une molaire. Dans le cycle d'analyse, sélectionnez A-AP Standard Run sous IBIS Scripts.Régler 1,0 minute pour la ligne de base, 10,0 minutes pour l'association et 90 étapes pour la dissociation à une vitesse de huit microlitres par seconde. Pendant les cycles, injecter la PCSK9 humaine une concentration à la fois, après cinq injections de tampon. Régénérer les surfaces d'anticorps monoclonaux avec de la glycine entre chaque cycle de liaison.Des enregistrements de sensoriogrammes de liaison, superposés selon un modèle cinétique un-à-un, sont présentés pour les anticorps interagissant avec la PCSK9 humaine sur quatre instruments. Les profils de liaison des anticorps à différentes densités sont similaires entre les instruments. Même si les constantes de vitesse associées à chacun des anticorps variaient selon les instruments, leurs ordres de classement sont restés globalement identiques.La reproductibilité et la cohérence des affinités en fonction des taux cinétiques sur plusieurs surfaces d'anticorps ont été étudiées. Comme illustré ici, une forte linéarité a été observée pour toutes les constantes de vitesse obtenues à l'aide du Biacore T100 et du ProteOn XPR36. Toutefois, les constantes de vitesse générées par l'Octet RED384 étaient moins linéaires en raison de fluctuations dans certains taux de dissociation.Cela a probablement été causé par l'évaporation progressive des échantillons dans la microplaque. Les constantes de vitesse obtenues avec l'IBIS-MX96 étaient également moins linéaires en raison de fluctuations liées aux hétérogénéités de surface. Les activités de liaison des anticorps associées à la plupart des systèmes étaient cohérentes, tandis qu'une activité environ dix fois plus faible a été observée pour la méthode de couplage par les amines à l'aide de l'IBIS-MX96.Cela était probablement dû à une inactivation de l'anticorps ou à la formation d'orientations d'anticorps non favorables à la liaison avec l'antigène. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mettre en place des expériences sur chacune des quatre plates-formes de biocapteurs, ainsi que comment choisir la technologie de biocapteur la plus adaptée à vos objectifs de recherche. Notre étude comparative directe montre que chaque plate-forme de biocapteur présente ses propres avantages et inconvénients.Malgré certaines limitations systématiques inhérentes à l'instrumentation, l'ordre direct des constantes de taux d'association et de dissociation était fortement corrélé entre ces instruments. Pour le classement des candidats, en supposant que le nombre d'échantillons et la quantité de matériaux ne soient pas des facteurs limitants, chacun de ces instruments peut être utilisé, car ils permettent de distinguer les anticorps de manière comparable, indépendamment de l'instrument utilisé. Il existe un compromis entre la fiabilité des données et le débit d'échantillons.Le Biacore T100, suivi du ProteOn XPR36R, a présenté la meilleure qualité et cohérence des données. En revanche, l'Octet RED384 et l'IBIS-MX96 offrent une grande flexibilité et un débit élevé, au détriment de la précision et de la reproductibilité des données. Pour les études nécessitant une détection sensible et fiable, le Biacore T100 ou le ProteOn XPR36R est le plus approprié.Pour les études dans lesquelles la vitesse est un facteur déterminant et où un grand nombre d'échantillons sont impliqués, l'Octet Red384 ou l'IBIS-MX96 est préféré. Les instruments dotés d'un système de fluide à écoulement continu X fournissent des données de haute qualité permettant de résoudre les interactions ayant des taux de dissociation lents. La limitation majeure de l'instrument BRI fluid ex-a-fray est l'évaporation progressive des échantillons dans la microplaque, qui peut entraîner une dérive ascendante, compromettant ainsi la précision des données.

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