Analyse phénotypique des stades du sang asexué et sexuel du parasite du paludisme des rongeurs et des stades des moustiques

En raison des similitudes frappantes du cycle de vie et de la biologie des parasites du paludisme chez les rongeurs, les parasites humains du paludisme, les modèles de paludisme des rongeurs sont devenus indispensables à la recherche sur le paludisme. Ces méthodes standard peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le paludisme sur la façon d’effectuer une analyse phénotypique des espèces sauvages de type sauvage et de paludisme transgénique des rongeurs. Les étudiants diplômés Gozde Deveci et Ilknur Yilmaz de mon laboratoire feront la démonstration des procédures.

Commencez par décongeler rapidement les stocks de parasites congelés préservés cryo et immédiatement à l’aide d’une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 26 pour injecter au moins deux souris donneurs par génotype intraperitoneally avec environ 200 microlitres de stock. Vingt-quatre heures après l’injection, utilisez une aiguille de calibre 24 ou 26 pour piquer la queue de la première souris et recueillir la gouttelette de sang sur une lame de microscope. Utilisez le bord court d’une autre glissière pour salir rapidement le sang à travers la première diapositive.

Lorsque le sang a complètement séché, fixer les diapositives dans 100% méthanol pendant au moins une minute. Tacher les échantillons fixes à Giemsa pendant 10 à 15 minutes, suivis d’un lavage à l’eau distillé simple ou double. Lorsque les diapositives ont séché, visualisez les échantillons sous un objectif 100X et l’immersion d’huile sur un microscope léger pour compter le nombre total d’érythrocytes infectés par grille.

Deux à trois jours après l’infection, fixer une souris anesthésiée dans laquelle la parasitemia a atteint entre 0,1 à 1% dans la position supine et utiliser des forceps pour soulever la peau près de la base du sternum pour faciliter la création d’une incision cutanée. Séparez la peau à l’emplacement de l’incision pour exposer le diaphragme et le haut de la cavité abdominale et utilisez les forceps pour tenir la base de la cage thoracique tout en coupant à travers le diaphragme pour entrer dans la cavité thoracique. Épinglez la cage thoracique pour exposer le cœur et utilisez une seringue d’un millilitre contenant au moins 20 microlitres d’héparine et équipée d’une aiguille de calibre 26 pour percer doucement le tissu cardiaque.

Rétractez lentement le piston pour recueillir environ un millilitre de sang et distribuer le sang dans un tube de microcentrifugeuse. Lorsque tout le sang a été récolté, réchauffez les souris receveurs sous une lampe à chaleur rouge et chargez une seringue à insuline munie d’une aiguille de calibre 27 par receveur avec la dose appropriée de parasite. Placez ensuite le premier receveur dans un restrainer et injectez une dose complète d’érythrocytes infectés dans une veine de la queue dilatée.

Pour l’alimentation des moustiques, permettre aux moustiques anopheles stephensi ou A.gambiae femelles adultes de quatre à sept jours affamés pendant huit à 12 heures de se nourrir d’au moins 15 minutes sur des souris infectées anesthésiées ayant le taux d’exflagellation le plus élevé. Pour déterminer le nombre de sporozoites oocystes par moustique, euthanasiez de 20 à 30 moustiques dans le congélateur pendant au moins 10 minutes et utilisez une portée de dissection binoculaire et deux aiguilles de calibre 26 ou 27 pour disséquer les mi-espèces de moustiques sur une toboggan en verre contenant la solution de dissection appropriée. Pour disséquer le midgut, tenez d’abord la partie inférieure de l’abdomen en place avec une aiguille et poussez soigneusement le thorax très légèrement à la jonction entre l’abdomen et le thorax dans une direction ascendante jusqu’à ce qu’il sépare le thorax et qu’un midgut de couleur blanche soit exposé en balançant vers le bas du thorax.

Maintenant, couper le midgut de l’extrémité de l’œsophage en utilisant la même aiguille qui a été utilisé pour pousser le thorax vers le haut, séparant ainsi et étalant le midgut. Soulevez le midgut disséqué du milieu de dissection à l’aide d’une aiguille et transférez-le dans un tube rempli de 200 microlitres de RPMI. Lorsque tous les midguts ont été disséqués et récoltés, placez le tube contenant les midguts dans la centrifugeuse pendant une minute à 700 fois g.

Puis moudre les tissus récoltés avec un pilon deux fois. Transférer 12 microlitres de la solution tissulaire diluée sur un hemacytomètre et incuber l’hemacytomètre à température ambiante pendant cinq minutes pour permettre au contenu de se déposer. Déterminez ensuite le nombre moyen de sporozoites oocystes sur un microscope léger en contraste de phase et un grossissement de 40 X.

Pour déterminer le nombre de sporozoites salivaires par moustique, au moment opportun après l’alimentation, congeler euthanasié 50 à 100 moustiques femelles comme démontré et utiliser un microscope disséquant et le côté d’une aiguille de calibre 26 ou 27 pour isoler les glandes salivaires. Pour disséquer les glandes salivaires, tenez d’abord le haut de l’abdomen ou le thorax en place avec le côté biseauté d’une aiguille et poussez soigneusement la tête très légèrement et très courte pousse à la jonction entre la tête et le thorax dans une direction ascendante. Poussez jusqu’à ce que la tête soit soigneusement séparée du thorax sans déchirer la glande salivaire vitride.

Utilisez une pipette pasteur en verre court pour soulever la glande salivaire disséquée du milieu de dissection et placez-la dans un tube de 1,5 millilitre. Lorsque toutes les glandes salivaires ont été disséquées et récoltées, placez le tube contenant les glandes dans la centrifugeuse pendant une minute à 700 fois g. Moudre les tissus récoltés avec un pilon deux fois.

Déterminez ensuite le nombre moyen de sporozoites salivaires de glande comme précédemment fait. Les parasites transgéniques de paludisme de reporter conçus pour exprimer EGFP sous le contrôle d’un promoteur fort et constitutif montrent le signal de fluorescence dans les étapes de sang, les ookinetes, les jeunes oocystes sur les midguts d’Anopheles stephensi, et dans les sporozoites isolées des glandes salivaires des femelles d’Anopheles stephensi. Les valeurs de pourcentage de parasitemia de cytométrie de flux correspondent directement aux pourcentages estimés de parasitemia obtenus en surveillant les frottis minces tachés de sang de Giemsa comme démontré confirmant la validité de cette dernière méthode de quantification.

En outre, l’estimation des pourcentages de chacune des différentes étapes asexuelles et sexuelles dépend de l’évaluation morphologique des érythrocytes qui ne peuvent pas être évalués par cytométrie de flux. La comparaison des voies intraperitoneal contre intraveineuses de l’infection indique une diminution statistiquement significative du pourcentage de parasitemia de groupe infecté par IP comparé au pourcentage infecté iv de parasitemia de groupe pendant les quatre premiers jours de l’infection démontrant que la voie IV de l’infection est une voie plus quantitativement précise pour des essais avec les étapes de sang de parasite de paludisme. Il convient de noter que le traitement à la phényléhydrazine augmente considérablement le nombre de gametocytes, ce qui augmente le taux de formation masculine de gamete, ce qui augmente à son tour le taux de fécondation et le nombre de tous les stades ultérieurs des moustiques.

Il existe une pénurie de méthodes normalisées pour l’analyse phénotypique des parasites du stade sanguin du paludisme chez les rongeurs et leur transmission au moustique vecteur. Ces méthodes aideront à fournir des protocoles normalisés et simplifiés pour l’étude de ces agents pathogènes et de leurs stades du cycle de vie.