Une méthode pour tester l'effet des cotes environnementales sur le comportement d'accouplement dans Drosophila melanogaster

L’objectif global de cet essai comportemental est de quantifier l’effet des files d’attente environnementales sur les comportements reproductifs, tels que la parade nuptiale et l’accouplement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie comportementale et de l’eurogénétique. Comme l’inférence de facteurs génétiques et environnementaux sur les comportements reproductifs et les mécanismes qui modèrent ces comportements.

Cette technique offre rapidité et souplesse pour tester un large éventail de files d’attente environnementales qui affectent la reproduction. Et cela avec un très bon nombre de réplites. Jenke Gorter, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Commencez l’expérience en préparant un litre de milieu anti-mouches riche. Versez un litre d’eau du robinet dans un bécher en verre de deux litres avec barre d’agitation magnétique. Et placez le bécher sur une plaque chauffante magnétique.

Gardez le mélange éteint et augmentez le feu jusqu’à 300 degrés Celsius, jusqu’à ce que la température d’ébullition soit atteinte. Allumez le mélange à 500 tr/min et ajoutez les ingrédients à l’eau bouillante. Attendez que la levure mousse vigoureusement.

Baissez ensuite la température de la plaque chauffante à 120 degrés Celsius. Après 10 minutes, baissez la plaque chauffante à 30 degrés Celsius. Et laissez le mélange remuer jusqu’à ce qu’il refroidisse à 48 degrés Celsius.

Surveillez la température en insérant un thermomètre directement dans les aliments. Dissoudre deux grammes de Tegosept dans 10 millilitres d’éthanol à 96 %. Mélangez le mélange et cinq millilitres d’acide propionique molaire dans le bécher.

Remuez pendant trois minutes. Chauffer une aiguille jusqu’à ce qu’elle soit rouge dans un bec Bunsen. Et percez un trou de 0,3 centimètre de diamètre sur la face supérieure d’une boîte de Pétri en plastique de 3,5 centimètres sur 1,0 centimètre.

Lors de la préparation d’un milieu alimentaire, avec des composés odorants, pipetez d’abord 30 microlitres du composé souhaité dans le plat pour 1/2 des plats expérimentaux. Laissez l’autre 1/2 de la vaisselle vide à titre de comparaison. À l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, versez trois millilitres de milieu alimentaire, en couvrant le fond du plat.

Couvrez-le d’une étamine pour éviter toute contamination et laissez le milieu se solidifier pendant une heure, à température ambiante. Ensuite, placez un couvercle sur la vaisselle et fermez les couvercles avec du ruban adhésif des deux côtés. Préparez de petits bouchons de film de paraffine pour couvrir les trous de la vaisselle en roulant des morceaux de film de paraffine en rouleaux de deux centimètres d’épaisseur.

Et puis coupez-les en segments de cinq centimètres point zéro. Découpez deux petits trous dans le septum pour qu’ils s’adaptent parfaitement aux raccords de cloison barbelés. Ajustez les bouchons de bouteilles ouverts à quatre points cinq centimètres avec un septum en silcone de trois points de deux centimètres d’épaisseur.

Fixez le petit tube en PVC aux deux sorties qui sortent de la bouteille et à une seule des entrées entrant dans la bouteille. Ensuite, fixez un tube de verre à la sortie de chaque bouteille de culture YPD, à l’aide de petits tubes. Remplissez le tube de fibre de verre.

Et autoclavez-le avant utilisation. Enveloppez les capuchons et les tubes ajustés dans du papier d’aluminium. Et autoclavez-les pendant 25 minutes à 120 degrés Celsius et une pression d’une barre.

Trempez une pointe de pipette stérile de 100 microlitres dans l’une des colonies de levures à partir de la plaque de gélose YPD et déposez-la dans le flacon de milieu liquide YPD autoclave. Boucher cette bouteille de milieu liquide YPD avec levure et oculation, ainsi qu’une bouteille de contrôle de milieu YPD, sans levure, avec des bouchons autoclavés, montée dans une sortie. Pour éviter la contamination du milieu YPD par des micro-organismes, fixez le petit tube à un filtre de seringue stérile de cinq micromètres à point zéro, avec une pression en plastique sur le connecteur du tube de la cloison, en allant vers le filtre.

Et une vis sur le connecteur de cloison en plastique sortant du filtre. Fixez ensuite le tube à l’entrée de la bouteille de culture YPD. Placez les bouteilles sur des plaques magnétiques séparées.

Et remuez la solution à 100 tr/min, à température ambiante, pendant 24 heures avant le début de l’expérience. Connectez les entrées des deux bouteilles à un tube relié à de l’air sous pression. Assurez-vous de connecter la sortie de la bouteille de levure expérimentale à un tube évacuant l’odeur de levure hors de la salle d’expérience, afin d’éviter toute interférence avec l’expérience.

Fixez le tube en PVC du côté de la sortie du tube de verre et dirigez-le vers les trous inférieurs de la boîte d’expérience. À l’aide d’un séparateur en T d’un diamètre extérieur supérieur ou égal à cinq centimètres et de petits morceaux de petits tubes en PVC, fixez deux pipettes sérologiques à chacune des deux sorties des deux côtés. Collez les pipettes à plat sur la feuille de papier blanc sous les appareils photo, dans la boîte en acier.

À l’aide d’une pipette buccale, placez une femelle expérimentale dans une petite boîte de Pétri à ZT six. Et laissez la mouche s’acclimater à l’arène d’accouplement pendant une heure. Au bout d’une heure, à ZT sept, transférez un mâle de type sauvage dans la boîte de Pétri.

Cliquez ensuite sur Démarrer la surveillance pendant 24 heures. Pour l’expérience de la pompe à air, placez le plat de manière à ce qu’une sortie de pipette soit reliée au trou d’entrée de l’arène d’accouplement. Pour analyser le comportement d’accouplement du couple, sélectionnez et ouvrez toutes les images, dans un logiciel de visualisation d’images.

Et feuilletez-les dans l’ordre chronologique. Notez la date, le numéro de l’expérience, le numéro du plat et l’heure de début dans une feuille de calcul à l’intérieur de la même rangée. Prenez l’heure de début de chaque arène à partir du moment où elle est placée sous la caméra de la webcam.

Enregistrez l’horodatage des images. Marquez l’heure de début de chaque copulation dans la même rangée, dans la feuille de calcul. Comptez un accouplement comme un incident, lorsque le mâle est monté sur la femelle et que le couple reste modérément immobile et dans la même posture, pendant au moins cinq images consécutives.

L’analyse de l’air de levure, séparé pour le milieu alimentaire, montre qu’un couple d’accouplement ne répond pas aux odeurs de levure lorsqu’il n’y a pas de levure présente dans le milieu alimentaire. Mais ils augmentent leur fréquence d’accouplement dans l’air de la levure lorsque la levure est également ajoutée au milieu alimentaire. La réceptivité féminine augmente dès la présence d’acide acétique.

Mais seulement lorsque la peptone est présente dans le milieu, démontrant que les mouches ont besoin de détecter simultanément les acides aminés et l’acide acétique, pour augmenter leur fréquence d’accouplement. Une fois maîtrisée, cette technique peut être mise en place en six heures. Et l’analyse comportementale peut être effectuée en cinq heures, si elle est faite correctement.