Rappel des circuits neuronaux: une nouvelle méthode pour une extension rapide des neurones et une connexion neuronale fonctionnelle

L’objectif global de cette procédure est d’initier de nouveaux neurites, de les étendre rapidement et de les connecter précisément aux cellules cibles. Cette procédure n’est possible qu’en utilisant des cellules cultivées dans un environnement contrôlé et reproductible. Cette méthode nous permet de répondre à des questions clés en neurosciences.

Qu’est-ce qui limite le taux de croissance des neurones ? À quelle vitesse peuvent-ils croître ? Les indices mécaniques jouent-ils un rôle ?

On peut aussi étudier comment se forment les synapses, comment les neurones trouvent-ils une cellule cible ? Comment les synapses vieillissent-elles, mûrissent-elles ? Et troisièmement, nous pouvons commencer à construire systématiquement des réseaux neuronaux, étudier comment les neurones calculent.

Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle permet une manipulation facile, une reproductibilité expérimentale et, en fin de compte, un haut degré de contrôle au niveau de la cellule unique. Pour commencer cette procédure, nettoyez et préparez le nombre souhaité de feuilles de couverture stériles. Ensuite, enduire chaque lamelle de 0,5 à 1 millilitre de 100 microgrammes par millilitre de PDL pendant au moins deux heures à température ambiante.

Après cela, lavez les lamelles de couverture deux fois avec de l’eau et retirez tout le liquide. Laissez-les sécher dans un environnement stérile pendant 5 à 10 minutes ou jusqu’à ce que la surface soit complètement sèche. Ensuite, placez les dispositifs microfluidiques avec les motifs vers le haut sous la lumière UV dans une enceinte de biosécurité pendant 10 minutes.

Après 10 minutes, placez un dispositif microfluidique avec le motif vers le bas en contact avec la lamelle propre. Utilisez la pince à épiler pour appuyer doucement sur l’appareil afin qu’il adhère au verre. Pour remplir le dispositif à population unique avec du milieu, ajoutez 50 microlitres de milieu cellulaire complet dans le puits supérieur droit.

Et puis ajoutez encore 50 microlitres de milieu cellulaire complet à la diagonale du puits. Pour remplir l’appareil à populations multiples avec du milieu, ajoutez 30 microlitres de NBM complet à une rangée de puits. Assurez-vous que le fluide s’écoule entre les puits.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de fluide dans chacun des puits restants. Placez les dispositifs dans une assiette plus grande avec un plat ouvert d’eau autoclavée, et placez le plat dans l’incubateur pendant une à deux heures pendant la préparation de la culture cellulaire. Maintenant, retirez le milieu des puits supérieurs des dispositifs microfluidiques sans vider les puits.

Ensuite, ajoutez 20 microlitres de la solution cellulaire concentrée dans le puits supérieur droit du dispositif microfluidique, et vérifiez au microscope comment les cellules circulent à l’intérieur du dispositif microfluidique à population unique. Pour plaquer les cellules dans le dispositif à populations multiples, ajoutez 20 microlitres de la solution cellulaire concentrée dans chacun des puits supérieurs. Au microscope, vérifiez si les cellules se trouvent à l’intérieur des chambres.

Ensuite, placez les appareils dans l’incubateur pendant 15 à 30 minutes pour favoriser la fixation des cellules au substrat. Une fois que les cellules se sont fixées au substrat, ajoutez 40 microlitres de NBM dans les deux puits supérieurs du dispositif de population unique. Cela aidera à éliminer les bulles d’air des micro-canaux.

Ajoutez 20 microlitres de MBM dans les puits supérieurs du dispositif à populations multiples, les mêmes puits où les cellules ont été injectées. Le milieu doit dépasser légèrement pour former un ménisque positif et donner aux puits un aspect de muffin. Un à deux jours avant le retrait du dispositif microfluidique, ajoutez deux millilitres de NBM préchauffé dans chaque plat d’échantillon et inondez les chambres.

Ensuite, conservez les appareils dans l’incubateur. Par la suite, utilisez une pince à épiler stérile et une pointe de pipette pour retirer les dispositifs microfluidiques des lamelles de recouvrement, laissant une configuration à motifs de neurones. Dans cette procédure, et 40 à 60 microlitres des billes enrobées PDL préparées à la culture cellulaire.

Ensuite, retournez l’échantillon dans l’incubateur pendant une heure pour favoriser la formation de contacts synaptiques. Par la suite, installez l’échantillon dans un dispositif expérimental de sorte que les cellules puissent être évaluées d’en haut par deux micropipettes, et qu’elles soient également accessibles optiquement. Dans cette configuration, une caméra CCD est située sur le port latéral du microscope pour la capture d’images.

Connectez chaque pipette remplie de solution saline à une seringue d’un millilitre, puis perfuser l’échantillon avec une solution saline physiologique. Ensuite, au microscope, vérifiez l’écart entre les deux populations neuronales isolées pour vous assurer que les deux populations ne sont pas naturellement connectées. Sélectionnez une perle PDL qui n’est pas attachée au neurone dans le champ de vision.

Alignez la perle à l’aide d’une pointe de micropipette en vous concentrant sur la perle puis sur la micropipette. Par la suite, rapprochez la pointe le plus possible de la perle en la surveillant au microscope. Ensuite, appliquez une pression négative sur la pipette pour ramasser la perle et maintenez la pression négative tout au long de l’expérience.

Maintenant, sélectionnez une perle PDL attachée à un neurone dans le champ de vision et fixez-la à la deuxième micropipette à l’aide de l’aspiration. Tirez le complexe de neurones à billes PDL en déplaçant lentement le micromanipulateur ou l’étage d’échantillonnage à 0,5 micromètre par minute pour 1 micromètre, et faites une pause de cinq minutes pour permettre l’initiation des neurites. Tirez le complexe neuronal de billes PDL en le déplaçant lentement latéralement à 0,5 micromètre par minute sur deux micromètres, puis faites une pause de cinq minutes pour permettre l’élongation des neurites.

Après une initiation réussie et une extension du neurite pour les cinq premiers micromètres, tirez continuellement le neurite à 20 micromètres par minute. Pour connecter les neurones, sélectionnez une région riche en neurites. Utilisez d’autres billes pour mesurer la hauteur de la pointe de la pipette au-dessus de la lamelle et abaissez le complexe de neurites de perles PDL afin qu’il entre physiquement en contact avec les neurites.

Laissez le complexe de neurites de billes PDL en contact avec le neurite cible tout en manipulant la deuxième micropipette. Ensuite, abaissez la deuxième pipette avec la deuxième perle PDL sur le neurite nouvellement formé à environ 20 micromètres de la première perle, et utilisez la deuxième perle PDL pour pousser le nouveau filament de neurite vers la cellule cible. Ensuite, maintenez les deux perles en place pendant au moins une heure.

Vérifier l’absence de gonflement focal, d’épaississement des neurites en contact avec la bille, au microscope. Pendant ce temps, changez lentement le milieu de l’échantillon d’une solution saline physiologique à un NBM équilibré en dioxyde de carbone préchauffé. Libérez la perle de la deuxième pipette en relâchant l’aspiration.

Si la nouvelle neurite reste attachée, libérez également la première bille. Ensuite, replacez soigneusement l’échantillon dans l’incubateur afin de renforcer la connexion neuronale pour les expériences futures. Vous pouvez utiliser des enregistrements de patch-clamp de cellules entières pour étudier la fonctionnalité électrique de la connexion micromanipulée.

On voit ici les populations neuronales isolées séparées par un espace de 100 micromètres dans les microdispositifs PDMS. Des enregistrements de paires à patchs clamps ont été effectués dans une configuration de cellules entières, et les connexions induites mécaniquement ont été analysées et comparées à celles de populations neuronales naturellement connectées et de populations non connectées. Les réponses électriques après le potentiel d’action pré-synaptique enregistré à partir des neurones connectés naturellement et par micromanipulation sont significativement plus élevées et temporairement corrélées avec l’activité pré-synaptique.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit heures si elle est effectuée correctement, et lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’avoir des cultures cellulaires à long terme saines et bien structurées pour garantir des résultats rapides et reproductibles. En suivant cette procédure, différentes méthodes peuvent être utilisées pour vérifier la fonctionnalité électrique de la connexion micromanipulée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire croître des populations cellulaires dans des chambres microfluidiques et d’utiliser des manipulations de pipettes pour initier, étendre et connecter des neurites.