Enregistrements de puces et de cellules entières de cellules épithéliales primaires isolées de l'épididyme

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules épithéliales de l’épididyme du rat et de mesurer les propriétés électriques de ces cellules principalement dissociées à l’aide de la méthode du patch-clamp de cellules entières. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de la reproduction, telles que la fonction de l’épididyme, qui est importante pour la maturation des spermatozoïdes et l’hérédité des traits paternels. Cette technique permet à l’utilisateur de cautériser les propriétés électriques de cellules épithéliales épididymales isolées afin que la fonction physiologique inconnue de ces cellules puisse ensuite être illustrée.

La démonstration de la procédure sera faite par Bao Li Zhang, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour commencer la procédure, désinfectez les outils de dissection par immersion dans de l’éthanol à 70 %. Ensuite, laissez-les sécher à l’air libre.

Ensuite, préparez l’IMDM complet. Ensuite, créez 50 ml d’aliquotes dans des conditions aseptiques, scellez avec du Parafilm et conservez-les à quatre degrés Celsius. Ensuite, préparez une solution de digestion d’enzymes de collagène en dissolvant la collagénase de type I et la collagénase de type II dans RPMI, ce qui donne un milligramme par millilitre de chaque collagénase dans la solution.

Filtrez la solution à travers une membrane de 0,22 micromètre. Ensuite, marquez-le comme solution de collagénase et conservez la solution à température ambiante jusqu’à ce qu’elle soit utilisée. Ensuite, ajustez le volume de la solution enzymatique en fonction du poids de l’enzyme.

Le volume minimum requis pour les deux queues de l’épididyme d’un seul rat est de deux millilitres. Pour disséquer les épididymes de la queue du rat, sacrifiez l’animal soit en utilisant du pentobarbital sodique par injection IP, soit en utilisant une chambre d’isoflurane jusqu’à ce que l’animal ne réponde plus à la stimulation par pincement de la queue, suivie d’une luxation cervicale. Ensuite, désinfectez le bas-ventre en l’essuyant avec de l’éthanol à 70 %.

Poussez doucement les deux testicules vers le bas-ventre, puis ouvrez le bas-ventre près du scrotum. Par la suite, retirez la graisse de l’épididyme et disséquez tous les organes reproducteurs. Ensuite, transférez-les dans le plat avec RPMI.

Dans un poste de travail propre et à flux d’air contrôlé, disséquez les épididymes caudales des tissus conjonctifs et adipeux et de la capsule épididymaire. Placez un épididyme avec 0,2 millilitre de solution de collagénase dans un tube de 1,5 millilitre. Pour dissocier les cellules uniques de la queue de l’épididyme, coupez les épididymes dans la solution de collagénase à l’aide de ciseaux fins jusqu’à ce que le tissu devienne un liquide pâteux.

Ensuite, rincez doucement les ciseaux avec le reste de la solution enzymatique dans le tube. Ensuite, placez le tube sur un thermo-mélangeur en métal pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius avec une vitesse d’agitation de 1 000 tr/min. Ensuite, centrifugez le mélange de tissus enzymatiques à température ambiante pendant trois minutes.

Après cela, décantez le surnageant collant qui contient principalement les spermatozoïdes. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans un millilitre d’IMDM complet pour éteindre toute l’activité enzymatique. Par la suite, transférez la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres contenant 49 millilitres de RPMI.

Centrifuger le mélange cellulaire et décanter le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans un millilitre d’IMDM complet avec une trituration douce pendant au moins cinq minutes pour dissocier les cellules individuelles du mélange de tissus épididymaires traités par enzymatique. Séparez les cellules épithéliales des autres cellules dans des conditions aseptiques et cultivez la suspension cellulaire sur une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant de l’IMDM complet pendant au moins huit heures ou toute la nuit dans un incubateur à 32 degrés Celsius.

Le lendemain matin, préparez les lamelles stériles par immersion dans de l’alcool à 100 %. Faites-les sécher à l’air libre puis trempez-les dans une petite quantité de milieu de culture. Ensuite, placez les lamelles de recouvrement dans des plats de culture de six centimètres ou dans des puits simples d’une plaque de 24 puits.

Maintenant, récoltez les cellules épithéliales dissociées en recueillant doucement la suspension cellulaire de la boîte de Pétri qui se compose principalement de cellules épithéliales. Centrifugez la suspension cellulaire à 30 fois G à température ambiante pendant cinq minutes, puis décantez le surnageant. Ensuite, remettez en suspension la pastille de cellule dans deux millilitres d’IMDM complet.

Semez 0,2 millilitre de la suspension cellulaire récoltée au centre de chaque lamelle stérile. Laissez la suspension cellulaire se déposer dans la gouttelette de liquide pendant au moins 10 minutes pour permettre aux cellules d’adhérer lâchement aux lamelles du couvercle en verre. Ensuite, ajoutez soigneusement un millilitre d’IMDM complet au bord d’une boîte de six centimètres ou 0,3 millilitre d’IMDM complet à chaque puits d’une plaque de 24 puits, sans déranger les cellules.

Conservez les cellules isolées sur des lamelles dans l’incubateur à 32 degrés Celsius jusqu’aux expériences de patch-clamp. Le jour de l’expérience du patch-clamp, décongelez une aliquote de solution intracellulaire sur de la glace et maintenez-la réfrigérée pendant l’expérience du patch-clamp pour éviter la dégradation. Ensuite, transférez les cellules épithéliales de culture sur la lamelle en verre dans la chambre d’enregistrement remplie de PSS standard à température ambiante.

Changez soigneusement le PSS de bain au moins deux fois à l’aide d’une pipette avant toute expérience de patch-clamp. Pour établir la configuration de l’ensemble de la cellule, plongez la pipette dans la solution du bain à la vitesse la plus élevée du micromanipulateur. Trouvez la pointe de la pipette sur l’écran connecté à l’appareil photo numérique.

Ensuite, ralentissez la vitesse du micromanipulateur en mode moyen-élevé. Vérifiez rapidement la résistance de la micropipette à l’aide de la commande d’interface d’acquisition de données en appliquant un pas de tension généré par l’amplificateur contrôlé par ordinateur. Passez à une nouvelle micropipette si la résistance est nettement en dehors de cette plage.

Et réglez le potentiel de jonction liquide entre la pipette et la solution de bain à zéro à l’aide de la commande de décalage de la pipette dans l’interface de commande du logiciel. Surveillez la résistance avec le test de membrane. Si la résistance est supérieure à 500 mégaohms, mais inférieure à un gigaohm, appliquez un potentiel négatif pour aider à former le gigaseal.

Pendant ce temps, compensez le courant capacitif transitoire de la micropipette. À ce moment, appliquez une étape d’hyperpolarisation de 10 millivolts à partir d’un potentiel de maintien de zéro millivolts pour la détermination de la résistance du joint. Immédiatement après avoir obtenu une configuration réussie de cellules entières, appliquez une étape d’hyperpolarisation de 10 millivolts à partir d’un potentiel de maintien de moins 60 millivolts.

Basculez le mode tension sur le mode courant zéro et effectuez un enregistrement sans espace de 10 secondes pour mesurer le potentiel de membrane au repos de la cellule. Ensuite, revenez rapidement en mode tension et restez dans celui-ci. Appliquez les protocoles de tension en fonction des expériences prévues et mesurez les réponses de courant.

Voici les exemples de cellules épithéliales isolées de la queue de l’épididyme du rat avant et après la récolte de la culture de nuit sur la boîte avant les expériences de patch-clamp. Cette figure montre les courants typiques de cellules entières enregistrés à partir de cellules épithéliales épididymateuses uniques à l’aide d’un protocole d’incitation par impulsions. La ligne pointillée indiquait les niveaux de courant zéro.

Voici la relation courant-tension des réponses de courant mesurées aux points temporels indiqués. Il s’agit des tracés représentatifs du potentiel membranaire au repos des cellules principales dialysées avec une solution de pipette, soit avec de l’ATP, soit sans ATP. Et ce graphique à barres ne montre aucune différence significative entre le potentiel initial de la membrane au repos de plus ATP et moins ATP.

Les chiffres entre parenthèses à l’intérieur des barres indiquent le nombre de cellules testées provenant d’au moins trois animaux. Et voici les analyses de corrélation de la résistance d’étanchéité et de la résistance d’entrée de toutes les cellules, ou des cellules principales uniquement par rapport aux potentiels de repos mesurés à la pince de courant zéro peu de temps après l’établissement de la cellule entière et les amplitudes de courant mesurées à l’étape d’hyperpolarisation à moins 100 millivolts du potentiel de maintien. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en neuf heures si elle est exécutée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’arrêter immédiatement la digestion enzymatique pendant les étapes d’isolement cellulaire. Sinon, une surdigestion peut se produire, ce qui peut entraîner une formation difficile du joint gigaohm et l’échec des expériences de patch-clamp. Pour maintenir la santé de la culture, il est important de faire tourner le mélange de cellules dissociées enzymatiquement à basse vitesse de 30 G pendant deux à trois minutes, puis de décanter le surnageant collant qui contient principalement des spermatozoïdes.

Suite à ces procédures, d’autres méthodes telles que l’imagerie de cellules vivantes et une culture unicellulaire peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que le potentiel de membrane au repos dans les cellules épithéliales naïves pourrait réguler le comportement extracellulaire dans des conditions contrôlées. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie de la reproduction pour explorer les propriétés électrophysiologiques des cellules épithéliales de l’épididyme pour la régulation de la maturation des spermatozoïdes et de l’hérédité des caractères acquis par le père. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules épithéliales de l’épididyme de rat et de la façon de mesurer les propriétés électriques de ces cellules à l’aide de la méthode du patch-clamp de cellules entières.